肺癌脾虚痰湿型肿瘤相关证候差异表达基因的筛选与鉴定

目的：构建脾虚痰湿型肺癌肿瘤相关消减cDNA文库,以寻找脾虚痰湿型肺癌证候特异基因。方法：以原发性肺癌脾虚痰湿型的患者肿瘤组织及瘤旁正常组织为材料,分离Poly（A）RNA,反转录合成单链及双链cDNA,经Rsa I酶切,将肿瘤组织cDNA分成两组,分别与两种不同的接头连接,再与正常肺组织cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性PCR扩增,将第两次PCR产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行文库扩增,构建了消减cDNA文库,同法建立反向消减cDNA文库。对经反向斑点杂交验证,从cDNA文库中随机挑选的200个含差异片段的克隆,碱裂解法提取DNA,从克隆5’端进行单向测序。EST测序序列行生物信息学分析,所有基因聚类用BLASTX（E values〈10-5）和BLASTN（E values〈10-10）搜索GenBank的非冗余核酸序列数据库及蛋白质库予以注释。结果：经文库扩增,随机挑选克隆进行PCR鉴定,插入片段主要分布在250～1000bp之间,并以反向斑点杂交法进一步验证其阳性克隆,最终获得251个阳性克隆,其中正向消减文库获得165个阳性克隆,反向消减文库获得86个阳性克隆。测序发现了正向消减文库差异基因22个,反向消减文库差异基因6个。结论：成功构建脾虚痰湿型肺癌肿瘤相关消减cDNA文库,发现了那些有明确生物学功能的证候相关基因,其基因表达及分布特征初步反映了肺癌脾虚痰湿型在分子层面的证候特点。     

丹参叶片内生真菌群落结构及其与有效成分相关性分析

以5个不同地域丹参为材料,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术和高效液相色谱法(HPLC)探究了不同产地丹参叶片内生真菌群落结构特征与有效成分积累规律,进一步分析了二者的相关性。结果表明5个不同产地的丹参叶片内生真菌群落结构与有效成分的积累量均存在一定的相似性和差异性,二者相关性分析显示一些内生真菌与丹酚酸B、咖啡酸等几种有效成分的含量极显著相关(P <0.01)。     

丹参种子的生物学特性

目的:研究丹参种子的形态结构、萌发与贮藏特性,为丹参规范化栽培和种子长期贮藏提供参考。方法:形态结构研究采用体视显微镜和石蜡切片法观察种子的外观形态、解剖结构和显微结构并拍照;萌发特性研究考察丹参种子萌发的温度范围、最适宜温度以及光照对种子萌发的影响;贮藏特性研究考察不同贮藏含水量和贮藏温度下种子活力的变化,从而确定最优化的贮藏含水量和贮藏温度。结果:1丹参种子在15~35℃均萌发较好,最适萌发温度为20~30℃;15/25℃,20/30℃的变化温度能有效促进种子萌发,高温下光照可抑制种子萌发;2低温贮藏效果优于室温贮藏;较高或较低的含水量会导致种子活力的快速降低,丹参种子的最佳贮藏含水量为5%,贮藏温度为4℃。3丹参果实的果皮由黏液细胞层、薄壁细胞层、单层石细胞、厚壁细胞层组成。吸水后黏液细胞膨胀、破裂,释放出胶状黏液质。结论:丹参种子萌发温度范围广泛,可在大部分地区种植,育苗时可采用变温方法快速促进种子萌发,提高出苗率。含水量和贮藏温度是丹参种子贮藏中需要严格控制的重要指标,最适宜贮藏方法为低温干藏。丹参种子迅速而大量吸水的特性与黏液细胞层有关,这种结构虽然有利于种子保持水分、抵抗干旱,但不利于种子贮藏。     

丹参酚酸类成分研究进展

丹参药用历史悠久,资源丰富,为临床常用中药之一。现代研究表明酚酸类成分是丹参中的主要药效物质,具有保护心脑血管、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗纤维化等作用,已被广泛应用于心脑血管等多种疾病治疗。该文对丹参酚酸类化学成分和近十年国内外药理研究进行全面总结,分析其研究和开发前景,以期为丹参酚酸类成分的深入研究和开发利用提供科学依据。     

ICP-MS测定丹参提取物中钠元素含量

目的:建立测定丹参提取物中钠元素含量的方法.方法:采用硝酸为消解体系,经微波消解丹参提取物样品,通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定钠元素含量,为校正响应信号的变化及消除基体效应和仪器漂移的影响,选用铬元素作为内标溶液.结果:钠元素在0.00～10.00 mg·L-1具有良好的线性关系(r=0.9999),以杨树叶为工作标准物质测定回收率,平均回收率90.4％,RSD 3.8％ (n =6).结论:该方法稳定性、重复性、精密度良好,可用于测定丹参提取物中钠元素的含量.     

丹参二萜合酶基因CPS4的原核表达体系优化及活性蛋白纯化

目的:优化丹参柯巴基焦磷酸合酶基因家族新基因CPS4的原核表达体系并对重组蛋白进行纯化。方法:对2种原核表达菌株进行比较。对诱导条件,包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A600)和诱导时间进行正交试验。利用HisTrap HP蛋白纯化柱对重组蛋白进行纯化。结果:Escherichia coli Tuner(DE3)表达菌株能诱导产生更多的可溶重组蛋白。最佳诱导表达条件为诱导时宿主菌的A600值0.7,IPTG浓度0.2 mmol·L-1,诱导表达时间10 h。HisTrap HP蛋白纯化柱纯化时梯度洗脱能得到纯度高的重组蛋白。结论:利用此优化体系可得到足量用于后续研究的重组蛋白,为其他二萜类合酶基因的原核表达提供参考。     

丹参SmCOP1与调控丹参酮和丹酚酸合成相关转录因子互作筛选＊

目的 预测分析并克隆丹参E3泛素连接酶SmCOP1（constitutively photomorphogenic1），并对其靶基因进行初筛，为丹参次生代谢关键调控因子MYB以及bHLH等转录因子泛素化研究做准备。方法 本研究利用拟南芥AtCOP1蛋白序列，用HMMER3程序和在线程序SMART，在丹参全基因组数据库筛选到丹参中的E3泛素连接酶SmCOP1序列，经RT-PCR技术获得丹参cDNA，以其为模板设计引物扩增，并利用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行相关分析。通过酵母双杂实验对其调控丹参酮和酚酸物质机制进行初步研究。结果 结果表明SmCOP1的2个蛋白均为不稳定亲水性蛋白，其N-端为环形锌指结构域（RING–finger），C-端为WD40重复结构域。通过建立进化树表明SmCOP1b和AtCOP1是直系同源的关系，而SmCOP1a和SmCOP1b是旁系同源的关系。Y2H实验显示SmCOP1a与SmPAP1互作。结论 成功克隆并预测分析丹参E3泛素连接酶SmCOP1，并初步发现其可能通过靶向MYB转录因子SmPAP1对其泛素化修饰参与调控酚酸类物质的代谢。     

丛枝菌根真菌对丹参内源激素的影响

该文旨在初步探索接种地表球囊霉(Glomus versiforme,GV)真菌不同时期丹参内源激素含量的动态变化,实验设定对照组和菌根组,测定接种GV菌剂30,60,75,90,105,130 d丹参根系侵染率,同时采用ELISA方法测定内源激素ABA,ZR,GA,IAA,Me JA含量的动态变化。结果表明,接种菌根90 d丹参根部侵染率为90%,基本达到平衡;地上部分鲜重和叶片数显著高于对照组,约为对照组的2.7,1.96倍;除ABA外,丹参接种菌剂75 d地上部分其他内源激素含量均显著低于对照组(P0.05),分别约为对照组含量的63%~75%;接种菌剂90 d后地下部分内源激素含量均显著低于对照组(P0.05),分别约为对照组含量的45%~81%;接种GV菌剂105 d后地下部分内源激素含量均显著高于对照组(P0.05),分别高1.4~1.7倍;接种菌剂60,75,105 d地下部分ABA含量显著增加。因此,推论丛枝菌根真菌能促进丹参生长,且不同侵染时期影响丹参内源激素含量。     

丹参蛋白激酶SmSnRK2.4的克隆及表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶家族2(SnRK2)在逆境植物信号转导途径中起着重要作用。该研究根据丹参转录组数据从丹参c DNA中克隆得到一个SnRK2家族基因,命名为Sm SnRK2.4,属于Ⅰ类SnRK2。Sm SnRK2.4基因包含8个内含子,9个外显子,其开放阅读框1 068 bp,编码355个氨基酸,推测其蛋白相对分子质量为40.63 k Da,将其构建到原核表达载体p MAL-c2X上,原核诱导表达出与预测蛋白大小一致的目的蛋白。依据丹参基因组序列,Plant CARE分析Sm SnRK2.4起始密码子ATG上游3 0 0 0 bp的启动子系列,结果显示该序列包含I-box,GA-m otif,H SE,LTR,TC-rich repeats等逆境胁迫响应元件,以及GARE-m otif,P-box,ABRE,CGTCA-m otif等激素响应元件。实时荧光定量PCR分析表明Sm SnRK2.4在丹参根中的含量较高,在茎中和叶中含量相当,ABA和PEG胁迫响应分析表明,Sm SnRK2.4对PEG渗透胁迫响应显著,对ABA胁迫响应微弱。该研究为进一步探讨Sm SnRK2.4基因在丹参干旱胁迫下次生代谢产物积累机制中的作用奠定了基础。     

不同气候区丹参生物量、有效成分变化与气象因子的相关性研究

通过在陕西境内由南向北的3种典型气候区以及过渡带布设22个试验区,将同一种源丹参种苗于春季栽植于上述试验区,统一规范人工栽培管理,采用HPLC检测样品的二萜醌类成分(二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA),并测定生物量数据(根长、分根数、根直径和根干重)。由中国气象科学数据共享中心平台和陕西省农业气象服务中心获取试验区的降雨量、年均温、昼夜温差等10个关键农业生态气象因子。试验结果表明:同一种源的丹参在不同气候生境条件下获得的所有试验区丹参样品经检测均符合国家药典的限量标准,二氢丹参酮含量的变异系数最大。不同气候区的丹参根系形态差别较大。相关性分析结果表明:4—10月相对湿度、4—10月水气压、4—10月累积日照时数、4—10月昼夜温差和年均温是影响丹参品质的主要限制性气象因子,而4—10月20 cm平均地温、年活动积温、年均温、4—10月水气压、4—10月昼夜温差是影响丹参产量的主要限制性气象因子。丹参酮类物质均随纬度降低而升高,根的干物质积累量基本随纬度升高而降低,且随海拔升高而降低。相对于水分和温度条件,丹参对日照时数长短的要求并不严格。丹参可以适应多种气候条件,完成其正常生命过程,但与陕西北部的半干旱季风气候、中部的暖温带半湿润气候相比,南部的北亚热带湿润季风气候的相对温暖湿润气候条件更利于丹参的生长和有效成分的累积。     

丹参潜在性致病内生真菌的筛选及其致病相关酶酶学特性分析

目的:从18株丹参内生真菌中筛选具有潜在性致病作用的内生真菌,并对其致病机制进行探究。方法:采用内生真菌与组培苗共培养方式,根据组培苗的发病情况筛选出潜在性致病作用的内生真菌,测定活体外和活体根内的纤维素酶[羧甲基纤维素酶(Cx),β-葡萄糖苷酶(β-G)],果胶酶[多聚半乳糖醛酸酶(PG),聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)]和半纤维素酶(木聚糖酶)等细胞壁降解酶(CWDE)活性的变化。结果:在活体外,PG,PMG,木聚糖酶活性先增加后降低到后期基本不变,Cx,β-G酶活性随着培养时间的增加而持续升高。在活体内,9株潜在性致病内生真菌均能在组培苗根部组织产生细胞壁降解酶,但不同菌种差异较大。其中7株菌接种的组培苗根部Cx,β-G活性显著高于未接菌的根部(P0.05),6株菌接种的组培苗根部PG活性显著高于未接菌的根部(P0.05),9株菌接种的组培苗根部PMG以及木聚糖酶活性显著高于未接菌的根部(P0.05)。结论:Cx,β-G和PG,PMG以及木聚糖酶在潜在性致病内生菌的致病过程中起到了重要作用,是重要的致病因子,但各潜在性致病内生真菌的作用环节存在差异。