Spoligotyping对广西地区208株结核分枝杆菌临床分离株的基因分型

目的用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)对广西地区结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,并分析北京家族菌株与耐药的相关性。方法收集广西地区结核分枝杆菌临床分离株,应用Spoligotyping进行基因分型研究和比例法进行药物敏感性检测。基因聚类分析采用BioNumerics软件。统计分析采用χ2检验。结果共在广西地区收集到208株结核分枝杆菌临床分离株,可分为2个基因群,即北京家族(Beijingfamily)或称北京基因型(Beijinggenotype),和非北京家族(Non-Beijingfamily),分别占55.3%(115/208)和44.7%(93/208),47种基因型,其中36株为独特类型,剩余172株分为11簇。北京家族菌株中,90.4%(104/115)为典型北京家族(TypicalBeijingfamily),非北京家族菌株表现为高度的基因多态性,可分为39个基因型,31株为独特的基因型。有耐药结果的205株菌株中,北京家族菌株,76.25%(76/113)表现为全敏感,而23.75%(37/113)表现为耐药;非北京家族菌株,75%表现为全敏感,而25%表现耐药,经卡方检验(Chi-SquareTests)(表2),两者间的差异无统计学意义(χ2=2.9721,P>0.05)。结论广西结核分枝杆菌存在明显的基因多态性。本研究证实北京基因型与耐药无明显相关性。     

Spoligotyping和MLVA用于71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株基因分型的初步研究

目的初步探讨寡核苷酸分型(Spoligotyping)和多位点数目可变串联重复序列分析(MLVA)用于浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株的分型,以初步了解浙江省结核分枝杆菌的基因型特征。方法随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株,常规培养,收集菌体,提取基因组DNA。采用聚合酶链反应(PCR)扩增整个DR区进行Spoligotyping分型,同时分别扩增15个VNTR位点进行MLVA分型。聚类分析采用BioNumerics软件。统计学分析采用卡方检验。结果对70株菌进行了基因分型,Spoligotyping结果显示,可分为2个基因群,即北京家族(Beijingfamily)和非北京家族(Non-Beijingfamily),分别占70和30,49株北京家族菌株中,89.8为典型北京家族;MLVA结果显示,可分4个基因群,分别为Ⅰ群占8.5,含5个基因型,Ⅱ群占18.3,含13个基因型,Ⅲ群占70.4,含38个基因型,Ⅳ群占2.8,含2个基因型。两种方法对菌株的基因分型结果非常吻合,Spoligotyping分型为北京家族的菌株均分布在MLVAⅢ型中,非北京家族菌株的基因多态性,分属于MLVAⅠ、Ⅱ和Ⅳ型。MLVA将70株菌分为58个基因型(含53个独特基因型),而Spoligotyping只分为18种基因型(含12个独特基因型)。结合对临床一线4种药物的耐药检测结果分析,两种方法的分型结果均显示北京家族菌株中表现为全敏感者71.4(35/49),表现为耐药者为28.6(14/49);而非北京家族菌株中表现为全敏感者为66.7,表现为耐药者为33.3,经卡方检验,两者间的差异无统计学意义(χ2=0.158,P>0.05)。结论初步证实浙江省结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为北京家族。北京家族与耐药无明显相关性。MLVA株水平鉴定能力明显高于Spoligotyping,尤其是在鉴别北京家族菌株上具有明显的优势。     

间隔区寡核苷酸分型技术用于结核分枝杆菌多重感染的初步研究

目的 初步评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术在鉴定结核分枝杆菌多重感染中的应用。方法 选取结核分枝杆菌临床分离株,5 μm孔径滤膜过滤法制备单个细菌菌悬液,平板接种37 ℃培养,选取生长良好的单个菌落培养增菌,提取基因组DNA,Spoligotyping进行基因分型鉴定,比较临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果。结果 共选取32株结核分枝杆菌临床分离株,获得306个单克隆分离株。Spoligotyping分型鉴定结果显示30株结核分枝杆菌临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果一致,2株临床分离株的单克隆分离株呈现了多种基因型,多重感染率为6.25%。结论 Spoligotyping可用于快速,有效地区分结核分枝杆菌多重感染。     

波兰肺结核患者耐药结核分枝杆菌分子流行病学研究

目的：描述波兰耐药结核分枝杆菌分离株的特征，估计人群中近期传播的数量。 设计：应用间隔区寡核苷酸分型及IS6110DNA指纹图谱法对2000年波兰251名耐药肺结核患者分离株进行分析。对部分菌株进行rpoB、katG和，或inhA基因调节区测序分析。 结果：应用间隔区寡核苷酸分型BS6110-RFLP相结合的成簇定义，29％的菌株成簇，提示存在近期传播。成簇菌株中某些病例的传播联系得到了流行病学资料证实，多数分离株的突变与利福平和异烟肼耐药相关。年龄、性别、移民身份、用药史和戍簇没有关系，耐多药病例更容易成簇。在波兰，也发现了北京基因型分离株，但频率较邻国偏低。 结论：证实了耐药结核菌的传播及其对波兰发生耐药结核病的作用。     

220株结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型研究

目的了解结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型种类和特征,为结核病防治研究提供基础科学依据。评价两种分型方法在北京地区结核病分子流行病学中的应用。方法收集北京市结核分枝杆菌临床分离株,应用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)二种分型方法进行基因分型,结果聚类分析采用BioNu-merics(Version5.0)软件。结果共在北京地区收集到220株结核分枝杆菌临床分离株。采用Spoligotyping分型方法,220株菌可分为2个基因群,即北京家族(Beijing family)和非北京家族(non-Beijing family),20种基因型。其中北京家族含有202株菌,占91.82%。北京家族菌株中,典型北京家族菌株占95.05%(192/202),非典型北京家族占4.95%(10/202)。北京家族菌株的耐药率为22.55%(22/98),非北京家族菌株的耐药率为16.67%(1/6),两者间的差异无统计学意义(fisher analysis,P=0.5835>0.05)。采用MLVA分型方法,202株菌可分成5个基因群59种基因型,主要为Beijing family、China2和China3,分别占91.37%、2.73%和4.55%。结论北京地区结核分枝杆菌具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族。北京家族菌株与耐药性无明显相关性。     

多位点可变数量串联重复序列分析在北京家族结核分枝杆菌基因分型中的应用及位点筛选

目的对于北京家族菌株占绝大多数的感染人群,评价多位点可变数量串联重复序列（variable number tandem repeats,VNTR）分析（multiple loci VNTR analysis,MLVA）中不同位点组合在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）基因分型研究中的应用。并以IS6110限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）为参照,筛选有效位点。方法分别采用IS6110-RFLP、间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）及MLVA不同位点组合对北京海淀区收集的MTB临床分离株进行基因分型研究,比较3种方法及MLVA不同位点组合的分型效果。结果 45株MTB分离株中86.7%为北京家族菌株,Spoligotyping和结核分枝杆菌散在分布重复单位（mycobacterial interpersed repetitive units,MIRU）-12系列的HGI（Hunter-Gaston Index）值分别为0.4313和0.8700,将45株MTB菌株分为10个和23个基因型。VNTR-9系列和IS6110-RFLP的分型结果一致,HGI值较高,为0.9980,将45株MTB菌株分为43个基因型。结论北京家族结核分枝杆菌在北京海淀区呈高水平流行。对于北京地区北京家族菌株占绝大多数的感染人群,VNTR-9系列MLVA是较为简便和高分辨率的分型方法 ,其分辨率能够达到MTB基因分型＂金标准＂IS6110-RFLP水平。     

青海省251株结核分枝杆菌Spoligotyping基因型与4种一线药物耐药表型的研究

目的研究青海结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物耐药状况及与Spoligotyping基因型的关系,为结核病有效预防提供依据。方法采用常规比例法对分离的251株结核分枝杆菌进行异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)等4种一线抗结核药物的药敏试验,并对菌株进行Spoligotyping分型,对药敏试验和基因分型结果进行综合分析。结果 251株结核分枝杆菌中,总耐药率为56.2%;对INH、RFP、SM和EMB的耐药率分别为43.0%(108/251)、37.1%(93/251)、39.0%(98/251)和27.9%(70/251);耐多药率为31.5%(79/251)。所有菌株经Spoligotyping分型,分为北京基因型185株(73.7%)与非北京型菌株66株(26.3%)。未发现北京型与非北京型结核菌株与耐药存在统计学关联。结论青海流行的结核分枝杆菌耐药率及多耐药率较高,Spoligotyping分型显示北京基因型为主要流行型。     

结核分枝杆菌散在分布重复单位基因型分型法的应用研究

目的 建立结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterial interspersed repetitive units，MIRU)基因型分型法，评估该方法在我国应用的可行性。方法 采用简单数字表法随机抽取上海地区2000年至2002年保存的菌株，对其进行MIRU分型，并与间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping)的结果进行比较。结果 用Spoligotyping方法对随机抽样的91株临床菌株进行基因型分型，得到20种基因型，其中81株(89％)属于北京基因型菌株，而用MIRU分型方法可将这些菌株分为46种基因型。81株北京基因型菌株可以分为39种不同的MIRU基因型。12个MIRU位点的多态性分析表明各位点有较大的区别，其中位点26显示了较高的多态性，位点16、31、40显示了中等程度的多态性。结论 MIRU分型方法简单快速，其数字化结果清晰可靠，是一种有效的结核分枝杆菌基因型分型方法。     

贵州省部分地区结核分枝杆菌MLVA基因分型研究

目的应用多位点可变串联重复序列分析技术(MLVA)对贵州省结核分枝杆菌进行基因分型分析,为贵州省结核病防控提供科学依据。方法选取贵州省150株临床分离株结核分枝杆菌,采用水煮法提取基因组DNA,PCR扩增15个VNTR位点,统计菌株各VNTR位点的重复数目,通过遗传差异值(h)及Hunter-Gaston指数对VNTR位点进行遗传多态性及分辨力评价,采用BioNumerics 5.0软件对各菌株进行聚类关系和最小间距图(minimum spanning tree,MST)分析。结果 PCR检测结核菌株VNTR各位点呈明显多态性,以Mtub21和MIRU26多态性尤为显著,以h值分别为0.559和0.505;MIRU10和ETRB显示较低基因多态性,h值分别为0.052和0.090。聚类分析显示,150株菌株分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个基因群,其中Ⅰ群占10.67%(16/150),Ⅱ群占30.67%(46/150),Ⅲ群占40.00%(60/150),Ⅳ群占18.67%(28/150)。4个基因群呈现明显地域分布,毕节市以Ⅰ、Ⅱ群为主要流行菌株,安顺市以Ⅲ群菌株为主要流行菌株,遵义市以Ⅳ群菌株为主要流行菌株。MST分析显示,150株菌株形成3个克隆复合体(clonal complexes,CCs)及若干个独立分支(singleton),遵义、安顺、毕节分离株分别分布于不同的克隆复合体CCs。结论贵州省结核分枝杆菌存在明显的基因多态性和地域分布特性,以Ⅲ群和Ⅱ群菌株为主要流行菌株,应加强对上述两群菌株的监控。     

内蒙古自治区结核分枝杆菌Spoligotyping分型及北京家族分析

目的 了解内蒙古自治区结核分枝杆菌临床分离株的基因型构成,及该地区北京家族菌株的分布特征。 方法 从内蒙古自治区结核病防治研究所收集2011年全年临床分离的372株结核分枝杆菌菌株及其372例来源患者的背景资料,采用间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）方法和BioNumerics 5.0软件进行基因分型分析,将372株临床菌株Spoligotyping分型结果与SpolDB 4.0数据库进行比对。另外,采用NTF及LSP 对北京家族菌株进行分析。来源患者中汉族和蒙古族分别为282例及84例,其他为回族4例,维吾尔族和满族各1例,例数过少,因此仅分析主要民族与北京家族的易感性。以SPSS 13.0 软件进行统计学分析,χ²检验分析不同民族与北京家族易感性。 结果372株临床菌株共分为48种基因型,其中24种基因型为新的型别。85.48%（318/372）为北京家族,同时存在T家族（仅次于北京家族的主要流行基因型）占4.84% （18/372）、H家族（Haarlem）0.81%（3/372）、MANU家族(2004年最先于印度Delhi发现)0.27%（1/372）和LAM家族（Latin American and Mediterranean,拉丁美洲和地中海家族）0.27%（1/372）。汉族北京家族菌株占87.94%(248/282),非北京家族菌株占12.06% (34/282),蒙古族北京家族菌株79.76%(67/84),非北京家族菌株20.24% (17/84),差异无统计学意义（χ²=3.612, P=0.057）。 结论 内蒙古自治区结核分枝杆菌临床分离株基因具有多态性,且北京基因型为该地区主要流行株,而北京家族菌株与民族易感性间无关联。     

福建省结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因突变特征初步分析

目的 了解福建省结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因的突变特征,为异烟肼耐药快速检测方法的建立提供一定的科学依据。方法 对来源于福建省结核病耐药性监测30个监测点纳入的75株耐多药和10株全敏感结核分枝杆菌分离株,进行katG、inhA、oxyR-ahpC基因片段PCR扩增并测序分析,用RD105缺失基因检测法进行北京家族基因型鉴定,使用卡方检验分析相关性。结果 10株全敏感株未检测到突变。75株耐多药结核分枝杆菌检测到72株katG、inhA、oxyR-ahpC发生单一或联合基因突变,突变率为96.0%(72/75)。其中,65株(86.7%,65/75)发生katG突变,涉及5个位点,最常见位点突变的密码子是315,突变率为82.7 %(62/75),最常见突变形式为Ser315Thr(77.3%,58/75);8株(10.7%,8/75)发生inhA突变,突变形式均为C(-15)T;5株(6.7%,5/75)发生oxyR-ahpC突变,突变形式为C(-39)T或C(-46)A。katG、inhA和oxyR-ahpC 在北京家族基因型菌株和非北京家族基因型菌株中的突变率分别为83.9 %(47/56)、12.5%(7/56)、7.1 %(4/56)和94.7 %(18/19)、5.3 %(1/19)、5.3 %(1/19),差异无统计学意义(P值分别为0.23、0.38、0.78)。结论 福建省结核分枝杆菌异烟肼耐药性相关基因突变绝大多数发生在katG、inhA和oxyR-ahpC基因位点,且以katG突变为主。初步分析显示北京家族基因型菌株流行与异烟肼耐药基因突变特征无关。     

RD105缺失基因检测法用于结核分枝杆菌新疆“北京家族”临床分离株的鉴定

目的通过RD105缺失基因检测法鉴定结核分枝杆菌"北京家族"菌株,了解"北京家族"菌株在新疆地区的分布特征。方法收集新疆结核分枝杆菌临床分离株,采用RD105缺失基因检测法鉴定"北京家族"菌株。统计学分析采用χ2检验。结果共收集到229株结核分枝杆菌临床分离株,采用RD105缺失基因检测法鉴定出"北京家族"菌株100株,占全部菌株的43.7%,非"北京家族"菌株129株,占全部菌株的56.3%,"北京家族"菌株在维吾尔族和汉族病例中所占的比例分别为39.5%(79/200)和72.4%(21/29)。统计学分析"北京家族"菌株在新疆地区汉族和维吾尔族病例中的分布差异有统计学意义(χ2=11.154,P=0.001)。结论结核分枝杆菌"北京家族"菌株在新疆维吾尔族人群中呈一般流行趋势,而在汉族人群中为主要流行菌株。"北京家族"菌株是否为新疆地区的主要流行菌株还有待进一步研究。     

甘肃省临床分离结核分枝杆菌MLVA分型初步研究

目的随机选取2005-2007年间甘肃省肺科医院临床分离结核分枝杆菌菌株,通过多位点可变数目串联重复序列(Multiple locus variable numbers of tandemrepeats analysis,MLVA)分型,了解甘肃结核分枝杆菌流行菌株基因型情况。方法选择标化的15个VNTR位点,对临床分离菌株DNA进行检测,DNA指纹图谱使用Bio Numerics4.5软件进行统计分析,得出聚类分析结果。结果 228株结核分枝杆菌被分为4大基因群,7个大基因类型,分别包含13(5.7%)、3(1.3%)、7(3.1%)、1(0.4%)、171(75%)、31(13.6%)、2(0.9%)个株菌;在株水平基因分型上,93(40.8%)株为单菌株基因型;其余菌株基因型分别包含2-10株结核分枝杆菌,共构成132个基因簇。结论甘肃结核分枝杆菌菌株存在丰富的基因多态性,ML-VA方法具有较高的基因分型能力,可以满足结核分枝杆菌株水平DNA分型的需要。甘肃省结核分枝杆菌流行株主要为北京家族基因型菌株。     

114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型研究

目的 了解HIV/MTB双重感染病例中结核分枝杆菌基因型构成情况以及北京家族基因型菌株所占的比例,为HIV/MTB双重感染病例结核病预防控制提供分子流行病学依据。方法 收集HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌临床分离株114株,利用间隔寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术对所收集的临床分离株进行分型研究,分析HIV/MTB双重感染病例中结核分枝杆菌基因型构成情况及主要流行型。结果 114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌成2个大的基因家族,即北京家族(Beijing Family)和非北京家族(non-Beijing Family),分别占66.7%(76/114)和33.3%(38/114),共30种基因型。其中,非北京家族包括T家族共18株,H家族共5株,EAI5基因家族1株,CAS1_DEHLI基因家族1株及12种在数据库中没有对应基因家族或没有匹配的结果的新基因型13株。结论 HIV/MTB双重感染病例中,结核分枝杆菌基因型呈明显的多态性,北京家族基因型菌株仍为HIV/MTB双重感染病例中结核分枝杆菌主要流行菌株。     

北京结核菌株分子流行病学的研究

目的　北京结核分支杆菌分子流行病学的研究。方法 (1)使用标准化的RFLP法检测并分析从128位初治患者分离的结核分支杆菌IS6110指纹多态性;(2)对选例患者进行社会人口学和流行病学调查问卷;(3)分析结核分支杆菌IS6110指纹多态性特征与流行病学的关系。结果 (1)根据IS6110指纹特征的同源性,检测的128株结核分支杆菌可基本分为3组,A、B组的菌株间因具有较高的同源性而被称为“北京基因型”菌株,并且此类菌株在检测菌株中所占的比例较高(103/128,80.5%);C组菌株间同源性较低,多态性变化多而被称为“非北京基因型”,仅占19.5%。(2)从较低年龄(<40岁)患者分离菌株的多态性变化,与从较高年龄(>40岁)患者分离菌株多态性变化比较存在差异,提示“北京基因型”菌株不是由于BCG接种而造成的选择性优势。(3)检测菌株的多态性变化与患者结核病接触史、患者长期居住地、菌株药物敏感性情况无明显联系。结论 结核分支杆菌的指纹分析对结核病现代流行病学的研究是一个有用的工具。     

天津地区临床分离株结核分枝杆菌分子流行病学研究

目的探讨天津地区结核分枝杆菌临床分离株分子流行病学特征。方法连续收集天津市海河医院2005年8月16日～11月25日就诊病人痰培养阳性的结核分枝杆菌100株，采用间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）和数目可变串联重复序列（VNTR）两种方法进行基因分型，并运用软件对二者的结果进行分析。依据北京分化支的定义。运用多重和实时定量PCR方法将其区分为W菌/典型北京家族菌株和非典型北京菌株，x^2检验分析两种亚群与患者年龄和耐药性之间的联系。结果排除污染菌株，共对96株结核分枝杆菌临床分离株进行两种方法的基因分型，Spoligotyping结果为91．7％为北京基因型（含3株类北京基因型）结核分枝杆菌（88／96）。VNTR分型可将北京基因型分为60种基因型。在北京分化支结核分枝杆菌中，W菌/典型北京家族菌株占93．2％（82／88）。两种北京分化支亚群与患者年龄和耐药性没有显著性统计学差异（P〉0.05）。结论天津地区结核病患者临床分离的结核分枝杆菌中，北京基因型呈现较为明显的优势。VNTR的分辨率明显高于Spoligotyping。北京分化支的两种亚群在天津地区临床结核病患者中均存在流行，但以W菌/典型北京家族菌株为主。     

四对结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统基因功能的初步研究

目的探讨结核分枝杆菌毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统中的4对基因的功能,为研究结核分枝杆菌的传播机制提供基础科学数据。方法选取结核分枝杆菌TA系统VapBC家族中4对基因,包括VapC 4个毒素基因(Rv1720c、Rv2103c、Rv2494和Rv3408)和VapB4个抗毒素基因(Rv1721c、Rv2104c、Rv2493、Rv3407),在大肠杆菌和耻垢分枝杆菌中分别构建严谨型阿拉伯糖诱导质粒体系及乙酰胺诱导穿梭质粒体系观察VapC对细菌生长的抑制作用,及其对应的VapB解除抑制作用。结果在大肠杆菌和耻垢分枝杆菌的实验结果一致,Rv2103c具有一定抑制作用和Rv2104c具有消除抑制作用,其余3对毒素-抗毒素基因未见到明显的对细菌生长的抑制和消除抑制的作用。结论成功构建了VapBC家族在大肠杆菌及耻垢分枝杆菌中的表达体系,并发现了一对TA系统基因对细菌生长的抑制和消除抑制的作用。