黄芪对弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫调节作用北大核心CSCD

目的探讨黄芪对弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫保护作用。方法将小鼠随机分成pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组、pcDNA3+黄芪治疗组、黄芪治疗组、pcDNA3及生理盐水对照组。将弓形虫pcDNA3-W2b2a肌注免疫pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠3次,末次免疫后4周,每组小鼠腹腔注射102个速殖子,感染后2d起,pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组、pcDNA3+黄芪治疗组及黄芪治疗组小鼠给予黄芪75mg/d灌胃治疗,连续用药7d,用ELISA法测定免疫前、末次免疫后4周、感染后6d小鼠血清IgG水平及免疫前、末次免疫后2周、感染后4、6、8d小鼠IFN-γ、IL-18水平,并观察弓形虫感染后小鼠的生存时间。结果 pcDNA3-W2b2a免疫小鼠后血清IgG抗体水平均高于其它组(P<0.05),末次免疫后4周,感染后第6dpcDNA3-W2b2a、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠特异性IgG抗体水平无显著性差异(P>0.05);末次免疫后2周、感染后4d、6d、8dpcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠血清IFN-γ水平分别高于其它组(P<0.05);感染后各组小鼠血清IL-18水平持续上升,但感染后8d,黄芪治疗后小鼠血清IL-18水平显著低于pcDNA3和生理盐水对照组(P<0.05);小鼠RH株速殖子感染后,pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠存活时间明显长于pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3+黄芪治疗组及黄芪治疗组(P<0.05)。结论黄芪可增强弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫调节作用。     

弓形虫新基因表位疫苗免疫效果的观察

目的观察弓形虫新基因WX、WX2的表位疫苗对小鼠的保护作用。方法将昆明小鼠分成5组,分别用pcDNA3-W2b、pcDNA3-W4a、pcDNA3-W2b4a质粒及pcDNA3和NS,肌注3次,每次间隔2周。免疫完成后ELISA法检测血清抗体水平,取脾细胞用流式细胞仪检测CD4 与CD8 淋巴细胞比值,PCR检测肌肉组织中重组质粒。免疫后第3周,小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子500个,观察发病情况和存活时间。30d后仍存活的小鼠,取组织匀浆后进行小鼠盲传。结果免疫后第3周,pcDNA3-W2b组小鼠血清抗体水平显著高于pcDNA3和NS对照组(P<0.05);用PCR法从pcDNA3-W2b、pcDNA3-W4a和pcDNA3-W2b4a质粒组小鼠肌肉组织中成功检测到各表位疫苗质粒,且各组小鼠脾脏CD4 与CD8 T淋巴细胞比值显著低于pcDNA3组和NS组(P<0.05)。pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2b4a组小鼠存活时间与pcDNA3组及NS组比较明显延长(P<0.05)。结论弓形虫新基因WX、WX2表位疫苗能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,提示DNA类表位疫苗的研制可作为弓形虫疫苗研究的策略之一。     

弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护性研究

目的以弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗免疫小鼠,评价该疫苗对弓形虫感染产生的免疫保护作用。方法利用PCR技术和亚克隆技术,构建弓形虫多表位抗原基因真核表达重组质粒pcDNA3-MAG,以质粒纯化试剂盒大量制备质粒,同时分别以载体质粒pcDNA3和PBS液为空质粒对照和空白对照,与lipofectin按5∶2的比例混合后,经股四头肌注射免疫小鼠,间隔两周,连续免疫3次,通过检测小鼠血清中特异的IgG抗体、IFN-γ和IL-4含量,评价疫苗产生的体液免疫和细胞免疫水平。以强毒型RH株弓形虫感染免疫小鼠,统计小鼠的存活时间,评价疫苗产生的免疫保护性。结果经双酶切及DNA测序鉴定,所构建的重组质粒pcDNA3-MAG读码框架正确。与免疫前及载体质粒和空白对照组相比,小鼠免疫后产生特异性IgG抗体,并引发高水平IFN-γ。攻虫后,实验组较对照组小鼠存活时间明显延长。结论弓形虫多表位抗原基因DNA能诱导BALB/c系小鼠产生特异的细胞免疫和体液免疫,对弓形虫感染可产生一定的免疫保护性。     

刚地弓形虫复合基因疫苗、混合疫苗及多表位疫苗研究进展

有效的疫苗免疫是预防弓形虫病的最理想方法.当前弓形虫疫苗的研制虽然取得了一些进展,但是单价疫苗的免疫效果并不理想.寻找更有效的候选抗原基因和合适的载体及研究多种抗原基因的优化组合将是今后弓形虫疫苗研究的主要方向.该文就弓形虫复合基因疫苗、混合疫苗及多表位疫苗的研究进展进行综述.     

香菇多糖抗小鼠急性弓形虫感染免疫机制的初步探讨

目的从香菇多糖对弓形虫感染小鼠Th1／Th2免疫应答建立的影响及二者平衡维持的角度探讨香菇多糖抗小鼠急性弓形虫感染的免疫机制。方法RH株弓形虫速殖子腹腔感染小鼠前及感染后进行香菇多糖处理,观察各组小鼠的存活率,同时用ELISA法动态检测小鼠脾细胞培养液中Th1／Th2免疫反应关键细胞因子IFN—γ／IL-4水平及血清中IgG2a／IgG1抗体的含量。结果与对照组相比香菇多糖可以明显提高两处理组小鼠的存活率,香菇多糖处理组（LTN组）第10d全部死亡,而香菇多糖预处理组（pre-6dLTN组）第13d存活率仍达18．4％;pe-6dLTN组及LTN组在感染后第3d建立Th1型免疫应答,IFN-7含量分别为186．28pg／ml及117．07pg／mi,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）;IgG2a含量为0．332（A-490）及0．320（A-490）,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）,且于第7d达峰值。同时Th2型免疫应答开始建立,IL-4含量分别为121．28pg／ml及94．47pg／ml,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）;IgG1含量分别为0．382（A-490）及0．354（A-490）,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）,随后维持较高水平。结论香菇多糖能辅助小鼠建立Th1／Th2免疫应答,且能适时转化并维持二者平衡,避免因任何一种免疫反应过度表达而导致的免疫病理反应,从而增强小鼠抵抗弓形虫感染的能力。     

香菇多糖抗小鼠急性弓形虫感染免疫机制的初步探讨北大核心CSCD

目的从香菇多糖对弓形虫感染小鼠Th1/Th2免疫应答建立的影响及二者平衡维持的角度探讨香菇多糖抗小鼠急性弓形虫感染的免疫机制。方法 RH株弓形虫速殖子腹腔感染小鼠前及感染后进行香菇多糖处理,观察各组小鼠的存活率,同时用ELISA法动态检测小鼠脾细胞培养液中Th1/Th2免疫反应关键细胞因子IFN-γ/IL-4水平及血清中IgG2a/IgG1抗体的含量。结果与对照组相比香菇多糖可以明显提高两处理组小鼠的存活率,香菇多糖处理组(LTN组)第10d全部死亡,而香菇多糖预处理组(pre-6dLTN组)第13d存活率仍达18.4%;pre-6dLTN组及LTN组在感染后第3d建立Th1型免疫应答,IFN-γ含量分别为186.28pg/ml及117.07pg/ml,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);IgG2a含量为0.332(A490)及0.320(A490),与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),且于第7d达峰值。同时Th2型免疫应答开始建立,IL-4含量分别为121.28pg/ml及94.47pg/ml,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);IgG1含量分别为0.382(A490)及0.354(A490),与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),随后维持较高水平。结论香菇多糖能辅助小鼠建立Th1/Th2免疫应答,且能适时转化并维持二者平衡,避免因任何一种免疫反应过度表达而导致的免疫病理反应,从而增强小鼠抵抗弓形虫感染的能力。     

弓形虫新基因表位疫苗质粒的构建及鉴定

目的构建两个弓形虫新基因2B9G1、7C3-C3的表位疫苗质粒,为阐明表位疫苗的保护性奠定基础。方法采用生物信息学方法对新基因2B9G1、7C3-C3进行表位预测,PCR扩增基因中编码3个表位的片段W2b、W2a和W4a,连接入pcDNA3,转入DH5α,挑阳性菌落进行PCR、酶切和测序鉴定;同法将W2a、W4a分别克隆入pcDNA3-W2b载体中W2b片段下游,再将W4a克隆入pcDNA3-W2b2a载体中W2a片段下游。结果经PCR、酶切鉴定及序列测定,W2b、W2a和W4a 3个片段分别插入pcDNA3预期位置;W2a和W4a片段分别插入pcDNA3-W2b预期位置;W4a片段插入pcDNA3-W2b2a预期位置。结论成功构建单表位、双表位、多表位疫苗质粒pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a、pcDNA3-W4a、pcDNA3-W2b2a、pcDNA3-W2b4a、pcDNA3-W2a2b4a。     

香菇多糖预处理对急性弓形虫感染小鼠中枢神经系统损伤的保护性作用研究北大核心CSCD

目的探究香菇多糖预处理对急性弓形虫感染小鼠脑中枢神经系统的保护性作用。方法将C57BL/6小鼠随机分为对照组(NC)、模型组(TDI)和香菇多糖预处理组(pre-10dLNT TDI)。弓形虫感染前10d,pre-10dLNT组小鼠连续10d腹腔注射LNT(1mg/kg体重,1次/d),弓形虫感染后无任何处理;TDI组小鼠腹腔注射弓形虫悬液0.5 mL/只鼠;NC组小鼠感染前10d开始腹腔注射同等体积的生理盐水(1次/d)。通过观察小鼠的死亡时间及数量计算各组小鼠的存活率,使用流式细胞仪检测感染后第8d小鼠脑组织中CD8+IFN-γ+T细胞百分比,ELISA法检测感染后第4d和第8d小鼠外周血中IFN-γ、GABA和DA水平,应用SoftMax Pro 4.3.1LS软件绘制标准曲线计算各项指标的含量(pg/ml)。采用Grapad 8.0软件进行处理和分析。结果TDI组小鼠第8d存活率为0%,pre-10dLNT TDI组小鼠第8d存活率为60%;与NC组相比,TDI组和pre-10dLNT TDI组CD8+IFN-γ+T细胞亚群水平均明显增高;与TDI组小鼠相比,pre-10dLNT预处理明显降低了弓形虫感染的C57BL/6J小鼠脑组织中CD8+IFN-γ+细胞数量(P<0.01)、明显降低了小鼠第4d和8d的外周血中IFN-γ产生水平(P<0.05;P<0.01)、第8d小鼠外周血中DA和GABA的产生水平显著增加(P<0.01)。结论LNT预处理可以显著提高急性弓形虫感染小鼠的存活率,通过减少CD8+T细胞通过血脑屏障进入CNS,降低神经系统的广泛炎症反应,通过降低脑组织中CD8+IFN-γ+T细胞数量,调节神经递质的分泌水平,从而改善小鼠脑部的炎症反应,对急性弓形虫小鼠中枢神经系统的损伤具有明显的保护作用。     

弓形虫主要表膜抗原SAG2 DNA疫苗的免疫保护作用研究

目的观察弓形虫pVAX1-SAG2真核重组质粒的免疫保护作用,为弓形虫病的免疫预防提供理论及实验依据。方法大量制备重组质粒,免疫小鼠,3周后同量加强免疫1次,5周后无菌取小鼠脾脏,制备脾细胞,用MTT法测定淋巴细胞转化率;用免疫荧光法测定CD4+、CD8+细胞。用弓形虫RH株速殖子经皮下注射攻击感染,每只鼠接种0.1 ml(约含1000个虫体),观察小鼠存活情况。结果对小鼠的脾脏T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+进行分析,与对照组比较,免疫组小鼠CD4+细胞显著增多(P<0.05);而CD8+细胞数各组之间差异无显著性(P>0.05);淋巴细胞转化率各组间差异无显著性(P>0.05);攻击感染后,pVAX1-SAG2免疫组小鼠平均存活(7.8±1.8)d,与对照组比较显著延长(P<0.05)。结论弓形虫pVAX1-SAG2真核重组质粒能在组织内表达,并诱导小鼠产生细胞免疫反应。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/wx2的构建与鉴定

目的构建弓形虫新基因wx2的真核表达质粒,以其做为弓形虫DNA疫苗研究其保护性。方法PCR扩增出编码新基因wx2ORF,用EcoRI/XhoⅠ分别对扩增产物和pcDNA3进行双酶切,将wx2ORF定向克隆到pcDNA3的EcoRI/XhoⅠ位点,对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果特异扩增出预期的wx2ORF片段,大小为570bp左右,扩增产物经双酶切后成功连接到pcDNA3中,经PCR,双酶切及序列测定表明重组质粒中含有wx2读框。结论成功构建弓形虫真核表达质粒pcDNA3/wx2。     

弓形虫弱毒疫苗的研究进展

弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,可感染包括人在内的几乎所有的温血动物,全球约有1/3的人口感染弓形虫病.宿主感染弓形虫后常呈隐性感染,但对于免疫力低下的人群,如艾滋病患者或者孕妇,可引起严重的临床症状甚至死亡.随着人类生活质量的不断提高,弓形虫给人类健康、畜牧业发展和公共卫生安全带来的隐患与日俱增.目前,尚无针对弓形虫...     

弓形虫GRA1基因核酸疫苗的实验研究

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA1基因的真核重组表达质粒,研究其在Hela细胞中的表达情况及其对动物弓形虫感染的免疫保护作用。方法以弓形虫总RNA为模板,利用设计合成的一对引物,通过RT-PCR方法体外扩增GRA1基因cDNA片段,构建pVAX1-GRA1重组真核表达质粒,并将其转染Hela细胞,验证其在真核细胞中的表达;用pVAX1-GRA1真核表达质粒注射免疫小鼠,通过检测血清特异IgG水平及血CD4+、CD8+细胞百分率并观察弓形虫感染小鼠的存活时间,评价其免疫保护力。结果 PCR扩增出573bp的GRA1开放阅读框,成功构建重组表达质粒pVAX1-GRA1。用间接免疫荧光方法在重组质粒转染后的Hela细胞中检测到特异蛋白,Western blot证实该蛋白具有反应原性,SDS-PAGE检测该蛋白分子质量单位为24ku。用构建的核酸疫苗免疫小鼠,随着免疫次数的增加血清特异性IgG抗体滴度逐渐增加,CD4+与CD8+T淋巴细胞百分率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。弓形虫RH速殖子攻击感染疫苗免疫组小鼠存活时间为(165±23.1)d,PBS对照组、pVAX1对照组分别为(144±16.3)d和(148±16.3)d,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的真核表达质粒pVAX1-GRA1有一定的免疫保护性,为弓形虫基因疫苗的进一步研究奠定了基础。     

Oral immunization with a live recombinant attenuated Salmonella typhimurium protects mice against Toxoplasma gondii

The natural site of infection for T. gondii is the mucosal surface of the intestine, so the protective immunity obtained after natural infection with T. gondii points to the importance of developing a vaccine that stimulates mucosal defences. In this study, an aroA- and aroD- attenuated strain of Salmonella typhimurium (BRD509) has been used to deliver the recombinant eukaryotic plasmid pSAG(1-2)/CTA2/B expressing a multi-antigenic gene encoding SAG1 and SAG2 of T. gondii linked to A2/B subunits of cholera toxin as a candidate oral T. gondii vaccine. Immunoblot analysis showed compound gene expression in HeLa cells in vitro and intragastric immunization of mice with the recombinant salmonella resulted in the induction of humoral and Th1 type cellular immune responses and afforded protection against RH strain T. gondii challenge. Anti-T. gondii IgG values increased markedly in the BRD509/pSAG(1-2)-CTA2/B immunized group; these values were significantly higher than those in the negative controls (P = 0.008). With CTA2/B genetic adjuvant, the T. gondii-specific response was predominantly Th1, indicating that the CTA(2)/B genetic adjuvant was able to overcome the strong Th2-bias of the antigen (IgG2a > IgG1). Antigen-specific T cell proliferative responses and CTL activity were significantly enhanced when cholera toxin CTA2/B genetic adjuvant was used (P = 0.009; P = 0.006). Culture supernatants from antigen-stimulated splenocytes from mice in these groups were also examined by ELISA for Th1- and Th2-type cytokines; mean IFN-gamma levels produced after oral immunization with BRD509/pSAG(1-2)-CTA2/B were about nine-fold higher than after immunization with BRD509/pSAG(1-2) (P = 0.007). On the other hand, the levels of IL-4 were low for all groups and no increase was seen in the presence of CTA2/B genetic adjuvant. When the immunized mice were intraperitoneally challenged with 10(3) tachyzoites of the highly virulent RH strain, the survival time of the mice immunized with BRD509/pSAG(1-2)-CTA2/B was markedly longer than other groups (P = 0.003) and a 40% survival rate was achieved. This is the first report that demonstrates that an oral attenuated salmonella DNA vaccine can induce protective immunity against the acute phase of T. gondii infection.     

刚地弓形虫主要抗原B细胞表位的筛选及鉴定

目的筛选刚地弓形虫主要抗原B细胞表位并在原核表达载体中表达,对纯化的表位重组蛋白进行免疫反应性鉴定。方法用计算机软件BioSun、DNAstar综合分析6个弓形虫主要抗原的亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性参数等,每一抗原分子预测2个最佳表位,设计合成24条共12对寡核苷酸,两端分别引入NocI、XhoI酶切位点,退火形成的双链定向克隆至原核表达载体pET-32c中,EcoRI单酶切鉴定重组质粒Epitope/pET-32c。将含有Epitope/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,导入表达。表达产物用Ni2 螯合柱亲和纯化,免疫印迹试验(Westernblot)分析重组表位蛋白与弓形虫抗原免疫血清的免疫反应性。结果成功构建了12个原核表达质粒Epitope/pET-32c,并经测序证实,在E.coliBL21有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;纯化的表位蛋白大小均在20.0kDa左右;Westernblot结果显示表位蛋白SAG2-A、SAG3-B能被弓形虫抗原免疫血清识别,且反应较强,SAG2-B为弱阳性,其余的则不能被识别。结论成功筛选到3个弓形虫B细胞表位基因,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

弓形虫疫苗及其保护性研究现状

本文对近年来研制的弓形虫疫苗的种类、方法及其免疫保护性进行了综述，以期为弓形虫疫苗的进一步研究提供参考。     

弓形虫亲环蛋白亚单位疫苗的免疫保护性研究

目的研究弓形虫亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)亚单位疫苗的免疫保护性。方法 30只BALB/c小鼠随机分为3组:实验组、佐剂组和PBS对照组,分别肌注pET-28a-TgCyP重组蛋白100μg/只、佐剂100 ul/只和PBS 100 ul/只,共免疫3次,每次间隔2周。末次免疫后2周,各组分别取4只小鼠处死,取脾脏,检测CD4+、CD8+及细胞因子。同时,采用阿尔玛蓝细胞增殖与细胞毒性检测试剂测定小鼠脾淋巴细胞的增殖应答。其余小鼠腹腔攻击感染Rh株弓形虫速殖子500个,观察其存活情况。结果 pET-28a-TgCyP重组蛋白亚单位疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠的CD4+T细胞(62.59±4.17)%、CD8+T细胞(8.53±0.46)%与PBS及佐剂对照组比较显著增殖(P<0.01),其脾细胞培养液白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)显著升高,小鼠脾淋巴细胞增殖应答显著增强(P<0.01)。弓形虫攻击感染216 h后,实验组小鼠免疫保护率为33.3%,佐剂对照组及PBS对照组小鼠均全部死亡。结论 pET-28a-TgCyP重组蛋白亚单位疫苗具有较强的免疫原性,能...