可溶性猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取与鉴定

目的 从猪膝关节软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白,并对其进行鉴定.方法 选择猪膝关节软骨为提取原料,用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶两步消化、氯化钠盐析、超纯水透析、离心浓缩等方法提取纯化Ⅱ型胶原蛋白;采用SDS-PAGE、氨基酸成分分析对提取的Ⅱ型胶原蛋白进行鉴定;利用冻干的方法计算提取的浓度.结果 SDS-PAGE电泳结果...     

羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定

目的 从羊肋软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白,并对其进行鉴定.方法 选择羊肋软骨为原料经脱脂、脱钙后,用盐酸胍去除蛋白多糖,经胃蛋白酶消化、氯化钠盐析等步骤,提取纯化蛋白,然后进行鉴定.结果 4mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖,用胃蛋白酶的限制性酶解结果满意;氯化钠盐析浓度为3mol/L时最佳.SDS-PAGE电泳结果显示提取纯化的蛋白与sigma公司的Ⅱ型胶原蛋白一致.Ⅱ型胶原蛋白最大吸收峰为212 nm.结论 从羊肋软骨提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高,且符合Ⅱ型胶原蛋白的特征.     

鼠尾胶原蛋白提取、分离、纯化方法的建立及鉴定

目的建立一种高效提取、分离、纯化鼠尾胶原蛋白的方法。方法通过对鼠尾进行剥离获得鼠尾腱,用Tris-HCl缓冲液、胃蛋白酶处理获得鼠尾胶原蛋白原液、反复使用氯化钠溶液进行分级盐析、醋酸溶液复溶进行鼠尾胶原蛋白的纯化。超纯水透析除去无机盐类获得纯化的鼠尾胶原蛋白。通过SDS-PAGE蛋白质电泳、氨基酸含量分析等技术手段鉴定。结果本研究建立的方法可以获得高纯度的鼠尾胶原蛋白,纯度达到电泳纯。与国外进口的商业化鼠尾胶原蛋白产品相比无差异。研究了提取、分离、纯化参数对得率、纯度的影响,建立了最优的鼠尾胶原蛋白提取条件,胃蛋白酶用量:1∶500,酶解时间:72 h,盐析浓度:2 mol/L,提取所用酸溶液:0.05mol/L醋酸溶液。结论为鼠尾胶原蛋白的扩大化生产提供了合适的工艺参数,为大量获得鼠尾胶原蛋白并进行更深层次的功效方面研究提供了理论支持和实践基础。     

鸡软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯与鉴定

目的探讨可溶性Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）的提纯方法。方法以雏鸡胸软骨为原材料,酸性条件下经胃蛋白酶消化,离心后,应用DEAE-Sephadex A-50进行离子交换层析,透析,盐析,得到纯化的CⅡ。结果自提的CⅡ样品与CⅡ标准品采用SDS-PAGE电泳显示条带一致。结论本法提纯CⅡ具有材料丰富,操作简便,重复性好等优点。     

Ⅱ型胶原微量提取与纯化

Ⅱ型胶原是关节软骨中主要细胞外间质之一,多种风湿性疾病的发生与Ⅱ型胶原异常有关。现已知类风湿关节炎发病与Ⅱ型胶原自身免疫反应有关,用Ⅱ型胶原免疫某些动物可诱导出多关节炎。然而口服Ⅱ型胶原可通过诱导免疫耐受来治疗类风湿关节炎,因此Ⅱ型胶原的提取是研究Ⅱ型胶原的重要步骤。虽然Ⅱ型胶原在人体含量较多,但临床取材可获得的数量有限,为此我们探讨了Ⅱ型胶原的微量提取和纯化方法。1　Ⅱ型胶原的提取与纯化方法　　真空干燥,4℃,获得Ⅱ型胶原(平均每2.5克关节软骨可获Ⅱ型胶原10ｍｇ)2　Ⅱ型胶原鉴定2.1　紫外分光光度计鉴定提取…     

胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

应用酶解及氯化盐析方法对4个种属Ⅱ型胶原的提纯及比较

Ⅱ型胶原是人体关节软骨中的主要组成部分。针对Ⅱ型胶原所产生的自身抗体可能与自身免疫疾病中的关节软骨破坏有关。我们利用猪、牛、鸡及人的软骨作为原材料 ,通过酸性法及中性法提取Ⅱ型胶原并用溴化氰裂解Ⅱ型胶原 ,为深入研究与Ⅱ型胶原有关的疾病及Ⅱ型胶原自身抗体形成机理提供物质基础。一、材料与方法1 材料 :猪、牛的气管软骨及鸡的肋软骨均可从市场购得 ,人的肋软骨来自引产胚胎及一些新鲜死婴。标准Ⅱ型胶原及其抗体为美国Ｓｉｇｍａ产品。2 方法 :(1)Ⅱ型胶原的提纯 :①分别将鸡、牛、猪及人的软骨剥净软组织 ,铰碎后用组织匀…     

人体正常膝关节钙化软骨层组成成分研究

目的 分析构成关节软骨钙化层有机成分中胶原蛋白类型与含量及无机成分中羟基磷灰石含量.方法 组织库获取20例自愿捐献的人体正常股骨髁新鲜标本,组织切片采用天狼猩红染色和免疫组织化学对胶原蛋白进行定性分析;用氨基酸分析和X-射线衍射法分别对胶原蛋白和羟基磷灰石进行定量分析.结果 天狼猩红染色见钙化软骨层与透明软骨层一样黄绿色淡染、弱双折光性;Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学分析,钙化软骨层呈强绿色荧光,潮线附近的胶原蛋白呈板层平行分布;氨基酸定量分析钙化软骨层Ⅱ型胶原蛋白含量占组织干质量的(20.16%±0.96%);X-射线衍射定量分析钙化软骨层中的羟基磷灰石含量占无机成分的(65.09%±2.31%).结论 在关节骨软骨复合组织中,钙化软骨层是位于透明软骨层与软骨下骨之间的界面连接结构,其细胞外基质主要由Ⅱ型胶原蛋白和羟基磷灰石组成.     

Ⅱ型胶原诱导关节炎大鼠模型的制备及评价

目的提取纯化Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)并制备胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型。方法采用胃蛋白酶消化法从鸡胸骨剑突上提取CⅡ,通过DEAE-52纤维树脂处理、NaC l的反复盐析纯化并采用SDS-PAGE鉴定和吸收光谱分析。所提CⅡ加以完全弗氏佐剂采用皮内注射的方法建立大鼠C IA模型。容积法检测大鼠足爪肿胀度并进行评分;HE染色法对关节组织作病理检查;ELISA法检测体内抗CⅡ抗体的含量;放免法检测血清细胞因子IL-1β、TNFα-含量。结果自提的CⅡ与标准品分子量一致,最大吸收峰为226 nm。CIA大鼠足爪的炎症反应强烈,关节肿胀明显;病理检查关节组织可见其组织纤维化,伴有大量炎性细胞浸润;血清中抗CⅡ抗体水平和IL-1β、TNFα-显著升高。结论该方法提纯CⅡ简单、高效,用以制备大鼠CIA模型成功。     

兔抗猪Ⅱ型胶原抗血清的制备与检测

目的：采用纯化的猪Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔制备Ⅱ型胶原抗体,并经改良的ELISA法检测确定Ⅱ型胶原抗体效价。方法：提取猪Ⅱ型胶原,经层析纯化,将纯化无菌Ⅱ型胶原与不完全佛氏佐剂等量混合,注射于兔脚掌、背部和皮下。并每隔20天追加抗原刺激,共3次,每隔一定时间收集血浆,以ELISA法检测抗Ⅱ型胶原抗体。结果：提纯猪Ⅱ型胶原纯度与Sigma标准品一致。Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔,抗体含量具二个高峰期,分别在首次致敏后第21天和第40天,免疫第40天抗血清的效价达1：2430。结论：采用纯化猪Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔短期内可产生高效价抗体。     

Ⅸ型胶原的研究进展

Ⅸ型胶原是一种由a1、a2和a3 3个不同的链通过链间的二硫键连接而成的三聚体形式的胶原蛋白分子。对经胃蛋白酶处理过的组织的提取物和小的蛋白聚糖进行的蛋白研究表明在软骨中存在特殊的胶原成分。通过分离Ⅸ型胶原多肽链及其编码的cDNA序列，构建了Ⅸ型胶原的结构模型，并且表明Ⅸ型胶原不同于经典的纤维性胶原（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原）。Ⅸ型胶原主要存在于透明软骨、玻璃体、腰椎间盘中，与腰椎间盘疾病、多发性骨骺发育不良及周围神经系统发育有相关性，而其与口腔颌面部软骨疾病的关系至今未见报道。本文就其研究进展作一综述。     

鼠尾肌腱胶原蛋白的提取及凝胶的制备

为了探索鼠尾肌腱胶原蛋白在实验医学中的应用,用简单的方法溶解新鲜大白鼠鼠尾肌腱,从中提取较纯的胶原蛋白,制成胶原凝胶。将提取的胶原蛋白液进行定性、定量鉴定。结果：提取液主要为Ｉ型胶原蛋白：７２小时３７℃恒温培养箱内培养无细菌生长;紫外分光度计测定,吸收高峰为２３０ｎｍ;氨基酸成分主要为甘氨酸：占４０％,脯氨酸：１４．３％,显微镜下见：相互交织的胶原原纤维结构组成的网状结构;纤维均匀,有规则横纹。胶     

离心法制得角膜胶原膜的检测与实验研究

目的 旨在说明新法－－离心法制得角膜胶原膜的意义。方法 鉴定分析了由猪巩膜中提取纯化的胶原并由该胶原经离心法制得角膜胶原膜的理化生物指标进行检测与实验研究。结果 提取纯化的胶原属大量１型及少量３型胶原蛋白，离心法制得角膜胶原膜的多项理化指标可达到或优于国内外同类产品指标。结论 本研究可为法制得角膜胶原膜的应用提供科学的依据。     

猪精浆液中磷脂酰乙醇胺结合蛋白4的纯化及其一级结构分析

目的：从猪精浆中纯化磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族的一个新成员--猪磷脂酰乙醇胺结合蛋白4（sus PEBP4) ,为进一步研究其功能奠定理论基础。方法：利用饱和硫酸铵盐析、Q-Sepharose、Matrex Gel Red A、SP-XL-Sepharose和FPLC Mono-S(A)柱层析从500 mL猪精浆中纯化sus PEBP4,自动氨基酸测序仪进行N-末端氨基酸测序及内部序列分析。生物信息学方法分析其与人、牛和狗的序列同源性。结果：经SDS-PAGE电泳分离鉴定得到了相对分子质量为25　000的单一区带的sus PEBP4。生物信息学方法分析显示,其与人、牛和狗之间氨基酸序列同源性为75.2%～81.8%之间。结论：从猪精浆中制备了电泳纯的PEBPs家族的新成员sus PEBP4,明确了其一级结构,生物信息学分析显示其与其他生物体氨基酸同源性高。     

药用载体胶原的提取与鉴别

目的 对胶原蛋白这种新型药物载体的提取、纯化与鉴别作较为全面的研究.方法 采用酸提法从鼠尾肌腱中提取I型胶原蛋白,并用紫外扫描法、SDS-PAGE和IEF进行分析和鉴别.结果 实验证实从鼠尾肌腱中提取的胶原为Ⅰ型胶原蛋白并得到其相应的分子量及等电点PI.结论 本实验为药物载体胶原的提取与鉴别、提供了简便易行的方法.     

同种异体组织工程化软骨组织的生化分析

目的 以胚胎来源的关节软骨细胞,体内构建同种异体组织工程化软骨组织,分析其与正常关节软骨组织糖胺多糖(GAG)和Ⅱ型胶原含量的差异。方法 以酶消化法分离胚胎(100 d)山羊关节软骨细胞,与生物材料聚环氧乙烯复合,并植入异体成年山羊腹部皮下。按不同时间段取材,Western-blot、MTT比色法分析测定其GAG和Ⅱ型胶原含量,并与正常关节软骨组织比较。结果 新生软骨中GAG的含量比正常关节软骨显著下降(P<0.01),而Ⅱ型胶原含量与正常关节软骨无显著性差异。结论 胚胎来源的同种异体组织工程化软骨与正常关节软骨有着相同的生化成分,且新生软骨中Ⅱ型胶原的含量与正常关节软骨接近。     

兔抗猪Ⅱ型交原抗血清的制备与检测

目的 采用纯化的猪Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔制备Ⅱ型胶原抗体，并经改良的ＥＬＩＳＡ法检测确定Ⅱ型胶原抗体效价。方法 提取猪Ⅱ型胶原，经导析纯化，将纯化无菌Ⅱ型胶原与不完全佛氏佐剂等量混合，注射于兔脚掌、背部和皮下。并每隔２０天追加抗原刺激，共３次，每隔一定时间收集血浆，以ＥＬＩＳＡ法检测抗Ⅱ型胶原抗体。结果 提纯猪Ⅱ型胶原纯度与Ｓｉｇｍａ标准品一致。Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔，抗体抗量具有二个高峰期，     

同种异体组织工程化软骨组织的生化分析

目的以胚胎来源的关节软骨细胞,体内构建同种异体组织工程化软骨组织,分析其与正常关节软骨组织糖胺多糖(GAG)和Ⅱ型胶原含量的差异.方法以酶消化法分离胚胎(100 d)山羊关节软骨细胞,与生物材料聚环氧乙烯复合,并植入异体成年山羊腹部皮下.按不同时间段取材, Western-blot、MTT比色法分析测定其GAG和Ⅱ型胶原含量,并与正常关节软骨组织比较.结果新生软骨中GAG的含量比正常关节软骨显著下降(P<0.01),而II型胶原含量与正常关节软骨无显著性差异.结论胚胎来源的同种异体组织工程化软骨与正常关节软骨有着相同的生化成分,且新生软骨中II型胶原的含量与正常关节软骨接近.     

猪耳软骨脱细胞基质氨基酸成分的分析

为比较软骨脱细胞基质与新鲜软骨之间组成成分的差别，使用氨基酸分析仪对新鲜猪耳及其脱细胞基质的成分进行分析。结果脱细胞软骨基质的氨基酸含量高于新鲜软骨，但换算成为氨基酸的个数时，二者相同。表明脱细胞软骨的主要组成成分为Ⅱ型胶原。     

Ⅰ型胶原蛋白复合碱性成纤维细胞因子海绵的研制

以猪筋腱为主要原料提取和纯化I型胶原蛋白，并对其理化性质进行分析，包括SDS－PAGE蛋白质凝胶电泳、氨基酸成份分析、紫外最大吸收光谱等。经过鉴定，证实所提取的是高纯度的I型胶原蛋白。在I型胶原蛋白溶液中加入重组的人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF)，经冷冻干燥成为海绵状的终成品，研制成为一种新型的生物医学材料。