肿瘤坏死因子α对豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性的影响及可能的分子调控机理.方法 体外分离培养豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞并建立内皮细胞通透性体外模型,观察TNF-α、TNF-α连同L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)或L-单甲基精氨酸(NG-monomethyl-L-arginine,L-NMMA)对内皮细胞通透性的影响.按照作用时间和浓度的不同,分别检测内皮细胞对伊文思蓝通透率的变化,并通过免疫荧光激光共聚焦扫描显微镜测定各组标本中的F-肌动蛋白(F-actin)含量的变化.结果 TNF-α能显著增加耳蜗血管纹微血管内皮细胞的通透性,使伊文思蓝的通透率升高(P值均＜0.01),且随TNF-α浓度的提升和作用时间的延长而增加.一氧化氮(nitric oxide,NO)供体L-Arg能增加TNF-α作用下耳蜗血管纹微血管内皮细胞的通透性,使伊文思蓝的通透率升高,差异具有统计学意义(P值均＜0.01),且随着L-Arg浓度的增加内皮细胞对伊文思蓝的通透率也明显增加.一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂L-NMMA可降低TNF-α作用下耳蜗血管纹微血管内皮细胞的通透性,使伊文思蓝的通透率下降,差异具有统计学意义(P值均＜0.01),且随着L-NMMA浓度的增加内皮细胞对伊文思蓝的通透率也明显下降.TNF-α能使内皮细胞中的F-actin含量明显减少(P＜0.01),且TNF-α的浓度越高F-acitn的含量降低越明显;L-Arg能进一步降低F-actin的含量(P＜0.05);而L-NMMA则能抑制这种趋势(P＜0.05).结论 TNF-α能增加耳蜗血管纹微血管内皮细胞的通透性,NO可能是TNF-α调控内皮细胞通透性的重要分子机制之一;耳蜗微血管内皮细胞中F-acfin含量的改变可能与其通透性的调控有关.     

耳蜗微血管内皮细胞通透性体外模型的研究

目的建立豚鼠耳蜗微血管内皮细胞通透性体外模型.方法采用活体组织细胞分离及培养技术,获取培养的豚鼠耳蜗微血管单层融合内皮细胞,免疫组化法检测内皮细胞标志物Ⅷ因子鉴定培养细胞的性质及其纯度,小池技术构建通透模型,以脑微血管内皮细胞通透模型为阳性对照、肺微血管内皮细胞通透模型为阴性对照和无内皮细胞的小池为空白对照,125I标记牛血清白蛋白检测本模型的通透性特点.结果①耳蜗血管纹组织块培养后2 d,边缘即有细胞生长,之后细胞数量逐渐增多,10 d左右细胞增殖成数个细胞集落;纯化后,单个培养细胞一般呈梭形,传代细胞培养8 d后,细胞增殖形成片状单层,紧密排列,显微镜下呈现培养内皮细胞典型的"铺路石" 样外观.免疫组化检查,95%以上的培养细胞胞浆有桔黄色着色,呈阳性反应,而对照组无此着色.②实验组对牛血清白蛋白的通透性大于阳性对照组(P<0.05),小于阴性对照组和空白对照组(P<0.01).结论建立的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞通透性体外模型适合于耳蜗微血管内皮细胞通透性的研究,为今后研究血迷路屏障通透性及其调控机理奠定了良好的基础.     

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的跨内皮细胞电阻及对牛血清白蛋白的通透性

目的 :研究豚鼠耳蜗微血管内皮细胞跨细胞电阻的动态变化及峰值大小 ,以及细胞单层对12 5I 牛血清白蛋白的通透性。方法 :①用小池技术建立起该内皮细胞通透性的体外模型 ;②研究该体外模型跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白的通透性。结果 :①耳蜗内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻呈动态变化过程 ,以 5×10 4/cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,其跨细胞电阻峰值大小为 (118.9± 18.5 )Ω/cm2 ;②体外模型中加入12 5I 牛血清白蛋白后 ,贝克 时间变化图呈抛物线型上升曲线 ,90min内几乎呈直线。结论 :跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白变化曲线反映了体外耳蜗微血管内皮细胞的通透性特征。     

两种神经营养因子对噪声性毛细胞损伤协同防护作用的观察

目的：观察胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derved neurotrophic factor,GDNF)和神经营养素－3（neurotrophin-3,NT-3)对噪声引起毛细胞肌动蛋白损伤的协同防护作用。方法：采用改进的豚鼠耳蜗微渗透压泵慢性灌注技术,将GDNF和NT－3缓慢注入12只豚鼠左侧内耳,在左耳灌注人工外淋巴液的9只豚为对照,检测噪声暴露后豚鼠听功能和耳蜗毛细胞缺失率的变化。结果：动物术后14d(噪声暴露后10d)实验组手术耳和非手术耳的脑干诱发电位反应（auditory brainstem responses,ABR)阈值低于对照组（秩和检验,下同,P＜0．05,P＜0．01）,毛细胞表皮板和纤毛肌动蛋白荧光染色计数发现实验组手术耳和非手术耳外毛细胞缺失率均低于对照组（P＜0．001,P＜0．01）,内毛细胞缺失率也均低于对照组（P＜0．01,P＜0．01）。结论：GDNF和NT－3对噪声性聋具有较好的协同防护作用。     

剪切力对豚鼠耳蜗微血管内皮细胞形态学的影响

目的观察不同剪切力对体外培养的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的影响，丰富血迷路屏障的研究。方法用自制的流体力学装置在不同时相点、以不同剪切力对豚鼠耳蜗微血管内皮细胞进行力学作用，获得形态学图像并进行形状参数Pyx和Q的测定分析。结果通过胶原酶消化法可获得单层培养的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞。对于豚鼠耳蜗微血管内皮细胞，剪切力为0，0883Pa时作用24h未发生细胞形态改变，P〉0，05；当剪切力增加到0，1184Pa时，作用8h后细胞形态即开始出现顺流体方向的顺应性变化，随时间延长，变化趋势更明显，P〈0，05。结论豚鼠耳蜗微血管内皮细胞在受到剪切力作用后形态学不同于静态培养的内皮细胞，其所能耐受的剪切力范围较小。     

剪切力对耳蜗微血管内皮细胞细胞骨架的影响

目的观察不同剪切力对体外培养的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞形态学及细胞骨架的影响。方法用自制的流体力学装置在不同时相点、以不同剪切力对豚鼠耳蜗微血管内皮细胞行力学作用,获得形态学图象,同时对其细胞骨架在激光扫描共聚焦显微镜下行F-actin荧光染色测定分析。结果不同大小的剪切力作用会导致细胞形态发生变化;细胞形态变化后会出现应力纤维改变,应力纤维的变化早于形态学改变,这种改变随剪切的时间、力量变化而变化。结论豚鼠耳蜗微血管内皮细胞在受到剪切力作用后之所以会产生形态学改变,可能与细胞骨架变化有关。     

豚鼠内耳微循环障碍对血迷路屏障通透性的影响

目的　研究豚鼠耳蜗微循环障碍动物模型的血迷路屏障通透性变化特点 ,了解血迷路屏障通透性变化在内耳缺血性损伤中的可能作用。方法　采用光化学法建立豚鼠耳蜗微循障碍动物模型 ,改良伊文蓝荧光法定量检测其血迷路屏障通透性变化特点。结果　豚鼠耳蜗发生微循环障碍后 2h和 4h ,伊文蓝通过血迷路屏障的量分别为每只 ( 1.70 9± 0 .76 9) μg( x±s,下同 )和 ( 2 .849±0 6 5 3) μg ,t检验P <0 .0 1。 结论　豚鼠耳蜗发生微循环障碍后其血迷路屏障通透性明显增高 ,并随时间的延长而加重 ,可能是微循环障碍致内耳损伤的重要机制之一。     

卡那霉素对内耳环核苷酸的影响

作者观察豚鼠注射卡那霉素后，耳蜗功能受到影响时内耳环核苷酸的变化，连续注射卡那霉素（400mg/kg.日）五日后，80dBCM最大振幅降低，部分动物CM阈值亦上升；AP潜伏期延长，80dBN，振幅降低。Corti氏器、耳蜗侧壁（血管纹 螺旋韧带）细胞内cAMP及cGMP含量均明显降低，内耳中cAMP及cGMP水平的变化与听功能受损一致，卡那霉素致药物性听力损害与所致内耳环核苷酸的减少密切有关。     

冲击波对豚鼠耳蜗毛细胞碳酸酐酶的影响

用组织化学、细胞化学方法结合图像分析和听觉电生理技术,研究了冲击波对豚鼠耳蜗毛细胞碳酸酐酶（CA）的影响及其与听阈阈移的关系。结果表明冲击波暴露后6、12、24、48、72小时组,毛细胞中CA阳性产物的灰度值较正常组明显降低（P＜0．01）,其灰度值的变化与听觉脑干反应（ABR）阈移呈负相关（r=-0．9369,P＜0．01）。提示毛细胞中CA活性减低是冲击波致听力损失的因素之一。文中讨论了CA在耳蜗毛细胞的作用及其与听阈的关系。     

连翘酯苷对顺铂作用后豚鼠耳蜗c-jun表达的影响

目的：研究连翘酯苷对顺铂作用后豚鼠耳蜗c—jun表达的影响。方法：将30只豚鼠随机分为对照组（10只）,顺铂组（10只）和连翘酯苷组（10只）。腹腔注射顺铂溶液（8mg／kg）,1次／d,连续7d,建立顺铂耳毒性模型;连翘酯苷组在每次注射顺铂溶液30rnin前腹腔注射连翘酯苷25．0mg／kg／d,连续7d;对照组以生理盐水代替顺铂溶液注射,连续7d。实验动物被处死前,检测其DPOAE幅值变化;采用蛋白质印迹杂交（Western Blotting）检测各组豚鼠耳蜗c—jun蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应检测各组豚鼠耳蜗c—jun基因mRNA的表达。结果：顺铂组DPOAE幅值明显低于对照组（P〈0．01）;相比于顺铂组,连翘酯苷组DPOAE幅值明显升高（P〈0．05）。顺铂组豚鼠耳蜗c—jun蛋白与mRNA表达水平均显著高于对照组（P〈0．01）;相比于顺铂组,连翘酯苷组C-jun蛋白与mRNA表达水平明显降低（P〈0．05）。结论：连翘酯苷能够通过降低c—jun的表达防护顺铂所致的耳蜗损伤。     

豚鼠内耳微循环障碍对血迷路屏障通透性的影响

OBJECTIVE: To study the changes of blood-labyrinth barrier permeability during cochlea microcirculatory disorders in guinea pigs. METHODS: Using modified method of Evan's blue fluorescence, the changes of permeability of blood-labyrinth barrier were observed in the animal model of cochlea microcirculatory disorders which was induced by photochemical reaction. RESULTS: Amount of Evan's blue passing through the blood-labyrinth barrier was (1.709 +/- 0.769) microgram per guinea pig after 2 hours and (2.849 +/- 0.653) microgram per guinea pig after 4 hours when the cochlea was in microcirculatory disorder. CONCLUSION: The results indicated that the permeability of blood-labyrinth barrier increased when cochlea microcirculatory disorders occurred and the increase of blood-labyrinth barrier permeability may be one of the important mechanisms which causes the cochlear ischemic lesions.     

噪声对豚鼠耳蜗血管纹紧密连接蛋白claudin-5表达及血迷路屏障通透性的影响

目的研究噪声对豚鼠耳蜗血管纹紧密连接蛋白claudin-5表达及血迷路屏障功能的影响。方法40只豚鼠随机分为正常对照组(20只)和噪声暴露组(20只),噪声暴露组给予声强为115dB SPL白噪声暴露,每天6小时,连续两天,对照组不予噪声暴露。于实验前及噪声暴露后次日对两组豚鼠行ABR检测,第二次ABR检测后对两组豚鼠耳蜗基底膜行鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素(Phalloidin-FITC)染色;用硝酸镧透射电镜和常规透射电镜观察两组豚鼠内耳血迷路屏障通透性和紧密连接的变化;Western blot和免疫组织化学染色观察两组豚鼠耳蜗血管纹和螺旋韧带处claudin-5的表达。结果噪声暴露组豚鼠ABR波Ⅲ反应阈较正常对照组阈移40dB以上,差异有统计学意义(P<0.05);基底膜铺片FITC染色示噪声暴露组底回基底膜毛细胞大量缺失,其余部分毛细胞纤毛排列紊乱并出现融合,而对照组毛细胞排列整齐,其纤毛呈V或W型,两组间外毛细胞计数比较差异有统计学意义(P<0.05);透射电镜下,可见噪声暴露组血管内皮细胞间和边缘细胞间的紧密连接均遭到破坏,细胞间隙增大;硝酸镧透射电镜下,大量镧颗粒从血管腔内渗漏到管腔外的组织间隙,而对照组镧颗粒仅局限于血管腔内;Western blot结果示,两组耳蜗外侧壁血管纹均有claudin-5表达,但噪声暴露组的表达量明显低于正常组;免疫组织化学染色也表明,两组豚鼠耳蜗外侧壁毛细血管内皮细胞、边缘细胞等处均有claudin-5阳性表达,但噪声组表达量显著低于正常组(P<0.05)。结论噪声通过下调紧密连接蛋白claudin-5的表达,破坏细胞间紧密连接,增加豚鼠血迷路屏障的通透性,从而导致内耳微环境的破坏,是噪声性聋可能的发病机制之一。     

耳蜗振动创伤后血迷路屏障变化的磁共振成像表现

目的 在动物模型中探讨电钻振动诱导听力减退的机制和可能的血迷路屏障变化。方法 用电磁振荡器在5只豚鼠听泡上产生可重复的振动，其振动频率为250Hz，用复合动作电位评估其听功能，振动后3小时至4天用4．7特斯拉磁共振成像分析其血迷路屏障变化。静脉注射T1增强剂Gadolinium-diethylenetriaminepentaacetate-bismethylamide （Gd-DTPA-BMA）作为血迷路屏障的示踪剂。结果 振动诱导平均听力损失40dBHL，在振动后立即测试的耳蜗中．其中阶摄取Gd-DTPA-BMA，提示血迷路屏障通透性增加。在振动后2天至4天的动物中，其中阶内无Gd-DTPA-BMA摄取。结论 250Hz振动使血路屏障通透性增加是使导致听力减退的原因之一。其通透性的变化为一个可逆的过程。     

Uptake of fluorescent gentamicin by vertebrate sensory cells in vivo

Aminoglycoside uptake in the inner ear remains poorly understood. We subcutaneously injected a fluorescently-conjugated aminoglycoside, gentamicin-Texas Red (GTTR), to investigate the in vivo uptake of GTTR in the inner ear of several vertebrates, and in various murine sensory cells using confocal microscopy. In bullfrogs, GTTR uptake was prominent in mature hair cells, but not in immature hair cells. Avian hair cells accrued GTTR more rapidly at the base of the basilar papilla. GTTR was associated with the hair bundle; and, in guinea pigs and mice, somatic GTTR fluorescence was initially diffuse before punctate (endosomal) fluorescence could be observed. A baso-apical gradient of intracellular GTTR uptake in guinea pig cochleae could only be detected at early time points (<3h). In 21-28 day mice, cochlear GTTR uptake was greatly reduced compared to guinea pigs, 6-day-old mice, or mice treated with ethacrynic acid. In mice, GTTR was also rapidly taken up, and retained, in the kidney, dorsal root and trigeminal ganglia. In linguinal and vibrissal tissues rapid GTTR uptake cleared over a period of several days. The preferential uptake of GTTR by mature saccular, and proximal hair cells resembles the pattern of aminoglycoside-induced hair cell death in bullfrogs and chicks. Differences in the degree of GTTR uptake in hair cells of different species suggests variation in serum levels, clearance rates from serum, and/or the developmental and functional integrity of the blood-labyrinth barrier. GTTR uptake by hair cells in vivo suggests that GTTR has potential to elucidate aminoglycoside transport mechanisms into the inner ear, and as a bio-tracer for in vivo pharmacokinetic studies.     

豚鼠外源性血管内皮细胞生长因子增强内耳屏障转运作用的磁共振成像研究

目的观察血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor, VEGF)能否改变血迷路屏障和血外淋巴屏障的物质转运作用。方法11只300 ~900g雌雄兼并的杂色豚鼠在甲苯噻嗪(16mg/kg)和氯氨酮(60mg/kg)基础麻醉下接受手术,通过圆窗膜(明胶海绵吸附)将VEGF(6耳)或磷酸盐缓冲液(PBS, 5耳)投放至内耳。用T1对比剂二乙烯三胺五乙酸双甲酰胺钆(gadolinium diethylenetriamine pentaacetate bismethylamide, Gd DTPA BMA)作为内耳屏障转运示踪剂,用4 7T场强, 40cm孔径的BrukerBiospecAvance47 /40试验磁共振系统进行豚鼠耳蜗二维磁共振成像观测,用Paravision软件进行图像密度分析,用AdobePhotoshop6 0软件进行图像呈示。结果圆窗膜投放PBS未影响血外淋巴屏障渗透性变化。圆窗膜投放VEGF可显著增强处理侧血外淋巴屏障渗透性,VEGF处理的耳蜗鼓阶内Gd DTPA BMA转运显著增加(P<0 01 ), VEGF处理的耳蜗前庭阶内Gd DTPA BMA转运也显著增加(P<0 01)。VEGF处理的耳蜗中阶内Gd DTPA BMA转运无明显增加(P>0 05)。结论VEGF显著增强血外淋巴屏障的物质转运作用并可能有利于内耳在各种有害环境下的代偿及修复。     

Transport characteristics of the blood—Perilymph barrier

The inner ear must maintain a delicate homeostasis to preserve high sensitivity to acoustic and vestibular inputs. Various experimental conditions were imposed upon chinchillas to help identify these homeostatic mechanisms for the inner ear fluids. Radioactive ions (sodium, chloride, and calcium) pass into perilymph more slowly than they pass into cerebrospinal fluid or aqueous humor. The concentration of glucose in perilymph relative to that in serum was found to be quite constant (about 45 per cent) over a wide range of serum values (130-943 mg/dl) generated by continuous intravenous infusion. The transport of albumin into perilymph was very slight after injection of the radioactive protein intravenously. Osmotic agents cause an efflux of water from perilymph into a relatively hypertonic circulating blood, resulting in a secondary elevation of perilymph osmolarity. Recent findings relating to cyclic AMP metabolism and the possible role of this second messenger in the regulation of inner ear fluid metabolism are discussed. A new hypothesis that excess cyclic AMP in the inner ear may be related to endolymphatic hydrops is presented.     

条件声暴露后豚鼠耳蜗外毛细胞丝束肌动蛋白表达的改变

目的：观察豚鼠耳蜗丝束肌动蛋白的表达及分布情况以及条件声暴露后耳蜗毛细胞丝束肌动蛋白的表达有无改变,初步探讨耳蜗“坚韧化”现象的发生机制。方法：实验用豚鼠分组后,采用中心频率为1kHz、强度为95dBSPL的倍频程噪声对动物进行条件声暴露。条件声暴露结束后按实验设计的时间处死动物并进行耳蜗铺片及免疫荧光染色。应用激光扫描共聚焦显微镜观察柯替器荧光染色情况并对1kHz频率感音区的第3回柯替器外毛细胞（OHC）的荧光强度进行定量分析。结果：豚鼠耳蜗柯替器丝束肌动蛋白主要分布在内外毛细胞的静纤毛、表皮板,OHC顶部细胞侧壁,柱细胞头板。在底回柯替器OHC基底部,Deiters细胞指突,外柱细胞的胞体亦含有丰富的丝束肌动蛋白。不同时期的条件声暴露后,除条件声暴露1d组加休息5d组外,其他2组动物OHC的荧光强度均有明显变化。结论：①一定剂量的条件声暴露可导致耳蜗柯替器丝束肌动蛋白表达的改变。②除内外毛细胞的静纤毛、表皮板,柱细胞头板等既往报道的部位外,豚鼠耳蜗柯替器的外柱细胞胞体中也含有丰富的丝束肌动蛋白。③条件声暴露后耳蜗OHC丝束肌动蛋白浓度的减低可能与耳蜗“坚韧化”现象的产生有关。     

同种内耳抗原免疫致聋豚鼠的子代内耳功能和形态学观察

目的观察自身免疫性感音神经性聋(autoimmune sensorineural hearing loss，ASHL)母鼠所产子代内耳听觉和前庭生理功能、病理形态学的变化，初步探讨母鼠体内针对内耳组织抗原免疫反应是否可以造成子代的内耳损伤。方法同种内耳抗原(homogeneous inner ear antigens，HIEAg)持续免疫孕豚鼠，采用耳蜗电图(包括听神经复合动作电位)、总和直流电位、耳蜗微音器电位和眼震电图仪(记录自发性和冷热空气试验)测试母鼠和子鼠的听觉和前庭功能，并检测针对HIEAg的血清特异性体液和细胞免疫反应，采用火棉胶切片和HE染色，光镜观察内耳病理组织学改变。结果ASHL母鼠所产子鼠中，部分(3／7)出现听觉损伤，并发现其血清中特异性抗体水平升高，内耳出现免疫炎性病理损伤。非ASHL母鼠和对照组母鼠所产子代未见明显异常。结论ASHL雌鼠所产子代可出现感音神经性聋，其内耳损伤和功能障碍极可能与针对内耳组织的自身免疫反应(尤其是体液免疫)有关。     

Three-dimensional fluid-attenuated inversion recovery magnetic resonance imaging findings in patients with sudden sensorineural hearing loss

OBJECTIVE: To evaluate the inner ear in sudden sensorineural hearing loss (SNHL) using three-dimensional fluid-attenuated inversion recovery (3D-FLAIR) magnetic resonance imaging (MRI) at 3 Tesla (T). BACKGROUND: 3D-FLAIR MRI has recently been developed to detect high concentrations of protein or hemorrhage. Application of this method to sudden SNHL has not been described. METHODS: We used 3D-FLAIR at 3 T with and without gadolinium enhancement to evaluate eight patients with sudden SNHL. RESULTS: In four of eight ears with idiopathic sudden SNHL, high precontrast signals were observed within the inner ear on 3D-FLAIR. The high-signal areas observed on 3D-FLAIR were not detected by T1- or T2-weighted MRI in any of these patients. In one of these four ears, significant gadolinium enhancement was observed on 3D-FLAIR. CONCLUSION: Half the patients with sudden SNHL examined had high signals in the SNHL-affected ear on 3D-FLAIR at 3 T. High precontrast signals in the inner-ear fluid space may reflect minor hemorrhage, or an increased concentration of protein that had passed through blood vessels with increased permeability, or had originated from disrupted cells in the inner ear. Gadolinium enhancement in one ear suggested the breakdown of the blood-labyrinth barrier. 3D-FLAIR MRI should contribute markedly to the elucidation of pathologic conditions in the inner ears of patients with idiopathic sudden SNHL.