弓形虫ROP16I/IIIDNA疫苗不能诱导小鼠有效的保护性免疫

目的利用ROP16_I/III基因真核表达重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠体液免疫和细胞免疫,评估ROP16_I/III作为潜在的分子疫苗的价值。方法克隆Chinese 1型弓形虫ROP16_I/III, 将其插入真核表达载体pEGFP-C2中构建重组质粒pEGFP-ROP16_I/III,脂质体法转染T293细胞并观察体外表达。Western blotting分析鉴定。将36只SPF级小鼠随机均分为:①PBS组;②空质粒组;③pEGFP-ROP16 _I/III组。每2周肌注免疫1次(100 μg/只),共3次;于免疫前及每次肌注前1 d和末次免疫后2周收集小鼠血清,间接ELISA法检测血清抗弓形虫IgG。于末次免疫2周后取小鼠脾脏,分离淋巴细胞培养测细胞因子。剩余小鼠腹腔注射Chinese 1型弓形虫 Wh3株速殖子1 000个/只,观察小鼠攻击感染后的存活时间和存活率。结果真核表达载体构建成功,体外见到重组质粒pEGFP-ROP16_I/III在T293细胞的表达;pEGFP-ROP16_I/III末次免疫后血清中IgG水平及脾淋巴细胞细胞因子均无明显升高(P>0.05);攻击感染后,免疫组小鼠比对照组的存活时间无延长(P>0.05);生物信息学分析发现ROP16_I/III缺乏线性B细胞表位。结论Chinese1 型弓形虫的ROP16_I/III由于其分泌的定位和结构特点,不能诱导小鼠产生有效的抗Wh3株攻击感染的免疫保护。     

弓形虫ROP5基因真核表达载体的构建及其免疫保护性的研究

摘 要：【目的】构建弓形虫pCDNA-ROP5真核表达载体,观察弓形虫ROP5基因在小鼠体内诱导的免疫反应。【方法】克隆弓形虫ROP5基因,将其插入真核表达载体pCDNA-3.1中构建重组质粒pCDNA-ROP5,脂质体法转染Hela细胞,肌注免疫昆明小鼠,测定小鼠血清中的IgG,观察小鼠受攻击感染后的存活时间。【结果】真核表达载体构建成功,实验组pCDNA-ROP5免疫的小鼠与对照组相比,实验组小鼠产生了明显的体液免疫应答;攻击感染试验中,实验组的小鼠比对照组的存活时间有明显延长。【结论】构建的真核表达重组质粒pCDNA-ROP5对抗击弓形虫攻击感染能够激发一定的免疫保护性。     

弓形虫ROP2-P30重组真核表达质粒的构建及其免疫效应的初步分析

目的构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）融合的重组真核表达质粒,观察融合抗原ROP2-P30以DNA免疫方式在体内的免疫学效应。方法以重组质粒pET28b/ROP2-P30为模板,利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30,经PCR和酶切鉴定正确后,体外转染COS-7细胞,Westernblot检测ROP2-P30表达。重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30以每鼠100μg混合透明质酸酶10U的剂量肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,以弓形虫虫体裂解抗原作包被抗原,ELISA法测定免疫小鼠血清IgG抗体,免疫结束2周后,以约100个弓形虫速殖子攻击感染小鼠,观察小鼠生存状况。结果PCR和酶切鉴定表明重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建正确;Westernblot显示该重组质粒在COS-7细胞中瞬时表达的产物可被重组ROP2-P30免疫兔血清识别;ELISA检测重组质粒免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平升高;重组质粒免疫小鼠感染弓形虫后的存活时间较对照组有所延长。结论重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建成功,用该重组质粒DNA直接免疫小鼠,能够诱导产生特异的体液免疫反应,具有一定的免疫保护性;该重组质粒表达的融合抗原分子ROP2-P30具有免疫原性,可作为疫苗候选抗原深入研究。     

弓形虫ROP12核酸疫苗对小鼠弓形虫感染度的影响

目的探讨弓形虫ROP12核酸疫苗对小鼠弓形虫感染度的影响。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,根据ROP12基因全长编码序列(登录号为DQ096559)的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR(RT-PCR),扩增目的片段ROP12基因克隆至真核表达质粒pVAX1上,构建重组表达质粒pVAX1-ROP12,并进行酶切和测序鉴定。将小鼠随机分为pVAX1-ROP12组、pVAX1组及空白对照组,分别用相应接种物(空白对照不作处理)免疫小鼠3次,每次间隔2周,末次免疫2周后各组小鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子1×10~3个/只,定时解剖小鼠,取组织印片并染色,观察各器官的虫体感染度。结果 RT-PCR扩增产物约为711 bp,菌落PCR及双酶切结果正确,序列测序结果与GenBank上报告的ROP12序列相似度为99.9%。用构建的弓形虫ROP12基因真核表达重组质粒pVAX1-ROP12免疫小鼠后,取弓形虫进行攻击感染,相同时间点小鼠各器官的感染度较空质粒对照和空白对照显著降低(均P0.05)。结论 ROP12核酸疫苗免疫对弓形虫在小鼠各组织器官的感染度有显著的抑制作用,这为弓形虫疫苗提供理论基础。     

编码弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)质粒DNA免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性

目的构建真核表达质粒pcGRA1,并观察其免疫小鼠的保护性. 方法经PCR从cDNA克隆中扩增出GRA1编码基因,定向克隆入pcDNA3的EcoRⅠ/XhoⅠ位点,从而获得pcGRA1.用限制性内切酶消化、PCR及序列测定对该重组质粒进行鉴定.将100 μg质粒于小鼠左后腿DNA肌注,于注射后2周和4周各加强1次;分别观察小鼠体内的特异性抗体滴度、GRA1基因在小鼠体内的分布、GRA1在肌细胞的表达以及免疫小鼠对弓形虫强毒株RH速殖子攻击后的保护性. 结果 DNA序列测定结果表明,将573 bp的GRA1编码阅读框定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/XhoⅠ位点,成功构建了重组质粒pcGRA1;免疫小鼠血清中检测到特异性IgG;不同组织DNA为模板特异地扩增出GRA1编码基因;IFA检测pcGRA1免疫鼠肌细胞呈阳性反应;弓形虫RH株速殖子攻击感染pcGRA1免疫鼠,其存活时间长于对照组. 结论重组质粒pcGRA1免疫小鼠可诱导特异性免疫反应,对弓形虫强毒株的攻击感染具有一定的保护性.     

弓形虫ROP5基因与基因佐剂IL-12对小鼠免疫保护性

目的 观察弓形虫ROP5基因疫苗和基因免疫佐剂IL-12共免疫对昆明小鼠所诱导的免疫保护性。方法 大量制备重组质粒pcROP5和pcmIL-12,以100 μg的剂量同时免疫昆明小鼠,PBS组和pcDNA3.1空质粒组作为对照。用ELISA法测定免疫鼠血清中特异性抗体IgG、IgG亚型的表达水平及细胞因子IFN-γ、IL-4的含量,MTT法测定淋巴细胞转化率,观察小鼠受攻击感染弓形虫后的存活时间。结果 质粒pcROP5和pcmIL-12共免疫小鼠3次后,与pcROP5质粒单独免疫组和对照组相比,IL-12基因佐剂的共免疫提高了免疫鼠血清中特异性抗体IgG及IgG亚型IgG2a的表达水平,提高了细胞因子IFN-γ的含量,增加了淋巴细胞的转化率,但IgG1和IL-4的表达水平变化不大;攻击感染后,质粒pcROP5和pcmIL-12共免疫组小鼠存活时间显著延长。结论 弓形虫ROP5基因与基因佐剂pcmIL-12共免疫能增强对小鼠的免疫保护性。     

弓形虫ROP11核酸疫苗免疫保护作用的研究

目的观察ROP11核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法 40只BALB/c小鼠随机分为实验组、空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组,每组10只,均通过股四头肌注射免疫小鼠。其中实验组每鼠注射pcDNA3.1（＋）-ROP11重组质粒100μg（1μg/μl）,空质粒对照组注射pcDNA3.1（＋）质粒100μg（1μg/μl）,PBS对照组注射无菌PBS缓冲液100μl,空白对照组不注射。共免疫3次,每次间隔2周,末次接种量均加倍。分别于每次注射前和末次注射后第2周检测小鼠血清特异性IgG和细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10。末次注射后2周各组小鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子1×10^3个/只,观察其存活时间,评价免疫效果。结果 ROP11核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,实验组小鼠血清特异IgG随着免疫次数的增加而显著增高（P〈0.05）。血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10均不同程度升高（P〈0.05）。重组质粒免疫组、空质粒免疫组、PBS和空白对照组小鼠经RH株弓形虫攻击感染后的平均存活时间为236.3、97.8、96.3和96.2h,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 ROP11核酸疫苗对BALB/c小鼠弓形虫感染有一定的免疫保护性,为进一步研究ROP11核酸疫苗的生物学功能提供了实验基础。     

编码弓形虫致密颗粒抗原-1（GRA1）质粒DNA免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性

目的 构建真核表达质粒pcGRA1，并观察其免疫小鼠的保护性。方法经PCR从cDNA克隆中扩增出GRAl编码基因，定向克隆入pcDNA3的EcoRI／XhoI位点，从而获得pcGRA1。用限制性内切酶消化、PCR及序列测定对该重组质粒进行鉴定。将100μg质粒于小鼠左后腿DNA肌注，于注射后2周和4周各加强1次；分别观察小鼠体内的特异性抗体滴度、GRA1基因在小鼠体内的分布、GRA1在肌细胞的表达以及免疫小鼠对弓形虫强毒株RH速殖子攻击后的保护性。结果DNA序列测定结果表明，将573bp的GRA1编码阅读框定向克隆到pcDNA3EcoRI／XhoI位点，成功构建了重组质粒pcGRA1；免疫小鼠血清中检测到特异性IgG；不同组织DNA为模板特异地扩增出GRA1编码基因；IFA检测pcGRA1免疫鼠肌细胞呈阳性反应；弓形虫RH株速殖子攻击感染pcGRA1免疫鼠，其存活时间长于对照组。结论重组质粒pcGRA1免疫小鼠可诱导特异性免疫反应，对弓形虫强毒株的攻击感染具有一定的保护性。     

弓形虫SAG1单基因疫苗与SAG1-ROP2复合基因疫苗的免疫效果观察

目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ、IL4;流式细胞仪测定T细胞亚群;弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。结果获得pcDNA3.1SAG1、pcDNA3.1SAG1ROP2重组质粒;pcDNA3.1SAG1ROP2组小鼠IgG抗体(P<0.05)、IFNγ(P<0.01)及CD8+细胞比例(P<0.05)均高于pcDNA3.1SAG1组;实验组组均未测到IL4;复合基因组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫不同生活阶段的抗原基因复合疫苗较单基因疫苗具有更好的免疫保护性。     

荧光蛋白报告载体观察刚地弓形虫SAGl、MIC3、ROP2鸡尾酒DNA疫苗的表达及其免疫原性的研究

目的构建能同时表达多个基因的刚地弓形虫DNA鸡尾酒疫苗并初步观察其免疫原性。方法从基因组DNA扩增刚地弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)、微线体蛋白(microneme,MIC)和棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)基因片段,克隆到真核荧光表达载体pShuttle-CMV-MCS-EF1α-Am Cyan,pLVX-IRES-Zsgreen及pLVX-IRES-rfp中,构建pShuttle-SAG1,pLVX-Zsgreen-MIC3和pLVX-rfp-ROP2表达质粒。通过聚乙烯亚胺法用混合质粒转染293F细胞48 h,荧光显微镜下观察3个基因的表达情况。将30只C57BL/6雄性小鼠随机分为A、B、C组,分别肌内注射生理盐水(50μl)、pShuttle+pLVX-Zsgreen+pLVX-rfp混合空质粒(2μg/μl,各17μl)、pShuttle-SAG1+pLVX-Zsgreen-MIC3+pLVX-rfp-ROP2混合重组质粒(2μg/μl,各17μl)。免疫28 d后,ELISA检测血清抗刚地弓形虫IgG抗体水平,初步评价该疫苗的免疫原性。结果从刚地弓形虫基因组成功扩增出1、1.1及1.7 kb的SAG1、MIC3和ROP2序列。成功构建了pShuttle-SAG1、pLVX-Zsgreen-MIC3和pLVX-rfp-ROP2真核荧光表达质粒,转染293F细胞后观察到相应的蓝、绿、红报告荧光。免疫小鼠后28 d,ELISA测得A、B、C组IgG抗体的吸光度(A450值)分别为(0.620±0.029)、(0.741±0.040)、(1.561±0.131),C组显著高于A、B组(P0.01)。结论刚地弓形虫SAG1、MIC3和ROP2基因混合重组质粒组成的DNA鸡尾酒疫苗能诱导小鼠产生良好的免疫原性,且多个荧光蛋白真核表达载体能够较好地指示目的基因的表达。     

刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗对BALB／c小鼠免疫保护性的研究

目的用刚地弓形虫ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠观察对机体的影响,为研制安全有效的弓形虫疫苗奠定基础。方法PCR方法从刚地弓形虫基因组中扩增出ROP2和P30片段,将这两个片段分别亚克隆至pET-30a原核表达载体中,表达出ROP2-P30复合重组蛋白。用蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫小鼠后体液中抗体和细胞因子的变化,观察攻击试验小鼠的的死亡率。结果ROP2-P30复合重组蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠诱导机体产生大量的IgM、IgG抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。攻击试验表明,复合重组蛋白免疫组和对照组相比,小鼠的存活时间明显延长。结论ROP2-P30复合重组蛋白免疫BALB/c小鼠诱导其产生高水平的体液和细胞免疫应答,该复合重组蛋白是抗刚地弓形虫感染的候选疫苗之一。     

弓形虫GRA1基因核酸疫苗的实验研究

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA1基因的真核重组表达质粒,研究其在Hela细胞中的表达情况及其对动物弓形虫感染的免疫保护作用。方法以弓形虫总RNA为模板,利用设计合成的一对引物,通过RT-PCR方法体外扩增GRA1基因cDNA片段,构建pVAX1-GRA1重组真核表达质粒,并将其转染Hela细胞,验证其在真核细胞中的表达;用pVAX1-GRA1真核表达质粒注射免疫小鼠,通过检测血清特异IgG水平及血CD4+、CD8+细胞百分率并观察弓形虫感染小鼠的存活时间,评价其免疫保护力。结果 PCR扩增出573bp的GRA1开放阅读框,成功构建重组表达质粒pVAX1-GRA1。用间接免疫荧光方法在重组质粒转染后的Hela细胞中检测到特异蛋白,Western blot证实该蛋白具有反应原性,SDS-PAGE检测该蛋白分子质量单位为24ku。用构建的核酸疫苗免疫小鼠,随着免疫次数的增加血清特异性IgG抗体滴度逐渐增加,CD4+与CD8+T淋巴细胞百分率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。弓形虫RH速殖子攻击感染疫苗免疫组小鼠存活时间为(165±23.1)d,PBS对照组、pVAX1对照组分别为(144±16.3)d和(148±16.3)d,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的真核表达质粒pVAX1-GRA1有一定的免疫保护性,为弓形虫基因疫苗的进一步研究奠定了基础。     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅲ.免疫鼠肌组织表达产物免疫酶法定位及血清IgG抗体测定

目的用所构建的弓形虫pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒,经肌肉注射免疫小鼠,观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答.方法碱裂解法大量制备pcDNA3-ROP1质粒,免疫BALB/c小鼠,每只鼠注射100ug, 两周后同量加强免疫一次,以pcDNA3空质粒及生理盐水组为对照.于免疫后第50天用间接免疫酶法检测注射局部肌组织重组蛋白的表达;ELISA法测定IgG抗体滴度.结果免疫鼠肌组织石蜡切片呈特异性阳性反应;血清IgG抗体90天后测定为阳性;皮下及肌肉不同免疫途径血清均显示阳性结果,无显著性差异.结论 pcDNA3-ROP1质粒DNA免疫小鼠后,肌组织内有重组蛋白表达,并能诱导机体产生IgG抗体.     

微小隐孢子虫CP23 DNA疫苗免疫保护作用研究

目的研究微小隐孢子虫表面抗原CP23 DNA疫苗产生的免疫反应及对小鼠的免疫保护作用。方法选BALB/c小鼠60只,随机分为3组,即疫苗免疫组、PBS对照组及空质粒对照组。疫苗免疫组用构建的真核表达质粒pcDNA 3.0-23每隔2周免疫1次小鼠,共免疫3次。PBS对照组肌注等量PBS,空质粒对照组肌注pcDNA3.0,免疫方法及次数同疫苗免疫组。末次免疫2周后,分别取小鼠脾脏、血清,检测CD4+和CD8+T细胞、细胞因子IFN-γ及抗CP23特异性抗体IgG和IgA滴度;用微小隐孢子虫攻击感染被免疫小鼠,收集小鼠粪便,计算小鼠排出的卵囊量。结果 PBS对照组及空质粒组比较,疫苗免疫组小鼠的CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值及脾细胞培养上清中IFN-γ滴度均显著升高(P0.05),小鼠血清抗CP23特异性抗体IgG及IgA滴度随免疫次数增加显著升高(P0.05),攻击感染后小鼠排卵囊量显著减少(P0.05),且排出时间缩短。结论构建的微小隐孢子虫表面抗原CP23真核表达质粒能够诱导小鼠产生细胞及体液免疫反应,对小鼠有较好的免疫保护作用。     

弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗的研制

目的 研究廉价有效的抗弓形虫核酸疫苗,以用于人类和畜类弓形虫病的防治。方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取基因组DNA;根据ROP2基因序列,设计合成ROP2基因引物,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增ROP2基因片段,克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备抗弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗。应用该疫苗免疫小鼠,通过ELISA检测血清抗体,Western blot鉴定该疫苗的免疫原性;应用RH株弓形虫进行动物攻击实验,评价其安全性及免疫保护性。结果 以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段,克隆于pc-DNA3质粒中,成功构建了pc-DNA3-ROP2重组质粒。测序结果显示,重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP2的抗原蛋白。应用该疫苗免疫小鼠,能诱导产生强烈的细胞、体液免疫反应,使实验组小鼠攻虫感染后的存活时间明显延长,攻虫感染192 h后的存活率为77.8%,空质粒及PBS对照组存活率为0,差异有统计学意义（P〈0.001）;实验全程免疫小鼠未发生毒性及异常反应。结论 该核酸疫苗具有很强的免疫原性,安全可靠,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用,具有很好的开发应用价值。     

弓形虫ROP2核酸疫苗免疫保护作用的研究

目的 研究ROP2核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用。 方法 42只BALB/c小鼠随机分为3组：实验组、空质粒组和PBS对照组，各组小鼠分别肌注pc-DNA3-ROP2重组质粒50 μg、pc-DNA3空质粒50 μg和PBS 50 μl，共免疫3次，每次间隔3周，末次接种量均加倍。末次免疫后2周，各组分别取4只小鼠的血清、脾和淋巴组织，检测CD4⁺、CD8⁺ 及各细胞因子。其余各组每鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子500个，观察其存活时间等。 结果 ROP2核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应，小鼠血清抗体滴度高并能识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原；实验组小鼠的CD4⁺T细胞增殖明显(69.5±3.4)%、CD4+/CD8+ 比值显著升高(4.69±1.32)%（P<0.01）；其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-6、IL-12、γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF）均有不同程度的升高，尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180 h后，实验组小鼠免疫保护率为88.9%，与对照组相比，小鼠存活时间明显延长、初始死亡时间明显推迟（P<0.01）。 结论 ROP2核酸疫苗具有较强的免疫原性，能产生良好的免疫保护作用。     

SARS冠状病毒S蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果研究

目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白的两个片段S1和S2的基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-S1和pVAC-S2重组质粒。并通过Lipofectamine 2000将它们转染到HEK293细胞,RT-PCR和Western-blot鉴定重组质粒在真核细胞中的转录和表达。以构建的重组质粒直接免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及抗体亚类,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布。结果成功构建了重组真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,并可在HEK293细胞中获得表达。免疫小鼠三次后,抗体滴度达到了1∶3 200。pVAC-S1诱导了高滴度的IgG2a,IgG2b和IgG1,pVAC-S2刺激产生高滴度IgG2a,IgG2b和较高滴度的IgG3。脾脏T淋巴细胞亚群分析示pVAC-S1和pVAC-S2两免疫组小鼠CD3+和CD8+T细胞明显升高。结论构建的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2能在哺乳动物细胞中表达,免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。     

弓形虫主要表膜抗原SAG2 DNA疫苗的免疫保护作用研究

目的观察弓形虫pVAX1-SAG2真核重组质粒的免疫保护作用,为弓形虫病的免疫预防提供理论及实验依据。方法大量制备重组质粒,免疫小鼠,3周后同量加强免疫1次,5周后无菌取小鼠脾脏,制备脾细胞,用MTT法测定淋巴细胞转化率;用免疫荧光法测定CD4+、CD8+细胞。用弓形虫RH株速殖子经皮下注射攻击感染,每只鼠接种0.1 ml(约含1000个虫体),观察小鼠存活情况。结果对小鼠的脾脏T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+进行分析,与对照组比较,免疫组小鼠CD4+细胞显著增多(P<0.05);而CD8+细胞数各组之间差异无显著性(P>0.05);淋巴细胞转化率各组间差异无显著性(P>0.05);攻击感染后,pVAX1-SAG2免疫组小鼠平均存活(7.8±1.8)d,与对照组比较显著延长(P<0.05)。结论弓形虫pVAX1-SAG2真核重组质粒能在组织内表达,并诱导小鼠产生细胞免疫反应。     

弓形虫抗原与霍乱毒素A2/B亚基复合基因在小鼠体内诱导的免疫反应

目的　观察弓形虫主要表面抗原SAG1、SAG2 与霍乱毒素A2 /B亚基复合基因真核质粒经肌肉免疫小鼠所诱导的免疫反应。方法　将SAG1基因、SAG2 基因及CTXA2 /B基因定向连接插入真核表达质粒pcDNA3.1,经酶切及测序,获得pcDNA3.1 SAG1 SAG2 及pcDNA3.1 SAG1 SAG2 CTXA2 /B的重组子;碱裂解法大量制备经肌肉注射免疫BALB/c鼠,每只鼠经后腿肌肉注射质粒10 0 μg ,每2周免疫1次,共3次,以PcDNA3.1空质粒注射组及PBS组为对照,分别于每次免疫前断尾取血和免疫后4周取小鼠脾脏测定T淋巴细胞增殖活性及NK细胞活性,ELISA法测定IgG抗体。结果　免疫组小鼠的IgG抗体水平明显提高,NK细胞杀伤活性和T细胞增殖活性也明显增强。免疫鼠抗攻击感染的时间延长。结论　含有霍乱毒素的复合基因免疫小鼠后体液免疫和细胞免疫水平均有提高。     

弓形虫Chinese 1基因型Wh6弱毒株感染小鼠抗强毒株致死性感染的免疫保护作用

目的 研究我国流行的优势基因型Chinese 1弱毒Wh6株感染抗致死性强毒Wh3株攻击感染的保护力,探讨其潜在的制备减毒活疫苗的价值。方法 将30只BALB/c雌性小鼠随机分为3组(I,II,III组),每组10只。取弱毒株弓形虫保种小鼠脑组织,分离包囊,计数。I组小鼠灌胃包囊25-35个;II组给与PBS对照;III组正常小鼠不予任何干预。35 d后,I组感染小鼠脑组织压片镜检,查见典型弓形虫包囊,表明慢性弓形虫感染BALB/c小鼠模型建立成功。分别取Wh3株速殖子(3 000个),腹腔感染I组和II组小鼠,观察小鼠存活及腹腔虫荷;同时剖杀小鼠,收集脾细胞培养上清,采用流式细胞术、荧光定量PCR、酶联免疫吸附试验等检测脾细胞中的Th1、Th2细胞因子水平。结果 II组对照鼠在感染Wh3株弓形虫速殖子后第7 d内死亡5只,第8 d剩余5只全部死亡,随机取3只死亡小鼠对其腹腔进行计数,计数结果为(1.28±0.035 1)×10⁶/mL;而I组小鼠截止实验结束全部存活(P<0.01)。II组鼠脾细胞培养上清Th1细胞因子IFN-γ、IL-12和Th2细胞因子IL-10水平相比I组显著升高(P<0.001)。其中Th1细胞因子升高程度明显高于Th2细胞因子,巨噬细胞向Th1方向极化。结论 用弱毒株Wh6包囊攻击感染BALB/c鼠,可诱导强力的抵抗Wh3强毒株致死性感染的免疫保护力。Chinese 1基因型Wh6株具有候选减毒活虫疫苗研究的潜在价值。