pEGFPN1-GDNF真核表达载体的构建及其表达

目的 构建人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因真核表达载体并观察其在COS-7细胞内的表达.方法 应用RT-PCR从U251细胞总RNA中扩增GDNF cDNA,将其克隆至真核表达载体pEGFPN1,经酶切鉴定及序列分析后,以Fugene HD介导转染COS-7细胞,应用免疫细胞化学和Western blot鉴定其在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经双酶切产生650bp和4.7kb的片段,测序分析结果与文献报道结果完全一致.将其转染COS-7细胞后,免疫细胞化学、Western blot结果表明GDNF蛋白能在COS-7细胞中正确表达.结论 成功构建了pEGFPN1-GDNF真核表达载体,为进一步开展帕金森病的基因治疗研究奠定了基础.     

分子伴侣辅因子热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白真核表达载体pDsRed2-N1(+)/CHIP构建及在COS-7细胞中的表达*******

背景：热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白与许多神经退行性疾病的相关蛋白质存在相互作用,并促进这些蛋白质的降解,因此对热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白功能的研究具有非常重要的意义。 目的：构建分子伴侣辅因子热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白真核表达载体pDsRed2-N1(+)/CHIP,检测其转染COS-7细胞后的表达。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-05/2008-02在广东省人民医院医学研究中心完成。 材料：大肠杆菌E coli DH5α,质粒pDsRed2-N1(+)为广东省人民医院医学研究中心肖定璋主任馈赠;人cDNA文库为中南大学湘雅医院神经内科馈赠。 方法：用聚合酶链反应方法从人cDNA文库DNA中扩增热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白全长cDNA,该基因片段两端设计了Hind Ⅲ 和BamH Ⅰ限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白的cDNA构建到真核表达载体pDsRed2-N1(+)上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48 h后利用反转录-聚合酶链反应和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。 主要观察指标：①热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白 cDNA扩增产物检测。②pDsRed2-N1(+)/CHIP重组体酶切鉴定。③反转录-聚合酶链反应。④免疫荧光及Western-blotting。 结果：经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,聚合酶链反应获得的片段与GenBank中登记的热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白序列完全相同;pDsRed2-N1/CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48 h后的COS-7细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白的表达。 结论：热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。     

外源EGFP和hTH基因在恒河猴骨髓源神经干细胞内的稳定表达

目的构建携带人酪氨酸羟化酶(hTH)的荧光真核表达质粒-pEGFP-C2-hTH,转染骨髓基质细胞源神经干细胞(BMSCs-D-NSCs),观察外源EGFP和hTH基因在BMSCs-D-NSCs中的表达情况。方法应用基因重组技术,将pWAV2-TH中的TH目的基因亚克隆到荧光真核表达载体 pEGFP-C2,以酶切和测序鉴定重组质粒pEGFP-C2-hTH的正确性:pEGFP-C2-hTH经NucleofectorTM 核转染仪转染培养的恒河猴BMSCs-D-NSCs,24 h后观察绿色荧光蛋白的瞬时表达情况,10 d后行 TH单克隆抗体的免疫组化和TH基因的RT-PCR。结果 (1)酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性;(2)细胞转染24 h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达,观察到 80％的转染细胞发出绿色荧光;转染10 d后细胞的RT-PCR检测到hTH基因的表达,TH单克隆抗体免疫组化结果显示转染细胞呈阳性染色,同时在荧光显微镜下观察到绿色荧光。结论构建的 hTH荧光真核表达重组质粒pEGFP-C2-hTH,经电转染方法转染至BMSCs-D-NSCs内,成功表达hTH 和EGFP,为BMSCs-D-NSCs基因治疗提供了实验基础。     

人AChR-Fc融合蛋白真核表达载体的构建和表达

目的构建含人AChRα1亚单位胞外段(Hα1-210)-IgG1Fc融合基因的真核表达载体,表达人AChR-Fc融合蛋白。方法扩增Hα1-210基因,插入含有CMV启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgG1从铰链区到CH3基因片段的真核表达载体pAN1782中,构建重组表达载体pAN-Hα1-210,并经酶切、测序鉴定;采用脂质体法将重组载体转染CHO-K1细胞,经G418加压筛选、ELISA检测,挑选高表达融合蛋白的阳性转化子扩大培养;表达的AChR-Fc融合蛋白经Protein A亲和层析柱纯化,SDS-PAGE、Western blot鉴定。结果酶切及测序结果证实Hα1-210基因序列正确,真核表达载体pAN-Hα1-210构建成功;ELISA检测证实AChR-Fc融合蛋白在细胞培养上清中呈分泌表达;SDS-PAGE结果显示该融合蛋白的相对分子质量约为51 000;Western blot结果显示该融合蛋白能被特异性单克隆抗体mAb198所识别。结论成功构建pAN-Hα1-210真核表达载体,并获得具有生物活性的AChR-Fc融合蛋白,为进一步开展融合蛋白靶向B细胞治疗重症肌无力的研究奠定了基础。     

pEGFP-N1-APOE ε2重组质粒的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1-APOEε2真核表达重组质粒。方法应用基因定点突变手段,根据载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因cDNA克隆基因序列和表达载体增强绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-N1)质粒上的多克隆位点设计引物,对质粒APOE基因cDNA克隆(pMD18-T-APOE3)进行基因定点突变,得到含有APOE2基因的目的片段,将此目的片段插入载体启动子下游,与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因融合。重组质粒经菌液PCR、限制性内切酶酶切和测序,鉴定目的基因是否成功插入pEGFP-N1质粒。结果对所得pEGFP-N1-APOEε2质粒插入部分测序结果显示,pEGFP-N1-APOEε2质粒的方向及序列正确,阅读框正确无误,表明APOEε2基因定点突变正确,重组pEGFP-N1-APOEε2质粒构建成功。结论成功构建了pEGFP-N1-APOEε2真核表达重组质粒。     

亨廷顿舞蹈病的IT15基因片段真核表达载体构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达定位

目的 构建亨廷顿舞蹈病的致病基因IT15基因片段的真核表达载体,观察其在SH-SY5Y细胞内的表达分布情况.方法 以PCR方法扩增出健康人和亨廷顿舞蹈病患者的IT15基因1号外显子片段,应用基因重组技术与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合构建以GFP为报告基因的重组真核表达质粒GFP-Htt-19Q与GFP-mHtt-70Q,并经酶切分析和测序证实.利用脂质体瞬时转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞;Western blot证实亨廷顿蛋白氨基末端片段在SH-SY5Y细胞内表达;荧光显微镜观察正常与变异亨廷顿蛋白氨基末端片段在细胞内的表达定位情况.结果 健康人和亨廷顿舞蹈病患者的IT15基因1号外显子的PCR产物分别为170、310 bp的特异性片段;重组体GFP-Htt-199与GFP-mHtt-70Q经测序分析读码框正确,转染SH-SY5Y细胞后发现正常亨廷顿蛋白氨基末端片段弥散分布于胞质内,胞核内少见,而变异亨廷顿蛋白氨基末端片段在核周及核内形成聚集物.结论 构建IT15基因片段真核表达载体是研究亨廷顿舞蹈病的发病机制的有效方法之一;变异亨廷顿蛋白氨基末端片段在核周及核内形成聚集物可能是亨廷顿舞蹈病致病的关键.     

部分性发作癫痫相关SCN1A基因M145fsX148突变体的构建及亚细胞定位

目的 构建部分性发作癫痫SCN1A基因M145fsX148突变体与黄色荧光蛋白(YFP)融合基因表达载体pCMV-YFP-MuSCN1A,观察其在人类神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞中的亚细胞定位.方法 应用基因重组技术,构建YFP与部分性癫痫SCN1A基因M145fsX148融合表达质粒载体,脂质体法转染技术将其与荧光真核表达载体pECFP-ER共转入SH-SY5Y细胞,采用激光扫描共聚焦显微镜观察其亚细胞定位情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序分析证实构建成功,激光扫描共聚焦显微镜显示重组真核表达载体pCMV-YFP-MuSCN1A主要在SH-SY5Y细胞胞质中表达.结论 成功构建部分性发作癫痫相关SCN1A基因M145fsX148突变体与YFP融合基因质粒载体,实验显示其在SH-SY5Y细胞胞质中表达,为该突变基因的进一步研究奠定了基础.     

Der p 2基因真核表达载体构建及其在小鼠树突状细胞中的表达

背景：树突状细胞是目前已知的最强大的抗原提呈细胞，已经被应用于免疫治疗的研究中。 目的：构建Der p 2真核表达载体，并证明能在小鼠骨髓来源的树突状细胞中表达。 设计、时间及地点：单一样本观察，实验于2005-05/12在解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所完成。 材料：C57BL/6小鼠；plambd-Der p 2购自美国HESKA公司；pCI-neo质粒为解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所保存。 方法：体外分离，培养小鼠骨髓来源树突状细胞。将原核表达质粒plambdDer p 2携带的Der p 2全长cDNA切下，重组到真核表达质粒pCI-neo中，然后在脂质体介导下，将重组质粒转染到小鼠骨髓来源的树突状细胞，以未转染质粒和转染空白载体pCI-neo的树突状细胞为对照。 主要观察指标：①pCI-neoDer p 2重组质粒结构鉴定。②并用反转录-聚合酶链反应、Western Blot检测Der p 2mRNA和蛋白表达。 结果：测序证实构建的重组质粒中携带了Der p 2的全长cDNA序列，且与Gene Bank序列完全一致。反转录-聚合酶链反应和Western Blot检测结果提示，重组质粒转染的树突状细胞能表达Der p 2 mRNA和Der p 2蛋白。 结论：成功构建重组Der p 2基因真核表达载体，其转染树突状细胞后，能有效地表达于树突状细胞中。     

重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及大鼠胚胎神经干细胞转染的研究

目的 探讨携带GDNF基因的神经干细胞表达载体的构建方法。方法 采用RT-PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的全序列cDNA,并克隆到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中,经酶切鉴定及测序分析对重组质粒pEGFP-GDNF作进一步鉴定。采用阳离子脂质体将重组质粒pEGFP-GDNF转染至鼠胚胎神经干细胞。结果 大鼠GD-NF cDNA已正确地克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,而构建成重组大鼠质粒pEGFP-GDNF,GDNF基因在细胞中可稳定表达。结论 神经干细胞可直接作为基因靶细胞,能被GDNF真核细胞表达载体pEGFP-GDNF有效的感染。     

白介素-18基因修饰人脑胶质瘤U87／hIL-18细胞的建立

目的构建人白介素18（hIL-18）基因真核表达载体质粒,建立hIL-18基因修饰并星稳定表达的人脑胶质瘤U87／hIL-18细胞。方法从人淋巴细胞cDNA文库钓取hIL-18基因后行PCR扩增,利用pcDNA3．1（＋）质粒为载体,构建hIL—18真核表达质粒pcDNA3．1／hIL-18。将构建的重组质粒转染人胶质瘤细胞U87,采用G418筛选单克隆细胞株,ELISA检测培养上清中的hIL-18蛋白含量,提取细胞RNA,RT—PCR方法检测hIL-18基因在U87／hIL-18细胞中的表达。结果所得hIL-18 cDNA序列与GeneBank比对一致,构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。质粒转染U87细胞后,经加压筛选获得hIL-18基因稳定、高效表达的U87／hIL-18单克隆细胞株,细胞培养72h的上清中,hIL—18蛋白含量达131．2pg／ml,且RT—PCR结果显示细胞中hIL-18基因表达呈阳性。结论成功构建hIL-18真核表达质粒pcDNA3．1/hIL-18,并建立U87／hIL-18单克隆细胞株,为hIL-18基因修饰的胶质瘤疫苗研究打下了基础。     

Atrophin—1全长基因稳定转染和瞬时转染真核细胞系的表达分析

目的建立正常（CAG重复次数为19次）和异常（CAG重复次数为82和66次）atrophin-1[齿状核红核苍白球路易体萎缩（DRPLA）致病基因]全长基因真核表达体系,通过观察细胞形态及蛋白质表达水平和分布情况,比较稳定转染和瞬时转染两种细胞表达体系,为进一步研究建立良好的细胞模型。方法基于已构建的GFP-atrophin-1．019／Flp—In TREx293和GFP—atrophin-1-Q82／Flp—InTREx293两种稳定转染细胞株,利用四环素调控系统Tet—on诱导表达。正置荧光显微镜观察正常与异常atrophin-1融合蛋白在细胞中的表达定位,电子显微镜观察细胞超微结构的改变;脂质体介导法将重组真核表达质粒GFP—atrophin-1-Q19和GFP—atrophin-1-Q66瞬时转染293T和SH—SY5Y细胞,HE染色、倒置荧光显微镜和电子显微镜分别观察细胞形态结构、蛋白质表达定位和细胞超微结构,Western blotting检测atrophin-1融合蛋白表达水平。结果在稳定转染体系中,绿色荧光信号大多位于细胞核内,异常蛋白质呈不均匀分布且有少数聚集现象;电子显微镜观察异常细胞胞核结构欠完整,核膜皱缩,核内结构紊乱。在瞬时转染293T细胞体系中,HE染色可见异常细胞核内形成粉紫色嗜酸性小体;大量atrophin-1融合蛋白在核内呈点状聚集现象;电子显微镜观察异常细胞核膜皱缩严重,核内大量电子致密物沉积且核仁消失;Western blotting检测均表达atrophin-1融合蛋白。在转染的SH-SY5Y细胞体系中,蛋白质表达定位及Western bloning检测结果与转染293T细胞基本一致。结论包含异常扩增多聚谷氨酰胺链的atrophin-1融合蛋白在真核表达体系中可产生明显的核内聚集现象,并引起细胞形态改变,此为研究DRPLA核内包涵体的形成及其在发病中的作用,以及进一步的干预治疗奠定了理论基础。     

蛋白酶体抑制剂诱导帕金森病PINK1蛋白聚集物的形成与特征

目的研究在蛋白酶体抑制剂作用下，帕金森病PINK1蛋白聚集物的形成及其特征。方法应用PCR从胎脑cDNA文库扩增全长PINK1基因，亚克隆至增强型绿色荧光蛋白载体（pEGFP-N1），经测序证实载体构建正确。PINK1-pEGFP-N1表达载体转染非洲绿猴。肾细胞株（COS-7细胞），应用MG-132抑制蛋白酶体活性，Western blot检测PINK1蛋白表达量，荧光染色观察PINK1蛋白是否形成蛋白聚集物，免疫荧光观察构成Lewy小体的两种主要成分：泛素和α-突触核蛋白是否存在于蛋白聚集物中。结果应用MG-132诱导后PINK1蛋白表达量明显增加，PINK1蛋白形成了蛋白聚集物，泛素和α-突触核蛋白与PINK1蛋白聚集物共定位。结论在蛋白酶体抑制剂作用下，PINK1蛋白可形成蛋白聚集物，泛素和α-突触核蛋白是其组成成分。     

重组外源性人热休克蛋白70基因真核表达载体的构建及鉴定

背景：热休克蛋白70的肿瘤免疫作用近年来受到国内外学者的广泛关注,然而目前常用的诱导内源性热休克蛋白70表达的方法,如热应激、缺血预处理等均存在一些弊端。 目的：拟构建携带并正确表达外源性人热休克蛋白70基因的重组真核表达载体。 方法：外源性热休克蛋白70基因连接入真核表达载体pDC315-EGFP中,转化大肠杆菌感受态细胞,重组真核表达载体外源基因测序及PCR检测鉴定阳性克隆后转染人胚肾293细胞,荧光显微镜及western blot鉴定外源基因在细胞中的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实外源性人热休克蛋白70基因正确重组入真核表达载体pDC315-EGFP,转染293细胞后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP的表达,Western blot检测到热休克蛋白70在293细胞中有效表达。     

外源性SDF-1α和GDNF基因在恒河猴骨髓基质细胞内的稳定表达

目的 构建携带人基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)和胶质细胞源神经营养因子(GDNF)基因的真核表达质粒pBudCE4.1-SDF-1α-GDNF,转染恒河猴骨髓基质细胞(BMSCs),观察外源性SDF-1α和GDNF基因在BMSCs中的表达情况. 方法 应用基因重组技术,从cDNA文库获得GDNF和SDF-1α基因,重组到pBudCE4.1双表达载体上.pBudCE4.1-SDF-1α-GDNF经脂质体转染培养的恒河猴BMSCs,48 h后行GDNF和SDF-1α Western blot和免疫组化检测. 结果 酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入基因片段的正确性;48 h后行West blot和免疫组化证实GDNF和SDF-1α在细胞内能有效表达.pBudCE4.1-GDNF-SDF-1α转染BMSCs表达的GDNF和SDF-1α蛋白的量是阴性对照细胞的10倍和6倍. 结论 双基因真核表达质粒DBudCE4.1-SDF -1α-GDNF转染至恒河猴BMSCs后,SDF-1α和GDNF基因在BMSCs内能有效表达,为BMSCs携带SDF-1α和GDNF双基因自体移植治疗相关疾病奠定了基础.     

变异链球菌表面蛋白SpaP P区真核表达质粒的构建及表达

背景：变异链球菌是龋病的主要致龋菌,针对介导变异链球菌非蔗糖依赖性黏附的重要毒力因子SpaP的基因疫苗在理论上能对抗变异链球菌黏附于牙面和进一步破坏牙体硬组织。 目的：构建变异链球菌表面蛋白P 区(SpaP/P)真核表达质粒pVAX1-spap/P,并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达。 方法：通过基因重组技术,构建真核表达质粒pVAX1-spap/P,并经酶切分析、测序分析鉴定正确后,采用脂质体转染法,将其转染至COS-7细胞中,然后经免疫组织化学SABC法检测其在细胞中的表达。 结果与结论：真核表达质粒pVAX1-spap/P经 EcoR Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切分析,证实携带1.2 kb的目的基因spap/P片段,经测序分析,目的基因正向插入到预先设计的载体位点处。pVAX1-spap/P转染的细胞胞质呈褐色,pVAX1空载体质粒转染的细胞胞质中无着色。证实实验成功构建真核表达质粒pVAX1-spap/P,所携带的基因序列正确,能够在真核细胞COS-7中正确表达目的蛋白。     

人淀粉样前体蛋白基因与绿色荧光蛋白融合基因筛选系统的建立

目的 构建携带人淀粉样前体蛋白（APP）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）载体。以利于初步筛选对APP mRNA水平作用的药物。方法 将pEGFP质粒和携带野生型APP695亚型的pXCJL经Hind Ⅲ酶切，连接．PCR初筛，酶切鉴定。进一步经测序证实。携带野生型人类APP751亚型cDNA的pCDNA3．1质粒用XbaⅠ酶切．Klenow酶填平．再用HindⅢ酶切．回收APP751片段；质粒EGFP用SmaⅠ和Hind Ⅲ酶切。将目的基因APP751片段与EGFP载体片段连接生成重组质粒．酶切鉴定．测序证实。构建好的重组质粒转染COS-7细胞．观察EGFP的表达情况。结果 APP695和APP751重组质粒上的EGFP在COS-7细胞内得以表达。结论 构建的APP—EGFP融合基因重组质粒．有助于方便、快速地初筛出作用于APP mRNA水平的药物。     

小鼠血管紧张素转化酶2基因表达型载体的构建及体外表达*

背景：通过转基因疗法使血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme,ACE2)过度表达来治疗心血管病是当前ACE2研究的趋势,而构建含ACE2基因的载体则能为该研究方法提供工具。 目的：构建含小鼠血管紧张素转化酶2基因的真核表达载体,并验证其蛋白的表达。 方法：采用RT-PCR的方法从C57小鼠肾脏扩增出ACE2基因全长cDNA序列,并通过酶切连接和转化等分子生物学方法将其定向克隆至载体pcDNA3.1/Hygro(+)上,构建小鼠ACE2基因的真核表达载体pm-ACE2,并通过酶切及测序鉴定。通过脂质体转染法将所构建的pm-ACE2转染COS7细胞,并利用Western blot检测COS7细胞中ACE2蛋白的表达。 结果与结论：通过测序并与GeneBank上的小鼠血管紧张素转化酶2序列(NM_027286.3)比对,证实实验成功克隆小鼠ACE2基因全长cDNA至载体pcDNA3.1/Hygro(+)上,测序结果提示存在3处同义突变;所构建的pm-ACE2在真核细胞中具有ACE2蛋白的表达。结果提示实验成功构建了小鼠ACE2基因真核表达载体,此载体具有表达ACE2蛋白的功能。 关键词：血管紧张素转化酶2基因;载体;COS7细胞;真核细胞;基因表达;组织构建     

人多形上皮黏蛋白与巨噬细胞集落刺激因子基因融合构建双基因多表位抗原的 真核共表达质粒**☆

背景：一些实验已经证明在同一载体上构建含多个基因的共表达载体，可提高转染和表达效率。 目的：利用多形上皮黏蛋白(polymorphic epithelial mucin, MUC1)多肽骨架中含有许多连续重复系列，构建人MUC1重复序列串联体基因与巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF，并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。 设计、时间及地点：基因重组体设计实验，于2005-09/2006-12在解放军第四军医大学动物中心实验室完成。 材料：真核表达载体pcDNA3.1(+)由英国Taylor-Papadimitriou教授惠赠，pGEM-3zf(-)-GM-CSF质粒、COS-7细胞、pUC18载体及E.coli DH5α为自备，雌性BALB/c小鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供。 方法：将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片断经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体，酶切鉴定及序列分析后，与GM-CSF基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中，构建真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF。以重组质粒转染COS-7细胞。 主要观察指标：通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。 结果：酶切鉴定及序列分析表明，重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GM-CSF 的融合基因，在COS-7细胞中可检测到MUC1表达，重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM-CSF抗体。 结论：成功构建了人MUC1基因重复序列串联体与免疫佐剂GM-CSF 基因重组成为双基因多表位抗原的真核共表达质粒。     

pcDNA3/NT-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建大鼠神经营养因子3（NT-3）基因真核表达载体并观察其在真核细胞内的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以阳离子脂质体Li-pofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NT-3在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为822bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/NT-3酶切后产生822bp和5.2kb的片段,DNA测序证实822bp片段的碱基序列与大鼠NT-3基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/NT-3重组质粒。将其转染真核细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NT-3能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3/NT-3,为后续的研究奠定基础。