新疆布氏菌毒力研究

新疆维吾尔自治区是我国重要的畜牧业基地之一。因此,人、畜间布氏菌病多有流行。经以往的分种、分型研究证实,我区流行的菌株中以羊种及牛种布氏菌为主,且分布广,存在宿主转移,对人、畜有较强的致病力。作者对130株不同种、型     

布氏菌属分类演变

自1929年Huddleson氏根据布氏菌初代培养物对CO_2的需求,H_2S产生和对阿尼林染料的敏感性,将布氏菌属分为三个种,即羊种、牛种和猪种布氏菌以来,布氏菌属不断充实和发展。现今的布氏菌属     

内蒙古自治区布氏菌流行株的毒力与疫情

内蒙古是布氏菌病(简称布病)老疫区，50～60年代为布病严重流行期，经防治80年代疫情控制在最低水平，90年代疫情又出现回升。在内蒙古布病疫情的起落中，布氏菌流行株的种型存在偏移已有报道，现将疫情起落中布氏菌流行株的毒力作一分析。     

PCR技术鉴定布氏菌

目的用PCR技术检测鉴定羊种布氏菌和牛种布氏菌1、2、4型。方法根据文献发表的3对引物(简称B、M、A),用PCR技术对细菌DNA进行扩增,在属和种的水平上鉴定布氏菌。结果用B引物进行PCR扩增可以在属的水平上鉴别布氏菌,M引物可以鉴别羊种布氏菌,A引物可以鉴别牛种布氏菌1、2、4型和沙林鼠种。B、M、A 3对引物PCR鉴别结果与常规方法鉴定结果相符率分别为100%、92.0%和87.5%。结论PCR技术对细菌DNA进行扩增,可以在属和种的水平上鉴别布氏菌。布氏菌牛种9型的PCR扩增产物与布氏菌其他生物型有差异,说明牛种9型布氏菌在基因上不同于其他布氏菌。目前所用的表型分型技术存在着与本试验所用基因分型方法的不一致性。     

布氏菌S2菌苗口服免疫机制的探讨

本文报道了布氏菌S_2苗经口免疫,除局部免疫外,全身亦得到了免疫改造,为进一步证实胞外寄生菌经口免疫可产生全身免疫的机制提供了佐证。     

布氏菌病研究进展

近年来，笔者与同道们撰写了有关布氏菌病(简称布病)多方面的研究进展的综述，几乎涵盖了布病研究所有内容。基于此，只能对布病当前研究最新进展予以补遗。     

布氏菌质粒实验研究初步探讨

本文应用改进的Kado、Takahashi、Clewell和Elwell四种方法对1979至1984年从全国十二个省、自治区分离到的57株羊、牛、猪种布氏菌野生型以及16M、544A、133OS三个标准菌株和M5、104M、S2三个菌苗菌株进行了质粒检测,以大肠杆菌V517和PBR322作为对照质粒菌株,经琼脂糖凝胶电泳和MAK柱层析纯化鉴定,结果没有发现质粒的存在。这些菌株均不产生细菌素,对广谱和氨基甙类抗生素均高度敏感。三个菌苗菌株不能被大肠杆菌PBR322的2.6Mdal质粒转化。我们还系统地探讨了离子型去垢剂SDS和非离子型去垢剂Brij-58、TritonX-100在各种作用条件下对布氏菌裂解的影响。最后对布氏菌属质粒存在的可能性与否进行了讨论。     

牛种布氏菌单克隆抗体的研究

应用酚杀死的光滑型牛种布氏菌544A抗原免疫的BALB/C小鼠,融合前一周用超声波处理后高速离心制备的可溶性抗原加强免疫,腹腔内注射3次,以无菌手术取脾,制备成免疫脾细胞悬液,取10~8个免疫脾细胞与10~7个SP~2/0小鼠骨髓瘤细胞混合,在分子量4000的PEC 0.8ml(w/v)融合剂的作用下,两分钟后速加无血清的1640液25ml,离心沉淀再悬浮于20%FBSHAT1640培养基中,分装六块96孔细胞培养板,定期补加培养液。10天后开始测其孔上清,其检出阳性孔44孔(ELISA OD值>0.3),初步筛选出11株效价较高、特异性较好者,经反复检测,抗体分泌水平比较稳定,扩大培养,冻存液氮中。克隆后的细胞染色体计数平均为94条/细胞,无血清培养的细胞上清液在PAGE中呈现一条带,符合Mc.cell株仅分泌一种抗体的特性。     

布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5-90诱导巨噬细胞凋亡线粒体途径相关因子的表达比较

目的比较布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后其凋亡相关因子的转录和表达。方法建立16M、M5-90侵染RAW264.7模型,采用CFU计数法比较16M、M5-90侵染RAW264.7 4、8、12、24h后的胞内生存情况;采用qRT-PCR检测AIF、Bcl-2、Bax、Apaf-1、Bcl-xl基因转录水平的变化;采用ELISA检测TNF-α和Cyt C在细胞内的表达;采用激光共聚焦检测Cyt C在细胞内共定位表达情况。结果布鲁氏菌16M在侵染后4h~24h胞内CFU呈增多趋势,而M5-90CFU先增多后减少。qRT-PCR显示AIF基因的转录水平在侵染后4h~24h内呈上升趋势,且M5-90侵染组与16M侵染组比较差异无统计学意义(P0.05);由M5-90侵染诱导的Apaf-1基因转录水平与16M侵染组比较有统计学意义(P0.05);Bcl-xl的转录量随着侵染时间增长而不断增加,且16M诱导组与M5-90组比较差异无统计学意义(P0.05);M5-90侵染组Bax和Bcl-2水平与16M组比较差异均有统计学意义(P均0.05);M5-90侵染组Bax/Bcl-2比值与16M侵染组比较差异无统计学意义(P0.05)。ELISA分析显示TNF-α、Cyt C分泌量随着时间增长而增加,且M5-90诱导组与16M组比较差异无统计学意义(P均0.05)。激光共聚焦显示Cyt C定位在RAW264.7内,属于胞浆表达,且M5-90诱导的表达量与16M组比较差异无统计学意义(P0.05),并随感染时间的延长不断增加。结论布鲁氏菌疫苗株M5-90侵染RAW264.7 4h~24h内,凋亡相关因子Cyt C、AIF、Bax/Bcl-2、Apaf-1的表达量高于强毒株16M侵染组,而Bcl-xl则相反,表明在此侵染阶段M5-90具有更强的促细胞凋亡作用。     

羊种布氏菌043强毒株BRA0434基因缺失突变株的构建与毒力的初步评价

目的检测BRA0434基因对羊种布氏菌043毒力的影响。方法利用同源重组的原理,以BRA0434基因外侧的同源臂序列构建重组质粒,将其电转化至布氏菌043感受态细胞,通过卡那抗性筛选和检测引物鉴定而获得羊种布氏菌043-ΔBRA0434缺失突变株,并以之和羊种布氏菌043以10⁶ CFU剂量腹腔接种小鼠,又以100∶1的感染复数侵染小鼠巨噬细胞。结果与羊种布氏菌043相比,羊种布氏菌043-ΔBRA0434缺失突变株的载菌量和小鼠脾脏重量的影响都有一定程度的下降;侵染小鼠巨噬细胞试验结果显示羊种布氏菌043-ΔBRA0434缺失突变株的毒力较羊种布氏菌043有所降低。结论BRA0434基因的缺失会减轻羊种布氏菌043的毒力。     

巨噬细胞在树突状细胞启动抗布鲁氏菌免疫应答中的作用

目的研究巨噬细胞(MΦ)在树突状细胞(DCs)启动抗布鲁氏菌免疫应答中的作用。方法用免疫组织化学染色法观察引流淋巴结内DCs的分布变化,用ELISA法检测阴道黏膜MΦ清除组和未清除组小鼠阴道接种布鲁氏菌疫苗后血清中IFN-γ、IL-4的含量,将MΦ与DCs体外负载布鲁氏菌疫苗,比较二者形态学变化。结果清除组接种疫苗12h～72h后,只见到少量的DCs散布于小鼠髂内淋巴结的皮质区和副皮质区;而未清除组阴道接种疫苗12h后,髂内淋巴结皮质区内DCs数量急剧增加,细胞密度增大并逐渐由皮质区向副皮质区迁移。清除组小鼠血清IFN-γ含量比未清除组有所下降,但显著高于PBS对照组(P<0.05);而各组小鼠血清IL-4含量保持基本一致。MΦ体外负载布鲁氏菌12h后胞质脱落,细胞核固缩,并释放出膜包小泡,而DCs却始终保持形态结构的完整。结论DCs启动抗布鲁氏菌Th1型免疫应答是一个MΦ依赖过程,MΦ吞噬布鲁氏菌后出现坏死性凋亡变化可能是这种依赖过程的机制。     

1株粗糙型布鲁氏菌诱导株RB71的生物学特性研究

目的 通过研究1株粗糙型布鲁氏菌诱导株RB71的毒力及免疫效果,进一步验证其生物学特性,探讨其作为疫苗株的潜力。方法 通过药敏片扩散法检测诱导株RB71对β-内酰胺类及非β-内酰胺类抗生素的耐受程度;通过对小鼠脾脏载菌量测定,评价诱导株RB71对感染小鼠的免疫保护率并确定其最小免疫剂量;利用小鼠感染模型进行毒力试验,比较诱导株RB71与亲本株的毒力差异。结果 诱导后的布鲁氏菌RB71株与亲本株相比,对β-内酰胺类抗生素和非β-内酰胺类抗生素的敏感性未发生改变;诱导株RB71对感染小鼠具有一定的保护效果,最小免疫剂量为10⁹ CFU/只;诱导株RB71与亲本株相比毒力更小,安全性更高。结论 本研究验证了布鲁氏菌诱导株RB71对抗生素的敏感性,其具有良好的免疫原性且具有较低的毒力,具备成为疫苗株的潜力。     

布鲁氏菌噬菌体基因组学研究进展北大核心CSCD

布鲁氏菌噬菌体用于鉴定和鉴别布鲁氏菌种属,其种类、遗传特性以及基因组功能对布鲁氏菌鉴别分型具有重要作用,因此布鲁氏菌噬菌体的研究备受关注。基于当前的研究进展,本文对布鲁氏菌噬菌体的基本特征、基因组功能、基因组比对以及最新应用技术的相关研究进行综述,在了解布鲁氏菌噬菌体基因多样性和复杂性的基础上,进一步认识噬菌体与宿主的相互作用机制。     

布鲁氏菌疫苗株S2全基因组测序及牛羊布鲁氏菌比较基因组学研究

目的 为了了解布鲁氏菌S2疫苗株全基因组结构及分子生物学功能。方法 对布鲁氏菌疫苗株S2进行全基因组测序,并与GenBank公布的6株牛羊布鲁氏菌进行比较基因组学研究。结果与结论 通过全基因组测序发现S2基因组大小为3 331 982 bp,预测基因有3 243个,GC含量为57.23 %。S2预测基因中大多数基因功能主要与糖代谢﹑氨基酸代谢﹑氨基酸转运和膜转运有关。通过比较基因组学研究发现S2有20个特有基因。另外S2与GenBank公布的S2序列进行比对发现有19个差异基因。     

布鲁氏菌VirB8-PCR方法的建立

目的建立VirB8-PCR方法,用于布鲁氏菌病的诊断和致病力因子的检测。方法以布鲁氏菌病致病力因子——四型分泌系统中的VirB8基因为模板,设计引物,建立VirB8-PCR方法,优化反应条件和程序,对布鲁氏菌标准株、疫苗株和当地分离株进行检测。结果13株布鲁氏菌标准株和6株疫苗株PCR检测结果均为阳性;沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、结核杆菌和链球菌均为阴性;检测11株当地分离株,9株也为阳性,2株为阴性。PCR检测特异性为100%,敏感性为153fgDNA(相当于30个菌)。结论VirB8-PCR方法特异、敏感,能用于布鲁氏菌病的监测和致病力因子的检测。     

嗜水气单胞菌毒力因子特性及作用机理研究进展

嗜水气单胞菌是一类广泛存在于水环境的常见菌,已成为人-兽-鱼共患病原菌。近年来,对其研究越来越多,对其毒力因子的研究,有利于深入了解其致病机理,探索药物和免疫防治的有效方法。本文综述了嗜水气单胞菌的毒力因子及其特性、致病机理等内容。     

牛羊猪种布鲁氏菌快速鉴别PCR方法的建立及评价

目的 建立一种可在一个反应体系中同时鉴别布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的快速PCR鉴别方法。方法 将布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的扩增引物进行优化组合,建立全新的BAMS-PCR方法;随后对该方法的特异性和灵敏度进行评价,并对现场分离的219株布鲁氏菌进行鉴别,评价其在布鲁氏菌鉴别中的应用价值。最后,用该方法对临床标本中布鲁氏菌的DNA进行扩增,评价其在临床诊断中的实用性。结果 BAMS-PCR方法可在同一反应中同时鉴别布鲁氏菌及牛种(1,2,4型),羊种(1,2和3型)和猪种(1型)布鲁氏菌,并有较好的特异性和敏感性。布鲁氏菌属,牛种,猪种和羊种布鲁氏菌引物的检测灵敏度分别为10 pg/μL,100 pg/μL, 10 pg/μL和100 pg/μL。BAMS-PCR对219株临床分离菌株的鉴定结果和常规生物分型方法的鉴定符合率为100%。经BAMS-PCR检测,97份临床血清样本仅6份为阳性,全血和组织(羊脾)样本全部为阴性。结论 BAMS-PCR是一种简便、快速、高效、准确的布鲁氏菌鉴别方法,可作为临床分离菌株的首选鉴别方法。     

绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞cDNA文库的构建

目的构建绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库。培养绵羊肺泡巨噬细胞,用绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞,用试剂盒构建侵染后绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库,并对文库中的部分克隆进行测序。结果表明,构建的绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞cDNA文库达到建库要求;所测序列与牛的基因组编码序列同源性最高。在绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊肺泡巨噬细胞过程中,以50∶1(细菌∶细胞)的个数比,侵染3.5h,能有效构建侵染后绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库。