伪石蒜碱抑制活化T细胞增殖与功能的机制研究

目的 探究伪石蒜碱抑制活化T细胞增殖与功能的机制。 方法 密度梯度离心法和免疫磁珠法分离纯化T细胞,抗CD3/CD28或PHA活化T细胞。流式细胞术检测细胞增殖、细胞凋亡、CD25表达及细胞周期;ELISE检测细胞因子IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ的分泌水平。 结果 伪石蒜碱抑制抗CD3/CD28或PHA活化T细胞增殖,IC50分别为0.97±0.22 μmol?L-1和0.82±0.07 μmol?L-1。在完全抑制活化T细胞增殖的浓度下,伪石蒜碱不诱导活化T细胞凋亡,且不对静息T细胞的细胞活力产生显著影响。伪石蒜碱不影响活化T细胞表达CD25和分泌IL-2,但阻滞细胞周期于G0/G1期。伪石蒜碱显著抑制IL-6、IL-17A、IFN-γ的分泌。结论 伪石蒜碱不影响T细胞的活化,但通过阻滞细胞周期于G0/G1期抑制活化T细胞的增殖,提示伪石蒜碱有望成为先导化合物用于开发新型免疫抑制剂。     

雷帕霉素对小鼠脾淋巴细胞走后门殖及产生细胞因子的影响

目的：研究雷帕霉素（RAPA）对ConA、PHA、LPS诱导的小鼠脾细胞增殖反应,混合淋巴细胞反应,脾T淋巴细胞亚型及细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α含量的影响。方法：MTT法测定淋巴细胞增殖实验、混合淋巴细胞反应,流式细胞法测定脾T淋巴细胞亚型,结晶紫染色法测定TNF-α,E-LASI法测定IL-2,IFN-γ。结果：RAPA可显著抑制ConA、PHA和LPS诱导的小鼠脾细胞增殖和混合淋巴细胞反应（MLR）,对小鼠脾T淋巴细胞亚型无明显影响。RAPA还可明显抑制小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2,IFN-γ,但对小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α无效。结论：RAPA抑制小鼠免疫功能的作用机制与CsA不同。     

IFN-γ、IL-12对B7-1转染肝癌细胞诱导T淋巴细胞活化的影响

目的探讨B7—1基因转染肝癌细胞与IFN-γ、IL-12联合在体外诱导T细胞活化的能力。方法酶联免疫吸附反应(ELISA)检测联合诱导瘤苗刺激淋巴细胞IFN-γ、IL-12蛋白合成及细胞表面CD4、CD8、CD25的表达。MTT法检测瘤苗对淋巴细胞增殖作用的影响。结果HepG2／B7—1细胞诱导淋巴细胞表达IL-2、IFN-γ,其蛋白质含分别为875pg／ml和1246pg／ml;而联合IL-12、IFN-γ后能进一步诱导IL-2、IFN-γ的蛋白质合成,较各自无细胞因子组明显提高(P＜0．05)。细胞表面CD4、CD8、CD25的表达显著增加。两者联合促进了淋巴细胞的增殖,在E／T=10：1时,较HepG2组明显增大。结论IL-12、IFN-γ增强经B7—1基因转染的肝癌细胞(HepG2／B7—1)诱导淋巴细胞产生IL-2、IFN-γ的能力;IL-12、IFN-γ可能通过调节B7—1分子的生物学活性影响其对T细胞的活化。     

基于迟发型超敏反应及Th细胞因子分泌的玉屏风散不同分离部分筛选

摘要目的：以典型的迟发型超敏反应模型小鼠变应性接触性皮炎及脾淋巴细胞IFN-γ、IL-4的分泌,筛选玉屏风散抑制迟发型超敏反应的效应部分。方法：用二硝基氯苯来诱导小鼠变应性接触性皮炎,观察玉屏风散不同分离部分的干预作用;用MTF法检测玉屏风散不同分离部分对小鼠脾脏T淋巴细胞活化增殖的影响;采用ELISA法检测IFN-γ、IL-4的水平。结果：玉屏风散的醇提浓缩液能减轻小鼠耳廓的肿胀程度、显著抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖及IFN-γ、IL-4的分泌;乙酸乙酯萃取物能减轻小鼠耳廓的肿胀程度,显著抑制C0nA诱导的IFN-γ分泌,促进IL-4分泌;石油醚萃取物能抑制ConA诱导的IFN-γ、IL-4的分泌,整体模型未显示作用。三种提取物都不同程度地降低IFN-γ／IL-4比值,抑制Th1反应。结论：玉屏风散中抗迟发型超敏反应的效应成分主要在醇提液和乙酸乙酯部分,其作用与调节Th1／Th2的平衡有关;同时也提示以散剂为应用剂型是合理的。     

来氟米特对系统性红斑狼疮T淋巴细胞的免疫调节作用

目的探讨来氟米特(LEF)在体外对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血T淋巴细胞的免疫调节作用。方法在植物血凝素(PHA)刺激下,SLE患者外周血T淋巴细胞与不同浓度的LEF5、15、45μg/ml共培养。检测各组T淋巴细胞的增殖、凋亡情况,分析各组T淋巴细胞免疫表型CD152、CD28的表达以及各组T淋巴细胞的干扰素(IFN)γ、白细胞介素(IL)10、转化生长因子(TGF)β1 mRNA水平。结果在体外,LEF对由PHA诱导的SLE患者T淋巴细胞的增殖、凋亡均有抑制作用,且抑制作用与LEF呈剂量依赖性。LEF对T淋巴细胞CD152、CD28的表达无明显影响。LEF促进IL-10、TGF-β1 mRNA的表达,抑制IFN-γ mRNA的表达。结论 LEF可能通过减少T淋巴细胞凋亡、促进T淋巴细胞分泌IL-10、TGF-β1以及减少T淋巴细胞分泌IFN-γ来下调SLE的免疫反应。     

咖啡酸苯乙酯对小鼠CD3~+T细胞体外活化和增殖的影响

目的研究咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)对小鼠CD3+T淋巴细胞活化及增殖的影响,探讨其作用机制。方法无菌分离小鼠淋巴结淋巴细胞,制备淋巴细胞悬液。在淋巴细胞活化实验中,分别与不同浓度的咖啡酸苯乙酯预先孵育2h后,加入促分裂原伴刀豆蛋白A(ConA),运用荧光抗体染色技术结合流式细胞术,8h后,检测T淋巴细胞早期活化标记分子CD69的表达情况;24h后,检测T淋巴细胞中期活化标记分子CD25的表达情况;在淋巴细胞增殖试验中,运用CFDA-SE标记法检测T淋巴细胞刺激48h后的增殖情况。结果CAPE(0·5、1、5、10mg·L-1)能够明显地抑制ConA刺激的小鼠淋巴细胞活化,且呈浓度依赖性;CAPE(0·5、1、5、10mg·L-1)能够明显地抑制ConA刺激的小鼠淋巴细胞增殖,且呈浓度依赖性。结论CAPE对小鼠CD3+T淋巴细胞的体外活化和增殖具有抑制作用,其作用机制可能通过同时抑制PLC-γ信号途径和MAP激酶途径,由此推理CAPE是一种潜在的有效的免疫抑制剂。     

玉屏风多糖对佐剂性关节炎大鼠T细胞亚群的影响

目的观察玉屏风多糖(Yupingfeng Polysaccharide,YPF-P)对佐剂性关节炎大鼠T细胞亚群的影响。方法采用弗氏完全佐剂(FCA)诱导大鼠AA模型。足容积法测量继发侧足肿胀度;MTT法检测刀豆蛋白(ConA)诱导的外周血淋巴细胞增殖反应;流式细胞仪检测大鼠外周血中CD4+和CD8+T细胞的变化;ELISA法检测大鼠外周血中干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)含量;放免法检测大鼠外周血中IL-4含量;RT-PCR法检测淋巴细胞IFN-γmRNA的表达。结果80、160mg.kg-1YPF-P给药能明显减轻关节肿胀度,不同程度地改善AA大鼠低下的外周血淋巴细胞增殖反应,明显降低CD4+/CD8+的相对比值。此外,80、160mg.kg-1YPF-P给药也能明显降低外周血IFN-γ含量和轻度提高IL-4含量,并能抑制IFN-γmRNA的表达。结论YPF-P能改善模型大鼠外周血T细胞亚群,纠正佐剂性关节炎模型大鼠Th1/Th2平衡的Th1偏移,这可能是减轻足肿胀的原因之一。     

雷公藤甲素对类风湿性关节炎患者外周血T细胞的免疫抑制作用

目的:研究雷公藤甲素对类风湿性关节炎(RA)患者外周血T细胞免疫功能的抑制作用。方法:在RA患者外周血T细胞中加入T细胞多克隆刺激剂(0.2μg/ml)以活化淋巴细胞并分泌细胞因子。实验分为空白对照(常规培养液)组、抗人CD3抗体(anti-CD3)刺激(0.2μg/ml)组、雷公藤甲素(anti-CD3 0.2μg/ml+雷公藤甲素1 mmol/ml)组。采用密度梯度离心法分离RA患者的外周血单核细胞(PBMCs),加入雷公藤甲素,以酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞γ干扰素(IFN-γ)含量,流式细胞仪检测分泌IFN-γ、白细胞介素(IL)-2、IL-4与T细胞活化分子CD69和CD25的CD4+、CD8+T细胞百分比。结果:与anti-CD3刺激组比较,雷公藤甲素组PBMCs中IFN-γ含量减少,分泌IFN-γ、IL-2、IL-4的CD4+、CD8+T细胞百分比降低,分泌CD69和CD25的CD4+、CD8+T细胞百分比降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:雷公藤甲素可能通过抑制T细胞活化和细胞因子分泌来发挥免疫抑制作用,从而发挥对RA的临床治疗作用。     

红车轴草提取物对小鼠淋巴细胞活化与增殖及巨噬细胞分泌NO的影响

探讨红车轴草提取物(RCE)在体外对小鼠T淋巴细胞和巨噬细胞的影响。MTT法检测RCE对细胞的毒性作用。荧光抗体染色结合流式细胞术检测RCE对T淋巴细胞在Con A的刺激下表达活化抗原CD69、CD25、CD71的影响。CFDA-SE标记技术结合流式细胞术分析RCE对T淋巴细胞在Con A诱导下增殖情况的影响。Griess法检测RCE对小鼠巨噬细胞在LPS刺激24 h后分泌NO的影响。RCE对小鼠有潜在的抗炎作用。RCE对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞的细胞毒作用很小。不同质量浓度的RCE能够很好的抑制过量的炎症相关信号分子表达，如NO, CD69, CD25, CD71，且呈剂量依赖性。RCE能够抑制T淋巴细胞的增殖。数据显示RCE可能通过对小鼠淋巴细胞活化与增殖及巨噬细胞NO分泌的抑制展示其抗炎效应。     

玉郎伞多糖对体外BALB/C小鼠淋巴细胞和巨噬细胞分泌细胞因子的影响

目的:探讨玉郎伞多糖（YLSPS）体外对BALB/C小鼠淋巴细胞、巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、γ-干扰素（IFN-γ）及白细胞介素-2（IL-2）的影响及作用机制。方法:分离BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞,分为空白对照组、LPS或ConA对照组和各浓度YLSPS组(50,100,200 mg·L^-1),MTT法检测脾淋巴细胞增殖,ELISA法检测细胞培养液中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-2的浓度,RT-PCR法检测TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-2 mRNA的表达。结果:各浓度YLSPS组能剂量依赖性地促进BALB/C小鼠脾淋巴细胞增殖和TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-2的分泌,显著增强这些细胞因子的mRNA的表达（P<0.01或P<0.05）。结论:YLSPS体外能促进BALB/C小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-6,其作用机制可能与上调上述细胞因子mRNA表达有关。     

氯通道阻滞剂抑制人肾小球系膜细胞增殖

目的研究氯通道阻滞剂对肾小球系膜细胞增殖的作用。方法细胞计数和3H-TdR参入量测定确定细胞增殖,应用流式细胞术检测细胞周期时相。结果同对照组相比,氯通道阻滞剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸5-nitro-(3-phenylpropylamino)-benzoicacid,NPPB、尼氟灭酸使人肾小球系膜细胞数和3H-TdR参入量明显减少(P<0·01,n=8),并呈剂量依赖关系,但不增加系膜细胞乳酸脱氢酶释放量(P>0·05,n=8)。NPPB和尼氟灭酸均使细胞周期停滞在G0/G1期(n=3)。结论氯通道阻滞剂NPPB、尼氟灭酸对人肾小球系膜细胞增殖具有抑制作用。     

硫化氢下调大鼠主动脉L-精氨酸/一氧化氮合酶/一氧化氮通路

目的观察H2S对血管L-精氨酸/一氧化氮(L-Arg/NO)通路的影响以探讨H2S和NO这两种气体信号分子间的相互作用。方法离体孵育大鼠主动脉薄片,加入H2S供体NaHS(10-7~10-4mol.L-1)孵育4 h,及50μmol.L-1NaHS分别孵育2、4和6 h。采用G re iss法测定血管亚硝酸盐含量;同位素示踪法检测血管组织一氧化氮合酶(NOS)活性及L-Arg转运,RT-PCR检测eNOS、CAT1基因表达。结果一次性给予50μmol.L-1NaHS,孵育2 h,孵育液中NO2-含量比对照组低62%,血管NOS活性下降48%,L-Arg转运减少50%(P<0.01);孵育6 h,NO2-含量比对照组低19%(P<0.05),而NOS活性和L-Arg转运已基本恢复(P>0.05)。NaHS(10-7~10-4mol.L-1),呈浓度依赖的抑制了L-Arg/NOS/NO通路,IC50分别为0.499、3.198及3.927μmol.L-1(P<0.01);而给予50μmol.L-1NaHS后,eNOS和CAT-1A的mRNA表达分别减少34.3%和55.1%(P<0.01)。结论H2S通过抑制血管组织L-Arg转运和NOS活性和基因表达,下调L-Arg/NOS/NO通路,从而减少血管NO生成。     

赤芍801对小鼠巨噬细胞COX-1和COX-2活性、mRNA及蛋白表达的影响

目的研究赤芍801(propyl gallate,PrG)对环氧酶(cy-c looxygenase,COX)活性、mRNA及蛋白表达的影响。方法采用基于小鼠腹腔巨噬细胞的COX-1和COX-2体外筛选模型,用钙离子导入剂(calc ium ionophore A23187)短时刺激小鼠腹腔巨噬细胞,测定培养上清液中的6酮--前列腺素F1α(6-keto-PGFlα)的量反映COX-1活性;用脂多糖(lipopolysac-charide,LPS)长时间刺激细胞,测定培养上清液中的前列腺素E2(PGE2)的量反映COX-2活性。半定量RT-PCR法检测PrG对LPS刺激的Raw小鼠巨噬细胞COX-1、COX-2 mRNA表达的影响。W estern b lot法检测PrG对LPS刺激的Raw小鼠巨噬细胞COX-1、COX-2蛋白表达的影响。结果PrG体外10,5μmol.L-1浓度下不影响6-keto-PGFαl生成(P>0.05),而在1,0.5,0.1,0.05μmol.L-1浓度下则诱导6-keto-PGF1α生成(P<0.01),并呈较好的剂量依赖性。PrG体外1,10μmol.L-1可抑制PGE2生成(P<0.05)。PrG不同浓度对LPS刺激的Raw小鼠巨噬细胞COX-1、COX-2 mR-NA表达无明显影响。PrG(100,10,1μmol.L-1)浓度下可抑制COX-2蛋白表达,但对COX-1蛋白表达无影响。结论在0.05~10μmol.L-1浓度范围内,PrG低浓度时促进6-keto-PGF1α生成,高浓度时抑制PGE2生成,提示其高浓度时抑制COX-2,低浓度时激活COX-1;不同浓度PrG对COX-1、COX-2 mRNA表达均无明显影响。PrG(1~100μmol.L-1)浓度下可抑制COX-2蛋白表达,但对COX-1蛋白表达无影响。     

双氯芬酸的抗增殖作用与细胞内环氧酶-2表达水平的关系

目的检测体外培养的人肝细胞癌HepG2、Hep3B细胞和正常肝细胞系L02、QSG7701细胞以及正常人皮肤成纤维细胞Fb环氧酶2(cyclooxygenase 2,COX 2)mRNA的表达,观察环氧酶抑制剂双氯芬酸(diclofenac)对上述细胞增殖的影响,以探讨双氯芬酸抗增殖作用与细胞内COX-2表达的关系。方法采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测各种细胞系COX 2 mRNA的表达水平,采用cell counting kit 8(CCK 8)细胞计数法测定药物作用72 h后的细胞增殖活性,绘制生长曲线。结果肝细胞癌HepG2、Hep3B细胞和正常肝细胞L02均高表达COX 2 mRNA,正常肝细胞QSG7701微弱表达COX 2 mRNA,正常人皮肤成纤维细胞Fb不表达COX 2 mRNA。双氯芬酸在10~200μmol.L-1内呈浓度依赖性地抑制HepG2、Hep3B和L02细胞的增殖,作用72 h的半数抑制浓度分别为76.41、35.21和87.44μmol.L-1。双氯芬酸对QSG7701的抑制作用较弱,半数抑制浓度为170.23μmol.L-1,对Fb细胞仅在浓度超过200μmol.L-1时才表现出细胞毒性。结论环氧酶抑制剂双氯芬酸特异性地抑制COX 2 mRNA高表达的肝细胞癌HepG2、Hep3B细胞和正常肝细胞L02的增殖,提示双氯芬酸通过COX 2途径起抗增殖作用。     

人参炔醇对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用及机制

目的观察人参炔醇(panaxynol,PNN)对大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMC)增殖的抑制作用及机制。方法由细胞计数、[3H]TdR参入试验确定细胞增殖率,采用分子探针Fura-3/AM及共聚焦显微镜检测胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i),RT-PCR方法观察线粒体转录因子1(m tTF1)mRNA的表达。结果PNN以浓度依赖方式抑制血清及PDGF-BB诱导的RASMC增殖和DNA合成;9μmol.L-1PNN预处理RASMC能抑制PDGF-BB引起的[Ca2+]i升高;PDGF-BB上调RASMC m tTF1 mRNA表达,该作用可被3、9μmol.L-1的PNN抑制。结论PNN具有抗RASMC增殖作用,该作用与降低[Ca2+]i和抑制m tTF1 mRNA表达有关。     

十二元环红霉素衍生物对T淋巴细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨十二元环红霉素衍生物(LY267108)对T淋巴细胞增殖和细胞周期的影响。方法用MTT法观察LY267108和红霉素对T淋巴细胞增殖的影响;用流式细胞仪经PI染色观察LY267108和红霉素对T淋巴细胞周期的影响。结果LY267108和红霉素抑制T淋巴细胞的增殖IC50值分别为(176.38±10.42)×10-6mol.L-1和(606.28±35.43)×10-6mol.L-1;在3.0~30.0 mg.L-1之间LY267108引起T淋巴细胞G2/M期周期阻滞;红霉素在30.0 mg.L-1和100.0 mg.L-1时出现凋亡峰。结论红霉素衍生物的抗炎活性可能与该类化合物对炎症细胞的影响有关。     

罗格列酮下调肺腺癌细胞血管内皮细胞生长因子的表达

目的探讨过氧化物酶增殖物活化受体γ(PPARγ)配体罗格列酮(RSG)对肺腺癌血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的调节作用,旨在进一步揭示PPARγ抑制肺腺癌血管生成的机制。方法体外培养人肺腺癌细胞株A549,给予不同浓度RSG作用24 h后,用免疫细胞化学检测VEGF蛋白的表达;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PPARγ、VEGF mRNA的表达。结果RT-PCR及免疫细胞化学结果显示A549细胞存在PPARγmRNA和蛋白的表达。RSG呈浓度依赖方式上调PPARγ的表达;1.25μmol.L-1RSG处理组VEGF mRNA表达明显下调,10μmol.L-1RSG下调作用最强,≥20μmol.L-1RSG下调作用减弱,100μmol.L-1RSG对VEGF mRNA表达下调与对照组比较无统计学意义;PPARγ阻断剂GW 9662明显减弱了RSG下调VEGF的作用(P<0.01或P<0.05,n=6)。结论PPARγ的活化可抑制肺腺肿瘤新生血管的生成,其机制可能是通过部分PPARγ途径下调VEGF的表达而实现的。提示PPARγ可能是肺腺癌血管生成治疗的1个新分子靶点。     

川芎嗪对大鼠背根神经节细胞P2X嘌呤受体介导反应的作用

目的探讨川芎嗪(tetram ethy1pyrazine,TMP)对嘌呤2X(P2X)受体介导反应的作用。方法在大鼠新鲜分离的背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元标本上应用全细胞膜片钳技术记录川芎嗪对P2X受体激动剂激活电流的影响。结果外加ATP(1~1 000μmol.L-1)可引起DRG神经元产生激活电流(n=102),ATP-激活电流(IATP)显示快失敏和慢失敏两种形式的内向电流。预加川芎嗪(0.1~10mmol.L-1)后,大部分(89.2%,91/102)受检细胞可观察到ATP(100μmol.L-1)-激活电流出现明显的抑制作用。川芎嗪(1 mmol.L-1)使α,-βm eATP(10μmol.L-1)-激活电流减小。预加川芎嗪(1 mmol.L-1)后ATP(1~1 000μmol.L-1)激活电流的剂量-效应曲线明显下移。预加川芎嗪(1 mmol.L-1)前后ATP(100μmol.L-1)的I-V曲线反转电位值不变,均接近0 mV。川芎嗪(1 mmol.L-1)可明显抑制被前列腺素E2(100μmol.L-1)或P物质(0.1μmol.L-1)增大的ATP激活电流。通过微电极胞内透析注入PKA抑制剂H89(10μmol.L-1)至胞内,使川芎嗪(1 mmol.L-1)抑制ATP(100μmol.L-1)激活电流的作用减小。结论川芎嗪可能是通过PKA系统以及P2X受体离子通道复合体细胞外环的变构调制点影响P2X受体激动剂在大鼠DRG神经元的激活电流。     

双氢青蒿素保护刀豆蛋白A诱导的小鼠肝损伤及机制探讨

目的研究双氢青蒿素(dihydroqinghaosu,DQHS)对刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用及可能机制。方法小鼠尾静脉注射ConA建立肝损伤模型;改良赖式法和ELISA法分别测定DQHS预给药对该模型小鼠血浆转氨酶和TNF-α水平的影响;MTT法检测DQHS对ConA诱导体外小鼠脾淋巴细胞增殖的影响;RT-PCR检测DQHS对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞IL-1β和TNF-αmRNA表达水平的影响。结果与模型组比较,DQHS 40μg.g-1给药组可降低ConA诱导的肝损伤小鼠血浆转氨酶水平,各DQHS组均可降低该小鼠血浆TNF-α水平;DQHS 40μmol.L-1和100μmol.L-1处理组能抑制ConA诱导的体外脾淋巴细胞增殖,减少LPS刺激的巨噬细胞炎症因子IL-1β和TNF-αmRNA的表达。结论DQHS对ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤有保护作用,该作用可能通过抑制脾淋巴细胞增殖和巨噬细胞相关炎症细胞因子表达来实现。