结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

异烟肼（INH）作为最主要的一线抗结核药物之一,对其耐药性的研究日益受到重视。国外也有报道认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶一过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关,与inhA基因突变也有相关性。我们采用PCR-单链构象多态性分析（PCR—SSCP）方法检测了95株肺结核病人痰标本临床分离株,并对47例结核病人痰标本直接进行KatG基因、inhA基因突变检测,现将结果报告如下。     

耐异烟肼结核分支杆菌分子生物学研究进展

近年来结核病再度流行,耐药结核菌株的出现是重要原因之一。异烟肼作为治疗结核病最主要的一线药物,其耐药率显著上升,我国异烟肼耐药率已达20％以上。结核分支杆菌对异烟肼的耐药机制较为复杂,涉及多个分子靶位,近年来在结核病研究中倍受关注,国内外已有这方面的研究报道。本文对近年来耐异烟肼结核分支杆菌的分子生物学研究进展作一综述。     

结核分支杆菌利福平和异烟肼耐药基因的快速检测

近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。作为一线抗结核药物，INH和RFP结核病的预防、治疗方面起着重要作用。但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下：     

结核分支杆菌耐药的分子机制研究进展

目前结核病仍是威胁人类健康的3大感染性疾病之一,是仅次于艾滋病的第2大致死性感染性疾病。我国至今仍是结核病的高发国家,结核病的患患者数仅次于印度居于第2位。现在全国约有600万名结核病患者,每年约25万人死于结核病,结核病仍然是世界卫生组织和我国重点防治的重大传染性疾病之一。     

结核分支杆菌异烟肼和链霉素耐药基因的杂交检测

异烟肼（INH）、链霉素（SM）作为结核病治疗中最主要的一线抗结核药物，对其耐药性的研究日益受到重视。传统的结核分支杆菌耐药性测定由于需要6—8周时间，不能及时指导临床用药。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对结核菌的耐药机制有了进一步认识，认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶一过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，也inhA基因突变也有相关性。     

快速检测耐异烟肼结核分支杆菌方法的研究

目的 应用多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析（multiple—Polymerase Chain Reaction—Single Strand Conformation Polymorphism,multi—PCR—SSCP）方法,快速、特异地同时检出耐异烟肼（isoniazid,INH）结核分支杆菌aphC启动子、inhA、katG基因的突变情况,并与直接测序（derictsequencing,DS）结果相比较,参照药敏试验,探讨该方法的可行性。 方法 根据结核分支杆菌的aphC启动子序列、inhA序列、katG序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用multi—PCR-SSCP技术,同时检测对结核分支杆菌耐INH起作用的这三个基因的突变情况;同时进行耐药株的测序分析。 结果 对H37Rv标准株、临床分离INH敏感株（23株）及INH耐药株（35株）进行multi—PCR—SSCP分析,突变检出率82．9％（29／35）;耐药株测序分析突变检出率为85．7（30／35）。两种方法的符合率为97．1％E（29＋5／）／35]。 结论 耐药基因检测指导治疗是一种新探索,multi—PCR—SSCP方法敏感、特异,能同时快速有效地检测结核分支杆菌aphC启动子、inhA、katG三个INH耐药基因的突变,提高检验效率,有望成为临床指导用药的好方法。     

快速检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性的临床应用

目的建立快速检测结核分支杆菌耐药基因的分子药敏方法。方法要聚合酶链反应——单链构象多态性（PCR—SSCP）分析40株结核分支杆菌KatG基因突变。其中20株为异烟肼（INH）敏感株,20株为INH耐药株,用PCR—SSCP图谱鉴定扩增产物有无突变,H37RV标准株作对照．结果所有INH敏感株SSCP带普与对照相同;19株INH耐药株中8株与对照相同,11株有不同程度的差异,INH耐存KatG基因突变或缺失的阴性率为60％。结论多数结核分支杆菌INH是由于其KatGj基因突变所致,用PCR—SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

基因芯片技术检测结核分支杆菌耐利福平基因突变的研究

目的建立基因芯片检测结核分支杆菌耐利福平基因突变，结合基因测序和常规药物敏感性试验进行比较，探讨其实用价值。方法根据结核菌rpoβ基因突变特点，设计不同的寡核苷酸探针，点样制备可检测rpoβ基因突变的芯片，检测利福平（Rifompicin，RFP）株的rpoβ变异情况。结果137株临床分离结核菌，49株耐RFP，占35．8％，平均MIC为179．6±135．0ug／mL。Rpop突变率为95．7％（47／49），主要为点突变。突变点依次为531 Ser（TCG）→Leu（TTG）（40．8％）、531 Ser（TCG）→Trp（TGG）（12．2％）、526 His（CAC）→Tyr（TAC）（6．1％）、526His（CAC）→Asp（GAC）（6．1％）。526 His（CAC）→Asn（AAC）（6．1％）、526 His（CAC）→Pro（CCC）（8．2％）、516Asp（GAC）→Val（GTC）（12．2％）、533 Leu（CTG）→Arg（CGG）（4．1％）和513 GIn（CAA）→Pro（CCA）（2．1％）。结论本研究建立的检测结核菌rpoβ基因突变的基因芯片技术敏感性高，特异性强，可应用于结核菌耐RFP基因的检测。     

结核分支杆菌耐链霉素耐药基因的检测

目的：探讨结核分支杆菌对链霉素(SM)的耐药分子机制,评估应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）技术检测rpsL基因突变在结核分支杆菌对SM耐药性测定中的应用价值。方法：采用PCR－SSCP方法对71株结核分支杆菌临床分离株（其中药物敏感株35株,耐SM或含耐SM耐多药株36株）和30例耐SM肺结核病人痰标本的rpsL基因突变进行检测。结果：以结核分支杆菌H37RV为对照,35株药物敏感株的rpsL基因PCR扩增产物267bp片段SSCP图谱正常;36株耐SM分离株中,26株rpsL基因SSCP图谱异常,其突变率为72．2％。30例耐SM肺结核病人痰标本有22例PCR扩增阳性,14例SSCP图谱与H37RV株有差异,rpsL突变率为63．6％。结论：rpsL基因突变是SM耐药性的重要分子机制,PCR－SSCP技术可以快速、准确地检测结核分支杆菌rpsL基因突变,该技术有望直接用于临床标本耐药性检测。     

结核分支杆菌对阿米卡星的耐药性研究

目的了解阿米卡星对耐药结核分支杆菌是否有效。方法5种不同浓度的抗结核药物培养基内加入结核分支杆菌浓度为0．1mg／mL的菌液0．1mL,4周后观察耐药情况。结果5种抗结核药物不同浓度,对结核分支杆菌有不同的敏感性和耐药性,其中以加入阿米卡星药物抗菌活性良好。结论阿米卡星为二线抗结核药物,对治疗耐药结核分支杆菌有效。     

结核分枝杆菌耐药机制和治疗的最新研究进展

结核病（tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）引起的慢性传染病。近年来,结核分枝杆菌的耐药性变异尤为突出,耐药结核病已成为一个不可忽视的全球公共卫生问题。一直以来,国内外诸多研究聚焦于耐药结核发病机制及治疗方法的研究,并且不断形成新的机制理论和治疗方案。该文着重于对MTB耐药机制及治疗的最新进展进行综述,从而为耐药结核的新药研制及制定更合理的治疗方案提供参考。     

噬菌体法与BacT／ALERT3D检测吡嗪酰胺对耐药性结核分枝杆菌的比较研究

【目的】建立噬菌体生物扩增法（PhaB法）快速测定吡嗪酰胺（PZA）耐药性,探讨其在结核分枝杆菌（MTB）PZA耐药性测定中的应用价值。【方法】应用MTB噬茵体法快速MTB耐药的PhaB方法并用于测定115株MTB-1盎床分离株耐药性。同时与BacT／ALERT3D药敏试验结果相比较,对耐药性测定结果不符合的菌株测定其最低抑茵浓度（MIC）。【结果]PhaB法检测PZA耐药性的最佳测定条件为pH值5．5、药物浓度200mg／L、37℃作用48h。115株临床分离株,PhaB法敏感90株,耐药25株;BacT／ALERT3D法敏感87株,耐药28株;其中两种方法均敏感85株,均耐药24株,即测定结果相符109株,符合率94．78％;测定结果不符6株,不符合率5．22％。如以BacT／ALERT3D测定结果为判断标准,则PhaB检测PZA耐药性的敏感性为85．71％（24／28）,特异性为97．70％（85／87）,阳性预测值为96％（24／25）,阴性预测值为94．44％（85／90）,准确性为94．78％（109／115）。【结论]PhaB法检测PZA耐药性只需2～3d时间,操作简便,不需特殊仪器设备,可作为MTB的PZA耐药性快速筛选方法。     

结核生物蛋白芯片技术在临床诊断中的意义

目的 利用芯片技术,建立结核LAM,16-kDa,38-kDa蛋白芯片检测结核分技杆菌的方法,以期为结核与肺外结核的早期诊断提供参考.方法 采用CCD原理结合视频采集方法,应用结棱蛋白膜芯片进行1 623例检测.结果 LAM,16-kDa,38-kDa蛋白芯片联合检测住院病人阳性率53.2%(396/744);门诊病人30.0%(264/879).结论 结核多种抗原的蛋白芯片检测系统联合运用三种抗原联合检测对结核病的诊治有积极的意义.     

结核分支杆菌喹诺酮耐药基因的研究

[目的]了解结核分支杆菌耐喹诺酮耐药基因突变情况,建立快速分子药敏实验方法。[方法]通过PCR—SSCP和直接测序技术(PCR～DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况。[结果]以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗做对照,30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常,测序分析与对照株相同。45株喹诺酮耐药株中,34株(75．6％)gyrA基因SSCP图谱泳动异常;测序证实10株为90位密码子的突变,24株为94位密码子突变,符合率100％。[结论]gyrA基因突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制,PCR—SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌耐喹诺酮株的简便、快速的方法．并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验。     

结核分枝杆菌对氧氟沙星、左氧氟沙星体外耐药监测

目的了解菌阳肺结核患者对氟喹诺酮药物的耐药现状,为临床制定标准化方案提供参考依据。方法选取2008年3月至2009年3月期间天津市海河医院门诊及住院菌阳肺结核病患者119例,对其结核分枝杆菌（MTB）临床分离株做氧氟沙星（OFLX）,左氧氟沙星（LVFX）药物敏感性试验。结果初治患者耐OFLX 10例（14.5%）,耐LVFX 3例（4.3%）;复治患者耐OFLX 30例（60.0%）,耐LVFX 22例（44.0%）;敏感菌耐OFLX 16例（19.0%）,耐LVFX 8例（9.5%）,耐药菌耐OFLX 24例（68.6%）,耐LVFX 17例（48.6%）;单耐药、多耐药、耐多药、严重耐多药耐OFLX分别为2例（40.0%）、10例（66.7%）、7例（77.8%）、5例（83.3%）,耐LVFX分别为2例（40.0%）、6例（40.0%）、5例（55.6%）、4例（66.7%）;氟喹诺酮用药时间≤2周、2周至1月、〉1-3月、〉3-6月、〉6月,耐OFLX分别为2例（33.3%）、4例（36.4%）、7例（50.0%）、9例（100%）、5例（100%）;耐LVFX分别为1例（16.7%）、2例（18.2%）、6例（42.9%）、6例（66.7%）、5例（100%）。结论复治结核病对氟喹诺酮的耐药率较高,耐药结核菌对氟喹诺酮耐药率也明显高于敏感菌,而严重耐多药及耐多药菌株耐药率明显高于其他耐药类型结核病。试管内耐药浓度与耐药率呈负相关。制定标准方案时LVFX优于OFLX。     

成都市结核分枝杆菌耐药状况分析

目的分析成都市近年一线抗结核药的耐药状况,为耐药结核病预防控制提供依据。方法对成都市2007年1月-2009年12月就诊的结核患者,临床分离株培养鉴定为结核分枝杆菌的菌株采用绝对浓度法进行一线抗结核药：链霉素（SM）、异烟肼（INH）、利福平（RF）、乙胺丁醇（EMB）耐药性检测,分析结核分枝杆菌的耐药情况。结果 1235例结核患者中,总耐药率和总耐多药率分别为28.83%、14.01%,初始耐药率和获得性耐药率分别为12.82%、61.27%。近3年耐多药率有下降趋势,但获得性耐药率呈逐年上升趋势。结论成都市结核耐药状况仍然比较严重,进一步加强耐药结核的监测和控制非常重要。     

斑点杂交法检测结核分枝杆菌的初步报告

目的建立一种快速、准确、简便的检测结核分枝杆菌的方法。方法异硫氰酸胍裂解、酚-氯仿抽提、异丙醇沉淀法直接抽提结核分枝杆菌rRNA,地高辛标记探针斑点杂交,酶呈色观察结果检测结核分枝杆菌,用该法检测76例临床标本。结果该法至少可检测1.6×102/m l个结核分枝杆菌;20种其它分枝杆菌和9种非分枝杆菌检测结果均为阴性;两份强阳性和弱阳性标本抽提结核分枝杆菌rRNA重复杂交5次,结果完全一致;46例肺结核病人痰标本检出阳性26例,30例非结核病人痰标本检测结果均为阴性。结论斑点杂交法检测结核分枝杆菌方法简便,无需特殊仪器,有较高的敏感度、特异性和良好的重复性,适合在基层医院推广使用。     

Xpert MTB/RIF检测痰标本结核分枝杆菌与利福平耐受性的临床应用研究

目的分析Xpert MTB/RIF方法用于临床快速检测结核分枝杆菌(MTB)与利福平耐受性的临床意义。方法收集2015年1-12月在惠州市结核病防治研究所及5个县区医院结核科就诊的肺结核患者痰标本552例,进行涂片镜检、Xpert MTB/RIF核酸检测和改良罗氏培养,并对培养阳性者进行药敏实验。评价各种方法 MTB检测灵敏度与特异度,对比传统药敏方法和Xpert MTB/RIF检测利福平耐药性的结果并分析。结果 Xpert MTB/RIF与改良罗氏培养法对MTB检测结果相比,敏感度95.3%、特异度93.1%;耐药性对比结果中,所有阳性标本中利福平耐药的敏感度82.1%,特异度97.8%;Xpert MTB/RIF检测MTB分级与改良罗氏培养分级一致性分析中,kappa=0.688,提示两者结果具有良好的一致性。结论 Xpert MTB/RIF可用于临床早期快速检测结核分枝杆菌与利福平耐药检测的筛查,有利于临床快速决策。     

痰耐药结核分支杆菌rpsL基因的快速检测及链霉素耐药机制研究

[目的]快速检测痰耐药结核分支杆菌rpsL基因及了解链霉素（SM）耐药的分子机制。[ 方法]用PCR方法直接从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpsL基因片段,对扩增获得的rpsL基因片段进行序列测定,比较分析全耐、对SM耐药的耐多药、对SM敏感的耐多药、全敏感或标准结核分支杆菌株之间的基因序列差异。[结果]于6h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpsL基因。从所有临床分离菌珠均扩增获得267bp片段,序列测定比较发现,全耐菌和对SM耐药的MDR—TB菌株均检测有rpsL基因点突变,突变密码子为CCT突变为CTT,而全敏感株和标准菌株均未检测到基因突变。其中从一株对SM敏感的MDR-TB中也检测到突变。[结果]PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分支杆菌rpsL基因及其突变,结核分支杆菌对EMB的耐药性与rpsL基因点突变有关。