尿液DD3mRNA定量检测在前列腺癌诊断中的价值

目的探讨前列腺按摩后尿沉渣中DD3mRNA含量在前列腺癌诊断中应用价值。方法收集前列腺癌(Pca)患者18例、良性前列腺增生(BPH)33例,在前列腺穿刺活检前收集前列腺按摩后的尿液,离心取细胞沉淀物,用荧光实时定量RT- PCR方法检测DD3 mRNA和PSAmRNA含量,以PSAmRNA作为管家基因校正尿沉渣中的前列腺细胞,以DD3mRNA/PSAmR- NA比值表示尿DD3mRNA含量。用ROC曲线对DD3mRNA诊断PCa的性能进行分析,并与血清tPSA进行了比较,同时探讨了尿DD3mRNA阳性率与临床分期和病理分级的关系。结果Pca患者尿DD3mRNA表达量明显高于BPH患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,ROC-AUC=0.716(95%CI:0.572～0.861)。当截断值为0.118时,DD3mRNA的灵敏性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比分别为67.0%、78.8%、77.4%、63. 2%、83.9%、3.41和0.35。若血清tPSA分别以4ng/ml和10ng/ml为截断值时,灵敏度分别为100%和94.4%,特异度分别为15.25和57.6%。DD3mRNA的阳性率与临床分期和病理分级无关。结论DD3mRNA的特异性明显高于血清PSA,尿液DD3mRNA的检测可减少不必要的前列腺穿刺,作为PCa的一种非损伤性诊断方法具有良好的应用前景。     

RT-PCR与SYBR GreenⅠ实时RT-PCR方法检测乙型脑炎病毒的比较

目的:比较RT-PCR和SYBR GreenⅠ实时RT-PCR方法检测乙型脑炎病毒(JEV)的敏感性、特异性和时效性.方法:采用RT-PCR和SYBR GreenⅠ实时RT-PCR方法对连续10倍稀释的JEV核酸样品平行检测,比较两种方法的敏感性.同时以登革2型病毒、诺如病毒和狂犬病毒核酸进行两种方法的特异性测试.结果:SYBRGreen Ⅰ实时RT-PCR方法可检测出 40 copies/μL的核酸分子水平,与普通RT-PCR方法相比,敏感度提高了10倍,检测时间节省2 h.两种检测方法在检测JEV方面,与登革2型病毒、诺如病毒和狂犬病毒核酸均无交叉反应.结论:与普通RT-PCR相比,SYBR Green Ⅰ实时RT-PCR是一种更敏感、快速检测JEV的方法.     

人TIM-1和TIM-3 mRNA实时SYBR Green Ⅰ定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立实时SYBR Green I定量RT-PCR检测人TIM-1和TIM-3mRNA的方法。方法从人外周血单个核细胞提取的总RNA中逆转录扩增人TIM-1和TIM-3的cDNA,将将纯化的人TIM-1和TIM-3的扩增产物分别与pMD18-T Simple载体进行连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验。结果建立了TIM-1和TIM-3基因基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为103-107拷贝。阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性相关系数分别为1.00和1.00,扩增效率分别为1.070和1.023,批内及批间变异系数5%。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰。结论我们成功建立检测人TIM-1和TIM-3的实时荧光定量PCR方法,为进一步研究人TIM-1和TIM-3功能奠定基础。     

前列腺癌患者外周血DD3 mRNA的检测及临床意义

目的　探讨检测前列腺癌(PC)患者外周血DD3mRNA在诊断和治疗监测中的意义。方法　用巢式逆转录聚合酶链反应(nRT PCR)检测44例不同分期PC患者和30例良性前列腺增生(BPH)患者及18名健康男性志愿者外周血中DD3mRNA,并进行对比分析。结果　BPH患者和健康男性志愿者外周血中DD3mRNA均阴性;未治疗PC组外周血DD3mRNA100%阳性(11 /11),而经内分泌治疗PC组阳性率30. 3% ( 10 /33 ),两组差异有统计学意义(P<0. 01 )。结论　外周血DD3mRNA是PC诊断和内分泌治疗监测的良好指标,有望成为PC特异性肿瘤标志物。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的 建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-PCR)方法,探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值.方法 应用SYBR GreenⅠ作为荧光染料,以GAPDH作为内对照,建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法,并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测.结果 56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为1.07±2.99,阳性表达率为66.1%(37/56),30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为0.13±0.07,阳性表达率为6.7%(2/30),30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性;结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化(P＞0.05),但在Dukes C+D期表达水平(1.73±2.15)及表达阳性率82.8%(24/29)均显著高于Dukes A+B期表达水平(0.39±0.87)及表达阳性率48.1%(13/27)(P＜0.01).结论 该FQ-PCR方法简便、特异、可靠;检测外周血CEA mRNA表达水平,对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性,可提高早期结直肠癌诊断符合率;在发生转移的Dukes C+D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A+B期,可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一,动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（VQ-PCR）方法，探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值。方法应用SYBR Green J作为荧光染料，以GAPDH作为内对照，建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法，并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测。结果56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为1．07±2．99，阳性表达率为66．1％（37／56），30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为0．13±0．07，阳性表达率为6．7％（2／30），30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性；结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化（P〉0．05），但在Dukes C＋D期表达水平（1．73±2．15）及表达阳性率82．8％（24／29）均显著高于Dukes A＋B期表达水平（0．39±0．87）及表达阳性率48．1％（13／27）（P〈0．01）。结论该VQ-PCR方法简便、特异、可靠；检测外周血CEA mRNA表达水平，对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性，可提高早期结直肠癌诊断符合率；在发生转移的Dukes C＋D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A＋B期，可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一，动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值。     

实时荧光定量RT-PCR检测乳腺癌VEGF mRNA的表达

目的：建立实时荧光定量逆转录一多聚酶链反应（real—timequantitative,RT—PCR）检测乳腺癌患者肿瘤组织VEGFmRNA表达的方法,并验证其与免疫组织化学LsAB方法检测VEGF蛋白表达的相关性。方法：提取组织总RNA,逆转录成mRNA,采用实时荧光定量RT—PCR检测44例乳腺浸润性导管癌、25例癌旁正常小叶组织、13例乳腺良性疾病组织中VEGFmRNA表达;采用免疫组织化学LSAB法和彩色图像病理分析系统半定量检测其VEGF蛋白表达。结果：乳腺癌组织中VEGFmRNA表达水平显著高于癌旁和良性病组织（｜P〈0．001）,而后两者之间无明显差异（P〉0．05）;VEGF蛋白表达在癌组织,癌旁和良性病组中的分布特点与VEGFmRNA完全一致。结论;本研究所建立的用于检测人乳腺组织VEGFmRNA表达的实时荧光定量RT—PCR方法,是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测方法,与免疫组化LSAB方法检测的VEGF蛋白表达具有良好相关性,在乳腺癌的早期诊断和良恶性鉴别诊断中具有重要的参考价值。     

实时荧光定量RT-PCR检测食管癌Survivin mRNA的表达

SurvivinmRNA是近年来发现的一种新的凋亡抑制因子,属于凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins,IAP)家族的新成员,具有抑制细胞凋亡和调节细胞增殖的双重作用[1]。Survivin选择性地表达于胚胎组织和人类大多数肿瘤组织,而在正常人终末分化组织中不表达[2,3]。对Survivin的     

前列腺癌组织中DD3和PSA基因定量表达与临床意义

目的探讨DD3和PSA基因在前列腺癌组织中定量表达及其临床意义。方法用实时荧光定量RT-PCR方法对21例前列腺癌组织(PCa)、39例良性前列腺增生(BPH)组织中DD3mRNA和PSAmRNA含量进行检测,用ROC曲线对DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA等指标对前列腺癌诊断价值进行评价。结果LNCaP细胞株中PSAmRNA含量约为DD3mRNA的4000倍。PCa组织中DD3mRNA和PSAmRNA含量以及DD3mRNA/PSAmRNA比值均显著高于BPH组织,差异具有统计学意义(P<0·01),但PCa不同临床分期和分化程度间差异无统计学意义(P值均>0·05)。ROC曲线分析结果显示,DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA的曲线下面积(AUC-ROC)分别为0·937(95%CI:0·879~0·995)、0·755(95%CI:0·629~0·880)和0·839(95%CI:0·738~0·940)。当DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA临界值分别为1·4×105copies/mgtissue、3·0×107copies/mgtissue和5·0×10-3时,灵敏度分别为90·5%、81·0%和81·0%;特异度分别为85·0%、62·0%和66·7%。若将DD3mRNA和PSAmRNA联合用于PCa的诊断,其特异性与DD3mRNA相同,特异性均为85·0%,灵敏度可达100%。结论PCa组织DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA较BPH组织显著增高,DD3mRNA用于PCa的诊断性能均优于PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA,DD3mRNA和PSAmRNA的联合检测时特异度与DD3mRNA相同,但可明显提高灵敏度,对PCa的早期诊断具有重要意义。     

套式荧光实时RT-PCR检测结直肠癌患者外周血中CRD-BP mRNA

目的　研究结直肠癌患者外周血中CRD BPmRNA的表达,探讨其作为结直肠癌标志物的可行性。方法　用套式荧光实时PCR对 64例结直肠癌患者、20例胃肠道良性疾病患者和 25例健康成人进行外周血CRD -BPmRNA的检测,并对阳性PCR产物进行克隆、测序。结果　结直癌患者中, 28(43 8% )例检测到CRD BPmRNA表达,在良性病和健康人均无表达,两组差异显著(χ2 =26. 493,P<0. 001)。CRD -BPmRNA的表达与结直肠癌的Dukes分期有显著相关性(χ2 =8. 195,P<0. 05)。结论　在结直肠癌患者的外周血中,能够检测到CRD- BPmRNA的表达,CRD- BPmRNA可作为外周血中结直肠癌细胞的肿瘤标志物用于临床诊断。     

子痫前期患者外周血T-bet mRNA和GATA3 mRNA的表达水平的探讨

目的探讨子痫前期患者外周血中的T-bet mRNA与GATA3 mRNA表达情况,分析其在子痫前期发病中的作用及机制。方法选取2011年1月到2012年12月间的46例子痫前期孕妇为研究组,并选取同期46例正常孕妇为对照组,检测两组外周血中的T-bet mRNA与GATA3 mRNA表达情况。结果 T-bet mRNA表达在两组中表达增强,研究组的T-bet mRNA表达量明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。GATA3 mRNA在两组中表达量减弱,研究组GATA3 mRNA表达量明显的低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。T-bet mRNA/GATA3 mRNA比值在两组中呈现正表达,差异有统计学意义(P0.05)。结论子痫前期患者外周血中的T-bet mRNA呈现高表达,而GATA3 mRNA呈现低表达,二者在子痫前期发病中具有一定作用。     

TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测外周血单个核细胞TRAIL-mRNA

目的 建立TaqMan实时荧光定量RT-PCR（rQ-RT-PCR）检测外周血单个核细胞（PBMC）中肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）mRNA含量的方法,探讨PBMC中TRAIL mRNA的检测价值.方法 在TRAIL基因第二和第三外显子区设计特异性引物和荧光探针,用RT-PCR扩增目的片段,实时检测产物的荧光强度,以标准品建立标准曲线,软件自动计算出待测样本中TRAIL mRNA含量,以TRAIL mRNA和β2M mRNA含量的对数比值进行TRAIL mRNA表达水平评价.结果 TRAIL mRNA含量线性范围为（2.9×10^3～2.9×10^9）copies/ml,批内和批间变异系数分别为9.5%和16.7%.30例健康献血员和58例慢性乙肝患者TRAIL mRNA与β2M mRNA浓度的对数比值的（x）±s分别为0.528±0.014和0.775±0.038,两组差异显著,P＜0.001.结论 FQ-RT-PCR检测TRAIL mRNA水平具有较好的灵敏度和重复性,适用于临床研究.     

RT-PCR检测前列腺癌患者PSMA mRNA表达的临床意义

目的应用巢氏逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测前列腺癌（PCa）患者外周血前列腺特异性膜抗原mRNA（PSMA mRNA）的表达并探讨其临床应用意义。方法采用巢氏RT—PCR检测28例PCa患者、20例前列腺增生（BPH）患者和10例健康男性外周血中PSMA mRNA的表达情况。结果28例PCa患者中PSMA mRNA表达阳性18例。20例BPH患者和10例健康男性均为阴性。检测灵敏度为64．29％,特异性为100．00％。18例接受内分泌治疗的患者中PSMA mRNA表达阳性13例,阳性率为72．22％,未接受内分泌治疗的患者阳性率为40．oo％。PSMA mRNA与前列腺特异性抗原（PSA）水平具有明显相关性,随着PSA水平的升高PSMA mRNA阳性率也随之升高,各组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）。PSMA mRNA与PCa的临床分期也有明显的相关性,D期PCa患者的PSMA mRNA阳性率明显高于B、C期,差异有统计学意义（P〈0．05）。PSMA mRNA与PCa的病理分期无明显相关性。PSMA mRNA与PCa的转移有明显的相关性,己出现骨转移者PSMA mRNA阳性率明显升高。差异有统计学意义（P〈0．05）。结论巢氏RT—PCR检测PCa患者外周血中PSMA mRNA表达的方法是一种十分有应用价值的诊断PCa及监测PCa微转移的方法,特别是对接受过内分泌治疗的患者,检测PSMA mRNA要比PSA mRNA更有意义。