日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3对日本血吸虫病的诊断价值

目的 探讨纯化的日本血吸虫(中国大陆株)重组信号蛋白14—3—3(rSjl4—3—3)诊断血吸虫病的价值。方法 利用纯化的rSjl4—3—3抗原与成虫抗原，间接EUSA法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清。结果 急、慢性血吸虫患者血清rSjl4—3—3抗体检出率为100％和92．0％，与正常人血清未出现交叉反应；抗AWA抗体检出率为98．0％和94．0％，与正常人有7．3％的交叉反应。结论 rSjl4—3—3为抗原诊断日本血吸虫病显示出高度的敏感性和特异性，具有实用价值。     

重组日本血吸虫26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶的表达、纯化及其免疫特性分析用于急性血吸虫病免疫诊断

目的将日本血吸虫(中国大陆株)26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶(26 ku SjGST)基因克隆入pET28a(+)并诱导表达26 ku rSjGST蛋白,纯化并用于急性血吸虫病免疫诊断.方法构建重组质粒pET28a-SjGST,转化到E.coli BL21,经IPTG诱导表达并进行SDS变性蛋白质电泳,以小鼠抗GST单克隆抗体为一抗,进行Western-blot分析.用His·BandPurification Kit亲和层析纯化重组蛋白,以此重组蛋白作为抗原,用ELISA法检测急性血吸虫患者血清和非流行区正常人血清. 结果成功地构建了重组质粒pET28a-SjGST,SDS变性蛋白质电泳显示可见一与预期分子量大小相符的特异蛋白条带的表达.Western blot分析表明,该重组蛋白能被小鼠抗GST单克隆抗体识别.ELISA结果表明,rSj GST用于急性血吸虫患者血清中抗体检测的阳性率为92.3%.结论 rSj GST得到表达和纯化,该重组蛋白用于急性血吸虫患者血清中抗体的检测具有良好的免疫反应性,为进一步探讨其在血吸虫病诊断中的应用奠定了基础.     

日本血吸虫14-3-3蛋白质编码基因在原核细胞中的表达

目的 :为了寻找日本血吸虫病新的诊断和候选疫苗分子 ,克隆日本血吸虫 14 -3 -3蛋白质编码基因 ,并进行表达。方法 :提取日本血吸虫成虫RNA ,设计合成引物 ,用RT -PCR法扩增出日本血吸虫 14 -3 -3抗原 (Sj14 -3 -3 )基因编码序列 ,将其克隆入pGEM -T载体 ,然后在真核表达载体 pBKCMV中亚克隆 ,用IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE观察表达结果。结果 :RT -PCR法扩增出一条大小约 765bp的特异性片断 ,克隆质粒pGEM -Sj14 -3 -3和真核表达质粒pBKCMV经双酶切和以重组质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段 ,诱导表达后 ,经SDS -PAGE可见一条约 3 2 5kDa大小的融合蛋白条带。结论 :本实验成功地克隆了日本血吸虫 14 -3 -3抗原的编码基因 ,并在原核细胞中进行表达 ,为进一步的免疫诊断和核酸疫苗研究奠定了基础。     

重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和免疫特性分析

目的：纯化日本血吸虫信号蛋白质14-3-3编码基因的原核表达产物。分析纯化产物的免疫学特性。方法：SDS-PAGE鉴定重组日本血吸虫14-3-3（rSj14-3-3)蛋白包涵体，超声破碎细胞收集包涵体。尿素溶解包涵体，NiSO4平衡层析柱，亲和层析纯化rSj14-3-3,Western-blot鉴定纯化产物的免疫学特性。结果：rSj14-3-3是以包涵体形式在大肠埃希菌中表达。通过亲和层析在32.5kDa附近得到单一蛋白条带，Western-blot证实纯化产物为rSj14-3-3，且具有与天然Sj14-3-3相同的抗原表位。结论：成功纯化了rSj14-3-3蛋白，为研究14-3-3在血吸虫信号转导中的作用奠定了基础。     

血吸虫14-3-3蛋白的免疫定位和功能

血吸虫病是一种遍及世界70多个国家、累及2亿多人口的地方性流行病，在我国约76万人受累。病原体为具有复杂生活史的血吸虫，其常见有6种，主要流行的是日本血吸虫(Sj)、曼氏血吸虫(Sm)及埃及血虫(Sh)，具有两个宿主，即人和淡水螺类。血吸虫的尾蚴穿透人的皮肤脱     

日本血吸虫14-3-3蛋白epsilon亚型基因扩增及表达载体的构建

目的　扩增日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建其表达载体 ,以研究其在血吸虫信号转导以及免疫预防和诊断方面的作用。方法　以日本血吸虫成虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链 ,设计合成引物 ,用PCR法扩增 1 4 3 3蛋白epsilon亚型基因编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体 ,双酶切和以质粒为模板的PCR鉴定后 ,将基因片段亚克隆入表达载体pBK CMV ,转染大肠杆菌BL2 1 ,经双酶切后鉴定。结果　RT PCR扩增出一条约 753bp的特异性条带 ,TA克隆重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT PCR扩增出大小相同条带 ,pBK Sj1 4 3 3表达载体经双酶切后也同样获得了一条约 753bp的特异性条带。 结论　在体外成功的扩增了日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建了 pBK Sj1 4 3 3表达载体 ,为进一步的免疫预防和免疫诊断研究提供了条件。     

抗Sj14-3-3特异性IgY的制备及其诊断日本血吸虫病循环抗原的价值

目的制备抗重组日本血吸虫信号转导蛋白14-3-3(Sj14-3-3)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),建立双抗体夹心ELISA诊断体系(IgY-ELISA),探讨用于日本血吸虫病的诊断价值。方法利用Sj14-3-3制备并纯化卵黄抗体IgY和兔多克隆IgG抗体;以IgG为捕获抗体,IgY为检测抗体建立双抗体夹心ELISA诊断方法,检测72例急性血吸虫病患者、128例慢性血吸虫病患者、132例正常人、42例肺吸虫患者、60例华支睾吸虫患者和46例钩虫感染者血清。探讨基于IgY的循环抗原检测的应用价值。结果成功制备并鉴定了抗Sj14-3-3特异性IgY和IgG抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测体系;检测急性血吸虫病患者和慢性血吸虫病患者血清的阳性率分别为73.6%和48.4%,正常人血清的阴性率为94.7%;与肺吸虫患者、华支睾吸虫患者、钩虫感染者血清的交叉反应分别为7.1%、6.7%、6.5%。结论建立了基于IgY的双抗体夹心ELISA检测体系,用于日本血吸虫病患者血清的检测具有较高的敏感性和特异性,可用于日本血吸虫病的辅助诊断。     

血吸虫14-3-3蛋白疫苗的研究现状

血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的76个国家和地区.采用疫苗防治该病是当前研究的热点领域,本文综述了血吸虫14-3-3的蛋白质疫苗、DNA疫苗、rBCG疫苗、重组酵母疫苗和Bm-sj14疫苗等方面的研究现状.     

HSV-1包膜糖蛋白G重组蛋白的纯化与抗原性分析

①目的纯化原核表达的HSV-1包膜糖蛋白G重组蛋白并对其抗原性进行分析。②方法应用亲和层析法纯化重组蛋白，Western印迹和ELISA法检测分析其抗原性。③结果Western-Blot，检测15份HSV-1 IgM阳性血清，其中12份血清可与重组蛋白发生反应；ELISA法检测535份血清，与商品化同类试剂盒相比符合率为89．7％．④结论该重组蛋白检测HSV-1活动性感染有较高的应用价值。     

14-3-3/HIP-55复合体增强HIP-55蛋白稳定性

目的:用双分子荧光互补及免疫共沉淀技术验证HIP-55与14-3-3在HEK293细胞中存在相互作用,并进一步研究其生物学意义. 方法:利用GATEWAY系统构建PDEST-N-Venus-HIP-55WT(野生型),PDEST-N-Venus-HIP-55AA(突变体S269A/T291A),PDEST-GST-HIP-55WT及PDEST-C-Venus-14-3-3τ重组质粒,利用双分子荧光互补及免疫共沉淀技术检测两者的相互作用,同时应用14-3-3蛋白相互作用抑制肽R18和HIP-55蛋白突变体( HIP-55AA突变体S269A/T291A不能与14-3-3相互作用)作为工具研究两者结合后对嘌呤霉素诱导的HIP-55蛋白表达的影响. 结果:外源转入的Venus-HIP-55WT、Venus-HIP-55AA及Venus-14-3-3蛋白能够在HEK293细胞中表达;双分子荧光互补实验结果表明HIP-55与14-3-3存在相互作用,HIP-55蛋白的S269/T291位点介导HIP-55与14-3-3的相互作用;免疫共沉淀技术表明内源性HIP-55与14-3-3存在相互作用;进一步研究发现HIP-55与14-3-3复合体增强HIP-55蛋白的稳定性,保护HIP-55不被降解. 结论:14-3-3与HIP-55存在相互作用,14-3-3/HIP-55复合体可以促进HIP-55蛋白的稳定性.     

循环抗原及血清抗体的联合检测诊断日本血吸虫病

目的探讨日本血吸虫信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3)在血吸虫病免疫诊断中的价值。方法制备并纯化抗重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)的单抗和多抗,并建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA);以纯化的rSj14-3-3建立间接ELISA,分别比较该两种方法以及两种方法联合检测对于急、慢性血吸虫病患者免疫诊断的特异性和敏感性。结果利用双抗体夹心ELISA、间接ELISA和联合检测3种方法检测急性患者血清70例,敏感性分别为72.9%、75.7%和91.4%;检测慢性患者血清110例,敏感性分别为46.4%、61.8%和82.7%;检测正常人血清100例,特异性分别为96%、92%和92%;吡喹酮治疗后患者血清161份,其中急性治疗后1年以内转阴率分别为50%、38.9%和33.3%;慢性治疗后1年内分别是76.4%、55.6%和43.1%;慢性治疗后2年以上分别为93.0%、83.0%和78.9%。3种方法检测华支睾吸虫病、钩虫病的交叉反应性分别为0%、15.6%和15.6%,8.7%、19.6%和21.7%。3种方法的敏感性、与华支睾吸虫感染者血清交叉反应、慢性治疗1年内及慢性治疗2年以上患者血清的转阴率差异具有显著性(P<0.05),而特异性、与钩虫感染者血清交叉反应及其他化疗后患者血清的转阴率差异无显著性(P>0.05)。结论循环抗原Sj14-3-3和抗体联合检测在日本血吸虫病免疫诊断中具有潜在的临床应用价值。     

重组弓形虫14-3-3抗原用于弓形虫血清抗体的检测

目的　探讨重组弓形虫信号转导蛋白14- 3- 3(Toxo14- 3- 3)在弓形虫病免疫诊断中的价值。方法　根据弓形虫Beverly株猫肠上皮细胞增殖阶段的14- 3 -3编码基因,设计合成引物,自RH株速殖子基因组克隆Toxo14- 3 -3的ORF,克隆pET 28a质粒,转化大肠杆菌,获得表达产物并纯化融合蛋白,以此抗原包被反应板进行ELISA检测,并与粗制抗原及市售试剂进行比较。结果　对400份血清标本的平行检测,Toxo14 -3 -3抗原、粗制抗原和市售试剂盒的阳性率分别为2 5%、3 0%和3 .25%,三者之间差异无显著性(P>0 .05);三者之间的符合率为99 0%、98.8%和99 .0%,差异无显著性(P>0. 05 )。结论　重组Toxo14 -3- 3抗原检测弓形虫血清抗体具有潜在价值。     

Hsp70-2及14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义

目的检测Heat shock protein 70-2(Hsp70-2)及14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BUC)组织中的表达,探讨两者在肿瘤发展中的作用及临床意义。方法收集人膀胱尿路上皮癌标本48例,膀胱尿路上皮癌旁组织标本20例,利用免疫组织化学S-P法、Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Hsp70-2、14-3-3zeta在蛋白水平和mRNA水平的表达,分析两者与膀胱尿路上皮癌的病理分级、临床分期等因素间的关系。结果 3种检测方法均显示Hsp70-2、14-3-3zeta在癌旁组织中低表达,在膀胱尿路上皮癌组织中高表达,其表达量随病理分级程度及浸润深度增高而增高,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Hsp70-2与14-3-3zeta蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达均增高,两者呈正相关(r=0.516,P<0.05)。结论 Hsp70-2与14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌组织中高表达,与病理分级,临床分期呈正相关,且两者之间也呈正相关,提示两者在肿瘤发生、发展过程中起重要作用。     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建并研究日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法从日本血吸虫成虫组织提取总RNA;RT-PCR扩增Sj14-3-3编码基因;将此基因克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3;转化入DE3中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出399bp的Sj14-3-3编码基因;并成功将其插入pGEX-1λT构建了重组质粒pGEX-Sj14-3-3;SDS-PAGE显示相对分子质量约为40 000的重组蛋白,与预期结果相符,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3构建成功,重组质粒在大肠埃希菌BL21中可较高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

14—3—3蛋白

14-3-3是一个在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族，主要以同源／异源二聚体形式存在，通过磷酸化丝／苏氨酸作用与靶蛋白或靶蛋白的两个结构域结合。七种不同亚型的高度保守的14-3-3蛋白与人类细胞中多种不同的信号通路有着密切的关系。14-3-3通过调节靶蛋白间的相互作用在MAPK级联放大效应等信号转导途径中发挥调控作用。     

间接酶联免疫吸附试验测定恶性肿瘤血清中核糖核酸酶抑制因子表达的研究

目的:探讨间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测核糖核酸酶抑制因子(RI)在恶性肿瘤患者血清中的表达。方法:建立检测血清RI含量的间接ELISA法,检测和比较正常人、恶性肿瘤患者(乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌)、乳腺良性肿瘤患者血清中RI的表达水平。结果:所建立的间接ELISA法特异性高;恶性肿瘤患者血清中RI表达均明显低于正常人(P<0.05),乳腺癌亦明显低于乳腺良性肿瘤(P<0.05)。结论:RI表达的降低可以作为肿瘤良、恶性鉴别的指标之一。     

TP-ELISA诊断梅毒螺旋体感染的可行性评价

目的使用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法诊断梅毒螺旋体感染的可行性.方法用目前国内最常用的诊断梅毒螺旋体感染的TRUST试剂及ELISA试剂检测63例梅毒患者和22例自身免疫性疾病患者的血清样本,同时与梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)的检测结果进行比较,从而得到各试剂的假阴性率和假阳性率.结果对63份阳性和22份阴性样本的检测中,所用TRUST试剂的假阴性率和假阳性率分别为28.57%、18.18%;TP-ELISA试剂的假阴性率和假阳性率分别为0%和0%.结论使用灵敏特异的ELISA方法诊断梅毒螺旋体感染是可行的.