人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率

目的：构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体，并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率。方法：实验于2004-03／2005-04在第三军医大学完成。采用基因工程技术，将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上，利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组，经293细胞包装、扩增，得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒，将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定，利用绿色荧光报告基因转染结果，以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度，应用Westernblot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达。结果：①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功，病毒滴度可达2．5&;#215;10^9pfu／mL，具有很强感染能力。②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48h，Westernblot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达。结论：应用细菌内同源重组法，可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体，且能高效转染大鼠骨髓基质细胞。     

人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率

目的:构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体,并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率。方法:实验于2004-03/2005-04在第三军医大学完成。采用基因工程技术,将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒,将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度,应用Westernblot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达。结果:①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度可达2.5×109pfu/mL,具有很强感染能力。②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48h,Westernblot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达。结论:应用细菌内同源重组法,可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体,且能高效转染大鼠骨髓基质细胞。     

超声介导重组腺相关病毒载体心肌靶向转染对大鼠左室心功能的影响

目的 探讨超声造影剂介导下重组腺相关病毒载体(rAAV2-GFP)心肌靶向转染前后大鼠左室心肌功能的变化.方法 健康成年SD大鼠20只,随机分为对照组与实验组:对照组尾静脉注射超声造影剂+超声照射;实验组注射携带rAAV2-GFP造影剂+超声照射.分别于实验前和实验后14 d利用斑点追踪技术测量大鼠周向应变、收缩期应变率,舒张期应变率、扭转角度,并同时测量大鼠射血分数、短轴缩短率、舒张末期容积及收缩末期容积等左心功能指标.行心肌组织冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP的表达情况.结果 超声介导重组腺相关病毒心肌靶向转染前后大鼠左室心肌功能指标及相对于心底水平的扭转角度及达峰时间的差异均无统计学意义(P>0.05).结论 超声及超声造影剂介导重组腺相关病毒载体靶向转染心肌组织对大鼠左室心肌功能无影响.     

超声介导重组腺相关病毒载体心肌靶向转染对大鼠左室心功能的影响

目的 探讨超声造影剂介导下重组腺相关病毒载体(rAAV2-GFP)心肌靶向转染前后大鼠左室心肌功能的变化.方法 健康成年SD大鼠20只,随机分为对照组与实验组:对照组尾静脉注射超声造影剂+超声照射;实验组注射携带rAAV2-GFP造影剂+超声照射.分别于实验前和实验后14 d利用斑点追踪技术测量大鼠周向应变、收缩期应变率,舒张期应变率、扭转角度,并同时测量大鼠射血分数、短轴缩短率、舒张末期容积及收缩末期容积等左心功能指标.行心肌组织冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP的表达情况.结果 超声介导重组腺相关病毒心肌靶向转染前后大鼠左室心肌功能指标及相对于心底水平的扭转角度及达峰时间的差异均无统计学意义(P>0.05).结论 超声及超声造影剂介导重组腺相关病毒载体靶向转染心肌组织对大鼠左室心肌功能无影响.     

超声辐照声诺维与重组腺相关病毒经不同途径转染大鼠视网膜的实验研究

目的 探讨超声辐照微泡造影剂声诺维(SonoVue)能否增强rAAV2-EGFP转染视网膜的效率.方法 62只Wistar大鼠进行玻璃体腔(10只)及视网膜下(52只)注射.实验分组:病毒+生理盐水、病毒+微泡、病毒+生理盐水+超声辐照和病毒+微泡+超卢辐照.第4、7、35、49、120 d分别用荧光体视镜观察,利用软件进行定量分析,并进行组织切片光镜检查.结果 玻璃体腔注射组持续观察2个月未见荧光;视网膜下注射组的超声辐照微泡组在第4、7、35 d较其他组转染效率高,超声辐照微泡造影剂对眼底组织无明显损伤.结论 超声辐照SonoVue可在体内促进rAAV2-EGFP转染大鼠视网膜.     

ATP7B基因重组腺病毒载体对肝豆状核变性患者肝细胞的影响

目的研究腺病毒介导的ATP7B基因转染肝豆状核变性(Wilson)患者的肝细胞后,ATP7B在肝细胞内的表达及生物学活性。方法 ATP7B基因重组腺病毒载体转染体外培养的Wilson患者肝细胞,观测绿色荧光在肝细胞内的表达,以细胞免疫化学技术和ELISA等方法检测ATP7B蛋白在细胞内、外的表达情况。结果经转染后肝细胞能成功合成ATP7B蛋白,其表达量在转染后的3～5 d达到高峰,14 d后表达显著下降。结论携带ATP7B目的基因的重组腺病毒载体经转染后能在Wilson病离体肝细胞中成功表达。     

血红素氧合酶-1基因转染对大鼠心肌缺血/再灌注损伤诱导心肌细胞凋亡的影响

目的 探讨重组腺相关病毒(rAAV)介导大鼠血红素氧合酶-1(rHO-1)基因转染对心肌缺血/再灌注(I/R)损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响.方法 95只体重225～250 g的雄性SD大鼠随机分为假手术组(SO组,n=8)、生理盐水组(NS组,,n=29)、rAAV-荧光蛋白组(rAAV-EGFP组,n=29)及rAAV-rHO-1组(n=29).NS组、rAAV-EGFP组和rAAV-rHO-1组分别于大鼠左心室前后壁共取4点分别注入生理盐水、rAAV-EGFP或rAAV-rHO-1病毒液共600 μl.在基因转染后3个月,各组处死3只大鼠,取注射部位心肌,荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达并计算转染率;用免疫组化染色和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HO一1的蛋白和mRNA表达.采用结扎左冠状动脉前降支30 min、再灌注120 min建立心肌I/R模型;成模后处死大鼠测定其心肌梗死面及心肌细胞凋亡指数(AI),光镜下观察心肌组织病理学改变.结果 荧光显微镜下仅rAAV-EGFP组可见心肌有荧光蛋白表达,转染率为(53.5±2.0)%.与SO组比较,NS组、rAAV-EGFP组和rAAV-rHO-1组Al增加(P均<0.01),与NS组和rAAV-EGFP组比较,rAAV-rHO-1组HO-1的蛋白及mRNA表达增加,心肌梗死面积减小,A1减少(P均<0.01);NS组及rAAV-EGFP组心肌组织病理学损伤较SO组和rAAV-rHO-1组为重.NS组与rAAV-EGFP组间上述指标比较无统计学意义.结论 rAAV介导的rHO-1基因转染大鼠心肌细胞后,能够显著减少心肌细胞凋亡,从而减轻心肌I/R损伤.     

重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定

目的 探讨构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺病毒载体,为进一步的基因转染构建组织工程骨的血管化提供实验基础.方法 采用RT-PCR扩增的方法获得人源性的hVEGF165,并克隆入穿梭质粒pAdTraek CMV.构建的质粒pAdTrack CMV-VEGF165经酶切及测序鉴定正确后,通过pAdeasy 1质粒的介导与腺病毒包装质粒pAdTrack CMV.VEGF165共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后获得携带人VEGF的重组腺病毒pAdTrack CMV.VEGF165.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,测定病毒滴度.结果 PCR鉴定证实重组腺病毒含有人VEGF,病毒滴度为0.5×10"pfu/ml.结论 成功构建的携带人VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,为基因治疗构建组织工程骨血管化的研究奠定基础.     

脑源性神经营养因子基因重组腺病毒体外转染胚胎大鼠神经干细胞及其鉴定

目的：以脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）基因重组腺病毒体外转染神经干细胞,建立能稳定表达BDNF的神经干细胞系,为下一步的动物实验提供材料。方法：（1）分离SD 大鼠胎鼠的间脑,加入神经生长因子表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在神经干细胞条件培养基中克隆培养。用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。（2）用BDNF基因重组腺病毒转染神经干细胞,并通过RT-PCR和Western-blot实验检测外源性BDNF基因的表达。结果：（1）分离培养出了大量具有不断增殖能力、表达神经巢蛋白的神经干细胞,并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞。（2）60%～70%的神经干细胞感染BDNF基因重组腺病毒,Western-blot及RT-PCR实验显示BDNF大量表达。结论：本试验成功建立了神经干细胞的分离培养方法及能长期稳定表达BDNF的神经干细胞系。[著者文摘]     

电针刺内关穴对体外循环大鼠心肌的保护作用

目的研究电针刺内关穴对大鼠体外循环（CPB）后白细胞黏附分子的调节和对心肌细胞凋亡的作用，从而探讨电针刺对体外循环后心肌保护作用的机制。方法30只大鼠随机分为3组，对照组、体外循环组（CPB组）和针刺内关组（EA组）。体外循环组采用MackensenGB的方法建立大鼠的体外循环模型；电针刺组采用电针刺双侧内关穴并维持到术后1h。术中采血血气分析，流式细胞仪全血法测定白细胞表面CDllb表达，术后取心肌PT—PCR测定Bcl-2和BaxmRNA表达，Western印迹分析Bcl-2和Bax蛋白含量，并采用TUNEL法观察细胞凋亡。结果大鼠体外循环停循环后的不同时点白细胞（PMN）表面的黏附分子CD11b表达均明显升高，EA组PMN表面的黏附分子CD11b的表达明显下降。CPB后大鼠心肌细胞Bcl-2和BaxmRNA表达明显增强，EA组凋亡相关基因BaxmRNA表达明显降低，Bcl-2mRNA表达明显增加。CPB组心肌组织Bcl-2和Bax蛋白含量显著增高，EA组Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达明显增加。CPB组心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡数明显增加，EA组心肌凋亡细胞数与心肌缺血组相比明显减轻。结论电针内关穴可通过抑制凋亡，减轻体外循环下心肌组织的病理损伤，抑制炎症细胞的黏附，从而产生心肌保护作用。     

超声介导下重组腺相关病毒载体转染心肌的最佳滴度的实验研究

目的 探讨超声促进携带增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)的重组腺相关病毒载体2(rAAV2)心肌转染过程中rAAV2的最佳滴度.方法 健康成年SD大鼠21只随机分为实验组与对照组.实验组给予连接于SonoVue微泡表面的rAAV2-EGFP尾静脉注入,滴度为1.5×109～3.0×101111 vg/ml(virus genome/ml),超声爆破造影剂,促进rAAV2-EGFP心肌内转染.对照组只给予尾静脉注射造影剂并超声爆破(无rAAV2-EGFP).2周后处死大鼠并制作心肌组织冰冻切片.荧光显微镜下检测荧光蛋白的表达量,代表rAAV2转染率.结果 随着注入的rAAV2滴度的增加,心肌内荧光表达量亦增加,至滴度达到1.5×1011vg/ml时荧光的表达量显著增加(P<0.01).结论 促进心肌组织转染的rAAV2的最佳滴度为1.5×1011vg/ml.     

超声靶向微泡破裂联合PEI增强小鼠EGFP基因心肌转染

目的探讨超声靶向微泡破裂(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)增强BALB/c小鼠心肌绿色荧光蛋白基因(EG-FP)转染的可行性和应用价值。方法实验分为7组:PBS组、裸质粒组、质粒 超声辐照组(P US)、质粒 SonoVue 超声辐照组(P UTMD)、质粒 PEI组(P PEI)、质粒 PEI 超声辐照组(P PEI US)、质粒 PEI SonoVue 超声辐照组(P PEI UTMD)。由BALB/c小鼠尾静脉注入EGFP质粒和SonoVue微泡或PEI的复合物,处理4d后检测心肌基因表达效率及HE染色,并对超声辐照后的质粒完整性进行分析。结果电泳显示超声辐照不会损坏DNA或PEI/DNA复合物。非超声辐照时,EGFP只在心内膜下层表达;而超声辐照时,表达最强的位置为靠近探头的左室前壁;超声联合PEI时,EGFP的分布差异不明显。P PEI UTMD组的转染率最高,荧光强度最强。结论UTMD联合PEI可高效、靶向地将质粒DNA输送至心肌,这种非侵入性的技术在心脏基因治疗上很有前景,有望应用于迅速发展的心脏病基因疗法。     

硫化氢后处理抑制大鼠心肌损伤的机制研究

【目的】探讨硫化氢后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。【方法】健康成年S‐D雄性大鼠30只,随机分成3组,每组10只。假手术组（S组）仅开胸并分离冠状动脉左前降支,但不阻断血流150 min;缺血再灌注组（IR组）行冠状动脉左前降支阻断30 min ,再灌注120 min;硫化氢后处理组（H组）于开放左冠状动脉即刻1 min内静推硫化氢0．05 mg／kg ,再灌注120 min。再灌注末抽血测肌酸激酶同工酶（CK‐MB）水平,免疫印迹法测心肌过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR‐γ）的表达。【结果】和IR组相比,H组血清中CK‐MB的含量降低,PPAR‐γ表达增高,且两组相比较差异有显著性（ P ＜0．05）。【结论】硫化氢后处理有心肌保护作用,可能与其促进心肌PPAR‐γ表达有关。     

结缔组织生长因子在糖尿病大鼠肾脏中的表达

目的 通过观察结缔组织生长因子（CTGF）在糖尿病大鼠肾脏中表达的动态改变,探讨CTGF在糖尿病肾病发生发展中的作用。方法 尾静脉内注射链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病大鼠模型。采用RT-PCR和Western blot检测1个月、3个月和6个月时糖尿病大鼠肾脏组织中CTGF的mRNA和蛋白的表达。光镜下观察糖尿病大鼠不同时期肾脏组织形态学的改变。结果 糖尿病大鼠1个月、3个月和6个月与同期对照大鼠相比,肾脏CTGF的mRNA表达上调,分别为对照组的1.56倍、2.05倍和3.74倍（P〈0.01）;同时蛋白表达亦上调,分别为对照组的2.48倍、2.93倍和5.82倍（P〈0.01）;此外,糖尿病6个月大鼠的CTGF mRNA和蛋白的表达明显高于糖尿病1个月和3个月大鼠的表达水平（P〈0.01）。组织形态学观察表明,糖尿病大鼠3个月时肾脏出现基膜增厚、肾小球扩张等糖尿病肾病早期的病理改变,随着病程的延长,病理改变越严重;6个月时出现肾小球硬化、肾间质纤维化等晚期的改变。结论 糖尿病大鼠早期肾脏已存在CTGF基因表达上调,在糖尿病肾病的发展过程中,CTGF基因表达上调仍持续存在。因此,CTGF基因表达上调在糖尿病肾病的发生发展中起着重要作用。     

SD大鼠胚胎体外培养及TALEN质粒内源活性检测的研究

目的建立Sprague-Dawley（SD）大鼠1-细胞胚胎体外培养体系,并用于TALEN质粒内源活性检测。方法超排4～6周龄雌鼠,取0．5dpc雌鼠受精卵。将构建的TALEN质粒体外转录为mRNA后显微注射于受精卵胞质中,将注射成功的受精卵培养于mR2ECM培养液中。巢式PCR扩增目的基因,送测序检测TALEN质粒的敲除效率。结果取出的1-细胞胚胎在mR2ECM培养液中最大程度能发育到8-细胞胚胎;培养液的pH值影响了胚胎的发育程度,过滤前pa值7．18±0．12的培养液,胚胎8细胞发育率较高。本研究送检三批显微注射后体外培养的胚胎,检测结果表明胚胎发育至4细胞以上时,mRNA已经能够充分表达和发挥敲除作用,TALEN质粒的敲除效率为（9．3±2．8）％。结论建立SD大鼠1-细胞胚胎体外培养的体系,且将其成功应用于TALEN质粒内源活性检测。     

三七总皂苷联合氨基胍治疗对糖尿病大鼠肾组织非酶糖基化的影响

目的 探讨三七总皂苷（PNS）联合氨基胍（AG）对糖尿病（DM）大鼠肾脏的保护作用及其可能机制。方法 以链脲佐菌素（STZ）诱导DM大鼠模型,并随机分成DM模型组（D组）、PNS治疗组（P组）、AG治疗组（A组）和联合治疗组（P＋A组）,同时设立正常对照组（N组）。分别于第4、8周末应用荧光光谱法测定血清和肾皮质晚期糖基化终产物（AGEs）含量,行肾组织PAS染色测定肾小球平均截面积（MGA）,并计算出肾小球平均体积（MGV）。同时检测血糖、尿量、24 h尿蛋白定量、肾功能,并测量体重、肾重、肾重/体重比值等。结果 （1）P＋A组体重高于D组（P＜0.05）,而肾重、肾重/体重比值、尿蛋白定量、CCr、血清和肾皮质AGEs、MGA和MGV均低于D组（P＜0.01和P＜0.05）;（2）P组CCr、血清和肾皮质AGEs、MGA、MGV、8周末时肾重/体重比值及4周末时尿蛋白定量均低于D组（P＜0.01和P＜0.05）;（3）A组CCr、血清AGEs、MGA 、MGV和8周末时肾皮质AGEs均低于D组（P＜0.01和P＜0.05）;（4）P＋A组血清AGEs低于P、A组（P＜0.01和P＜0.05）,肾皮质AGEs低于P组4周末时和A组（P＜0.05）,而8周末时MGA和MGV低于P、A组（P＜0.05）,肾重/体重比值低于A组（P＜0.05）。结论 PNS和AG均能通过减少肾组织中AGEs的生成,对DM大鼠肾脏起保护作用。二者联用肾保护作用优于单一药物治疗。     

恒定均匀磁场对异丙肾上腺素引起的大鼠心肌损伤的影响

目的观察恒定均匀磁场对异丙肾上腺素(ISO)致急性心肌损伤的影响.方法用注射ISO造成急性心肌损伤的动物模型,观察磁场对心肌组织丙二醛(MDA)及ATP、血红细胞超氧化物歧化酶(SOD)、血肌酸磷酸激酶(CK)及对心肌组织损伤的影响.结果磁场组SOD活力及ATP分别为(607.4±98.6)U/g@HB-1、(4.2±0.7)nmo/mg@ww-1,显著高于ISO组的(443.5±91.2)U/g@HB-1、(3.1±0.6)nmol/mg@ww-1(P＜0.01).磁场组MDA、CK水平分别为(61.3±7.9)nmol/mg@ww-1、(732.4±189.3)U/L,显著低于ISO组的(98.6±11.4)nmol/mg@www-1、(1358.9±231.5)U/L.同时磁场组的组织损伤较轻.结论恒定均匀磁场能有效地抑制ISO致动物心肌损伤,对心肌有一定的保护作用.