微小RNA调节声门上型喉癌上皮-间质转化的初步研究

目的 探讨声门上型喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)颈淋巴转移中上皮-间质转化过程相关的小分子RNA(microRNA,miRNA).方法 对12例声门上型喉鳞癌患者(淋巴转移组6例,非淋巴转移组6例)的原发肿瘤组织进行miRNA芯片筛选;对40例声门上型喉鳞癌患者(淋巴转移组20例,非淋巴转移组20例)通过实时定量PCR法验证筛选出的显著差异表达的miRNA;应用生物信息学预测已验证的miRNA的靶基因,根据各基因的功能筛选与上皮-间质转化相关的基因,对应找到可能与声门上型喉鳞癌颈淋巴转移中上皮-间质转化过程相关的miRNA.结果 芯片筛选结果显示10个miRNA在两组间的表达差异有意义,其中在6例转移组中上调的有miR-192、miR-634、miR-223、miR-409、miR-365、miR-143、miR-1224、miR-30d和miR-1249,下调的有miR-494.40例较大样本验证结果与芯片筛选结果相符.通过靶基因预测及功能分析,miR-192、miR-143、miR-409及miR-634可能通过抑制Krüppel样转录因子、E-钙黏蛋白和磷脂酰肌醇3-激酶等靶基因的转录上调上皮-间质转化过程,从而促进声门上型喉鳞癌颈淋巴转移.结论 筛选和验证与声门上型喉鳞癌颈淋巴转移相关的miRNA,miR-192、miR-143、miR-409及miR-634的表达失调可能在声门上型喉鳞癌转移的上皮-间质转化过程中扮演着重要的角色,需要进一步深入研究.     

MiR-22经上皮-间质转化调控头颈鳞癌的侵袭转移

目的探讨miR 22对头颈部鳞状细胞癌（头颈鳞癌）上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition, EMT）和侵袭转移的影响。方法利用脂质体介导的miR 22 mimic及inhibitor（含阴性对照）分别转染头颈鳞癌Tu686细胞,划痕实验及Transwell侵袭实验检测其体外迁移及侵袭能力的改变,Western blotting检测EMT分子标志物的改变。结果hsa miR 22 mimic能抑制Tu686细胞的体外迁移及侵袭能力,相反hsa miR 22 inhibitor能促进Tu686细胞的体外迁移及侵袭能力。且miR 22过表达后能在Tu686细胞中抑制EMT的分子标志物改变,即E cadherin的表达上调和Vimentin的表达下调。结论本研究表明miR 22对头颈鳞癌细胞的体外迁移侵袭能力具有调控作用,该调控作用的发生与miR 22对EMT的抑制作用密切相关。     

AEG-1介导上皮-间质转化调控头颈部鳞状细胞癌的侵袭转移

目的分析星形胶质细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)可介导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)调控头颈鳞癌侵袭转移的分子机制。方法采用慢病毒介导AEG-1的上调载体上调AEG-1在头颈鳞癌Tu686细胞中的表达,划痕愈合实验、Transwell侵袭小室实验检测其体外迁移侵袭能力的改变,同时Western blot检测EMT分子标志物E-cadherin及Vimentin的表达情况。结果 Tu686细胞中AEG-1表达上调后,细胞划痕愈合率增加,穿过Transwell聚碳酸酯膜的细胞明显增多,且Tu686细胞上皮细胞标志物E-cadherin的表达量显著下调,间质细胞标志物Vimen-tin表达显著上调。结论 AEG-1表达上调可显著提高头颈部鳞癌细胞的体外侵袭能力,且该侵袭能力的增强可能与AEG-1介导的EMT改变密切相关。     

TrkB通过调控PI3K/AKT途径诱导喉癌Hep-2细胞上皮间质化发生的作用机制研究

目的　观察TrkB如何通过PI3K/AKT通路诱导喉癌Hep-2细胞上皮间质化发生的作用机制并探讨其意义。方法　分别用含0、100、500、1000 nmol/L抑制剂K252a作用于Hep-2细胞,CCK-8法检测细胞的增殖活性,划痕法检测细胞的迁移能力,Transwell小室法检测细胞的侵袭能力,同时用Western-blot检测Hep-2细胞中p-Akt、p-c-Src、E-cadherin蛋白的表达情况。结果 100 nmol/L组在各时间点对Hep-2细胞增殖的抑制率分别为17.8%、20.5%、19.7%;500 nmol/L组在各时间点对Hep-2细胞增殖的抑制率分别为48.2%、46.8%、45.9%;1000 nmol/L组在各时间点对Hep-2细胞增殖的抑制率分别为51.3%、83.0%、81.5%;K252a（1000 nmol/L）组迁移率及穿膜细胞数分别为21%及46,对照组迁移率及穿膜细胞数分别为69%和221,差异均具有统计学意义（t =1.235、t =3.416,P 均<0.01）;与对照组比较,K252a（1000 nmol/L）组Hep-2细胞中p-Akt及p-c-Src蛋白表达量显著降低,分别为0.93±0.12、0.21±0.05、0.72±0.09、0.14±0.02,差异均有统计学意义（t =3.578、2.634,P 均<0.01）;且对照组中E-cadherin蛋白表达量为0.14±0.02,K252a（1000 nmol/L）组Hep-2细胞中E-cadherin蛋白表达量为0.75±0.08,差异有统计学意义（t =2.852,P <0.01）。结论 TrkB可能通过激活PI3K/Akt信号通路来诱导喉癌细胞EMT的发生。     

转化生长因子β诱导的上皮间质化与头颈部鳞状细胞癌

上皮间质化（epithelial mesenchymal transition,EMT）作为肿瘤侵袭转移的演变过程,以上皮特性丧失和间质特性获得为主要特征。转化生长因子β（transforming growth factor beta,TGF—β）作为一有效诱导物,在肿瘤侵袭转移中有重要影响。本文就EMT及其诱导物TGF—β在肿瘤侵袭转移中的作用做一综述。     

微小RNA-30a-5p调控喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖和凋亡的机制探讨

目的　探讨miR-30a-5p对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖凋亡的影响及其机制。方法 用实时荧光定量PCR检测喉癌及癌旁组织中miR-30a-5p的表达;将Hep-2细胞分为NC组（转染miR-30a-5p mimics阴性对照）、miR-30a-5p组（转染miR-30a-5p mimics）、anti-NC组（转染miR-30a-5p inhibitor阴性对照）和anti-30a-5p组（转染miR-30a-5p inhibitor）,MTT实验、平板克隆形成实验和Annexin V-FITC/PI 双染实验分别检测细胞增殖、克隆形成和细胞凋亡情况。双荧光素酶报告基因实验检测miR-30a-5p和SOX9的靶向关系。结果　与癌旁组织表达量（1.00±0.10）相比,喉癌组织中miR-30a-5p的表达水平（0.37±0.03）显著降低（P <0.05）。与NC组相比,miR-30a-5p组细胞活性（48小时：0.42±0.03 vs 0.58±0.04）降低,细胞克隆数（75.36±6.85 vs 136.25±10.50）降低,细胞凋亡率[（23.86±2.21）% vs（9.95±1.16）%]升高（P <0.05）。双荧光素酶报告实验结果显示,转染SOX9-WT质粒的Hep-2细胞荧光素酶活性明显降低（P <0.05）,而转染SOX9-MUT质粒的Hep-2细胞荧光素酶活性无显著变化。anti-miR-30a-5p组对He p -2细胞的作用与miR-30 a -5p组相反。结论  miR-30a-5p可能通过靶向下调SOX9抑制喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖并促进细胞凋亡。     

上调miR-200b对人喉癌Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨上调miR-200b对人喉癌Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。 方法 培养人喉癌Hep-2细胞,随机分为miR-200b模拟物组、miR-对照序列组和空白对照组,利用实时荧光定量PCR技术检测各组细胞中miR-200b表达,MTT法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力,Western blotting法检测各组细胞中E-cadherin、N-cadherin、β-catenin蛋白表达。 结果 与空白对照组和miR-对照序列组相比,miR-200b模拟物组细胞中miR-200b相对表达量显著升高,差异有统计学意义(F=70.766, P<0.001);与空白对照组［(0.22±0.05)、(0.45±0.07)、(0.59±0.06)、(0.72±0.08)和(0.85±0.07)］和miR-对照序列组［(0.24±0.06)、(0.46±0.08)、(0.61±0.07)、(0.70±0.05)和(0.84±0.06)］相比,miR-200b模拟物组细胞24、48、72、96 h时吸光度A值［(0.21±0.04)、(0.29±0.06)、(0.40±0.04)、(0.53±0.07)和(0.58±0.05)］均降低,差异均有统计学意义(F=0.134, P=0.876; F=6.449, P=0.010; F=37.299, P<0.001; F=5.352, P=0.018; F=29.921, P<0.001);与空白对照组［(140.2±2.3)、(127.9±6.0)］和miR-对照序列组［(141.0±1.2)、(130.4±7.4)］相比,miR-200b模拟物组迁移细胞数和侵袭细胞数［(98.5±2.4)、(90.9±2.8)］均减少,差异均有统计学意义(F=845.523, P<0.001; F=88.859, P<0.001);与空白对照组［(0.35±0.07)、(0.54±0.10)、(0.76±0.12)］和miR-对照序列组［(0.24±0.03)、(0.60±0.14)、(0.65±0.24)］相比,miR-200b模拟物组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量(0.54±0.14)升高,而N-cadherin、β-catenin蛋白相对表达量［(0.31±0.10)、(0.35±0.06)］降低,差异均有统计学意义(F=17.287, P<0.001; F=10.083, P=0.002; F=10.434, P=0.001)。 结论 上调喉癌细胞中miR-200b基因表达可减少细胞增殖,抑制细胞迁移和侵袭能力,其机制可能与抑制上皮-间质转化过程有关。     

转化生长因子β1联合表皮生长因子诱导上皮向间质转化对人喉癌细胞株Hep-2侵袭能力影响的研究

目的探讨转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)联合表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)诱导上皮向间质转化对人喉癌细胞株Hep-2侵袭能力的影响。方法应用TGF-β1单独刺激和TGF-β1联合EGF刺激人喉癌细胞株Hep-2后24、48 h观察细胞形态学的动态变化。应用Transwell检测细胞侵袭能力及RT-PCR和Western blot技术检测细胞上皮钙依赖黏附蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的表达。结果①TGF-β1单独处理48 h组和TGF-β1联合EGF处理24、48 h组均能刺激喉癌细胞株Hep-2发生细胞形态改变。②TGF-β1联合EGF处理组无论是24 h还是48 h,其Hep-2细胞的侵袭能力都明显强于相同时段TGF-β1单独处理组(P<0.05);TGF-β1单独处理48 h组细胞侵袭能力又明显强于对照组(P<0.05)。③TGF-β1联合EGF处理组E-cadherin的表达降低,而Vimentin表达却明显上升。结论 EGF能够协同TGF-β1诱导上皮向间质转化,从而使喉癌具有更强的侵袭能力。     

长链非编码RNA核富集转录体1促进喉鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的机制研究

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)核富集转录体1(NEAT1)NEAT1对喉鳞状细胞癌(LSCC)细胞迁移和侵袭的影响,并进一步分析miR-429/锌指E-盒结合同源异形盒1(ZEB1)轴在其中发挥的作用。方法 慢病毒转染建立稳定敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞,通过RT-qPCR检测细胞lncRNA NEAT1表达以验证转染效率,通过Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,通过Western blot检测细胞上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达。通过生物信息学分析miR-429与lncRNA NEAT1和ZEB1 mRNA间的潜在结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-429与lncRNA NEAT1以及miR-429与ZEB1 mRNA结合。将miR-429抑制剂转染敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞,通过Western blot检测细胞ZEB1表达。进一步检查敲减ZEB1对抑制miR-429的敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞迁移、侵袭和EMT的影响。结果 敲减lncRNA NEAT1降低LSCC细胞lncRNA NEAT1表达,抑制细胞迁移和侵袭并下调细胞N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达。miR-429与lncRNA NEAT1和ZEB1 mRNA间存在潜在结合位点,且miR-429与lncRNA NEAT1以及miR-429与ZEB1 mRNA结合。抑制miR-429逆转了敲减lncRNA NEAT1对LSCC细胞ZEB1表达的抑制作用。此外,敲减ZEB1逆转了抑制miR-429对敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞迁移和侵袭的促进作用及EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达的上调作用。结论 lncRNA NEAT1促进LSCC细胞迁移和侵袭,其机制可能与海绵化miR-429上调ZEB1表达促进LSCC细胞EMT有关。