胰腺癌Panc-1细胞TFPI-2基因甲基化状态与其体内体外侵袭能力的关系

目的:探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine,5-Aza-dC)对胰腺癌Panc-1细胞体内体外侵袭能力及裸鼠皮下移植肿瘤组织TFPI-2基因甲基化状态及表达的影响.方法:用不同浓度的5-Aza-dC处理胰腺癌Panc-1细胞.Transwell法测定各组Panc-1细胞的体外侵袭能力.将用药物处理过的各组Panc-1细胞分别接种于裸鼠皮下,观察各组成瘤率及肿瘤大小.用MSP及RT-PCR检测裸鼠移植瘤组织TFPI-2基因甲基化状态及TFPI-2基因mRNA表达情况.结果:与对照组相比,药物处理组Panc-1细胞体外侵袭能力明显下降,裸鼠成瘤率明显降低,第八周时,肿瘤体积明显低于对照组(P<0.05).与对照组相比,TFPI-2基因异常甲基化状态在药物处理组裸鼠移植瘤组织中得到逆转,药物处理组移植瘤TFPI-2基因mRNA重新表达,并呈剂量依赖性(P<0.05).结论:甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷可能在一定程度上抑制人胰腺癌Panc-1细胞系的体内体外侵袭和生长能力,其机制可能与逆转TFPI-2基因高甲基化状态从而恢复其表达有关.     

胰腺癌Panc-1细胞TFPI-2基因甲基化状态与其体内体外侵袭能力的关系

目的：探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine,5-Aza-dC）对胰腺癌Panc-1细胞体内体外侵袭能力及裸鼠皮下移植肿瘤组织TFPI-2基因甲基化状态及表达的影响。方法：用不同浓度的5-Aza-dC处理胰腺癌Panc-1细胞。Transwell法测定各组Panc-1细胞的体外侵袭能力。将用药物处理过的各组Panc-1细胞分别接种于裸鼠皮下,观察各组成瘤率及肿瘤大小。用MSP及RT-PCR检测裸鼠移植瘤组织TFPI-2基因甲基化状态及TFPI-2基因mRNA表达情况。结果：与对照组相比,药物处理组Panc-1细胞体外侵袭能力明显下降,裸鼠成瘤率明显降低,第八周时,肿瘤体积明显低于对照组（P〈0.05）。与对照组相比,TFPI-2基因异常甲基化状态在药物处理组裸鼠移植瘤组织中得到逆转,药物处理组移植瘤TFPI-2基因mRNA重新表达,并呈剂量依赖性（P〈0.05）。结论：甲基化酶抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷可能在一定程度上抑制人胰腺癌Panc-1细胞系的体内体外侵袭和生长能力,其机制可能与逆转TFPI-2基因高甲基化状态从而恢复其表达有关。     

α-奈黄酮对人类卵巢癌紫杉醇耐药细胞裸鼠移植瘤CYP1B1基因表达的影响

目的研究黄酮类化合物α-奈黄酮（α-NF）对人类卵巢癌耐药细胞株A2780TS裸鼠移植瘤CYP1B1基因的影响。方法采用A2780TS细胞移植成功的24只裸鼠分为对照组、ANF组、紫杉醇组及联合用药组（α-NF＋紫杉醇）。RT—PCR及Western blotting方法测定CYP1B1 mRNA及蛋白表达水平。结果CYP1B1 mRNA表达水平α-NF组及联合用药组与对照组差异无统计学意义（P〉0．05）,但CYP1B1蛋白表达水平α-NF组及联合用药组较对照组明显降低（P〈0．01）。结论α-NF在mRNA水平对CYP1B1基因无调节作用,在蛋白水平可下调A2780TS裸鼠移植瘤细胞CYP1B1的表达,发挥逆转A2780TS细胞紫杉醇耐药的作用。     

紫杉醇治疗卵巢癌裸鼠移植瘤过程中WT1的表达及意义

研究紫杉醇治疗卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤过程中WT1基因的表达和意义。方法:建立卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤模型,随机进行紫杉醇化疗（紫杉醇组）及生理盐水（对照组）处理,测量移植瘤体积并对移植瘤标本进行苏木精-伊红染色、流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期改变、免疫组化检测Bcl-2及WT1蛋白表达、RT-PCR检测WT1 mRNA的表达。结果:紫杉醇化疗对裸鼠移植瘤的生长具有明显的抑制作用,与对照组相比,紫杉醇组细胞凋亡率增加（P<0.05）;同时,移植瘤组织中Bcl-2、WT1蛋白及WT1 mRNA的表达均显著下降（P<0.05）。结论:WT1基因在卵巢癌凋亡过程中可能发挥着一定的作用,其作用机制或许与抗凋亡基因Bcl-2有关。      

5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及DNA甲基化的影响

背景与目的:顺铂能造成细胞内DNA的损伤,而DNA错配修复蛋白能发现顺铂导致的DNA损伤,产生损伤信号,诱导细胞凋亡,从而摧毁肿瘤细胞.hMLH1是DNA错配修复系统的一个重要成员,其缺失能导致肿瘤对顺铂的耐受.本研究目的在于探讨卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及其基因启动子区DNA甲基化状态,同时探讨去甲基化制剂——5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)和组蛋白脱乙酰化酶抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对hMLH1表达及DNA甲基化的逆转作用.方法:应用5-Aza-dC和TSA作用于卵巢癌细胞COC1与其顺铂耐药细胞COC1/DDP,应用甲基化特异性PCR、RT-PCR和Western blot检测上述两种细胞中hMLH1基因启动子区DNA甲基化、hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的变化.MTT法检测药物对细胞增殖的影响.结果:COC1细胞存在hMLH1 mRNA和蛋白的表达,其启动子区域表现为DNA非甲基化.单独应用5-Aza-dC、TSA及联合应用5-Aza-dC和TSA对COC1细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05),细胞形态变化不明显.COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白表达缺失,启动子区域表现为DNA甲基化.5-Aza-dC不但能使COC1/DDP细胞中hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且能使表达缺失的hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白重新表达.TSA对COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05).联合应用5-Aza-dC和TSA不但能使hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且与单独应用5-Aza-dC相比较,对hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的影响更明显(P<0.05).5-Aza-dC单用及联合应用TSA对COC1/DDP细胞生长抑制率明显高于COC1组、阴性对照组(P<0.05).结论:COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性与hMLH1mRNA和蛋白的表达缺失有关,而hMLH1基因和蛋白的表达缺失与其基因启动子区DNA甲基化相关,5-Aza-dC单用及联合TSA使hMLH1基因发生DNA去甲基化,促进hMLH1的表达,逆转COC1/DDP细胞对DDP的耐药性.     

mdr1启动子调控CD::UPP基因对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的杀伤作用

目的探讨腺病毒介导的mdr1启动子调控胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶磷酸核糖转移酶(CDUPP)融合基因联合5-氟胞嘧啶(5-FC)对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的特异性杀伤作用.方法扩增、纯化含有mdr1-CDUPP基因的重组腺病毒,转染人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol和亲本细胞株A2780,RT-PCR检测mdr1和CDUPP基因的表达水平;之后加入5-FC,MTT法检测细胞抑制情况及旁观者效应,并观察腺病毒转染后裸鼠移植瘤的生长情况.结果mdr1和CDUPP基因在A2780/Taxol细胞中可稳定表达,转染后A2780/Taxol组的细胞生长明显低于A2780组;转基因的A2780/Taxol细胞联合5-FC后可通过旁观者效应杀伤周围未转基因的耐药细胞;耐药组移植瘤生长明显受到抑制,肿瘤体积为(569.10±187.93)mm3,对照组肿瘤体积为(2 111.98±230.82)mm3,差异有统计学意义(P＜0.01).结论mdr1启动子可调控CDUPP基因特异性表达并特异性杀伤紫杉醇耐药卵巢癌细胞.     

5-Aza-CdR对人结肠癌裸鼠移植瘤抑制作用及其机制的研究

目的 观察DNA甲基化转移酶抑制剂5氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza CdR)对人结肠癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用,探讨其与移植瘤细胞RUNX3基因表达和甲基化的相关性.方法 皮下接种SW480细胞建立人结肠癌裸鼠移植瘤模型.应用随机数字表法分为3组,A组为对照组,腹腔注射磷酸盐缓冲液(2 μg/g);B组为低剂量实验组,腹腔注射5-Aza-CdR(1 μg/g);C组为高剂量实验组,腹腔注射5-Aza-CdR(2 μg/g).各组每周给药3次,连续给药4周,末次给药后处死裸鼠.观察各组移植瘤生长情况及病理形态学改变,并采用TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况,MSP法检测RUNX3基因的甲基化状态,Real time RT-PCR及免疫组化检测RUNX3的表达水平,分析组间统计学差异.结果 给药4周后,A组移植瘤体积为(3.63±1.00) cm3,B组(3.02±1.43) cm3,C组(1.80±0.80) cm3,C组与A、B组比较,差异有统计学意义,F=7.061,P=0.003.TUNEL法检测结果显示,C组移植瘤凋亡指数较高,为(5.66±0.70)％,与A组(1.14±0.45)％、B组(2.83±0.69)％比较,差异有统计学意义,F=53.631,P＜0.001.基因甲基化检测发现,A组有较高的RUNX3基因甲基化水平,而B组及C组的RUNX3基因的非甲基化务带明显扩增;而且在RUNX3基因表达上,A组mRNA相对表达量为14.84±0.53,明显低于B组的21.66±0.45、C组的46.72±2.64,差异有统计学意义,F=910.128,P＜0.001;A组RUNX3蛋白阳性表达率为(6.84±2.21)％,亦明显低于B组(14.54±3.98)％及C组(16.25±2.71)％,差异有统计学意义,F=10.745,P=0.004.结论 5-Aza-CdR可有效抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的生长,诱导移植瘤细胞凋亡,其机制与逆转RUNX3基因的过甲基化状态,诱导移植瘤细胞RUNX3基因的重新表达相关.     

5-Aza-dC对胰腺癌细胞系Panc-1中TFPI-2基因甲基化水平及表达的影响

目的探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-A2a-dc)对胰腺癌细胞系Panc-1中抑癌基因组织因子途径抑制物-2（TFPI-2）甲基化水平及基因表达的影响。方法用不同浓度5-Aza-dC处理胰腺癌细胞系Panc-1。用甲基化特异性PCR（MS-PCR）,反转录聚合酶链（RT-PCR）及蛋白印迹实验（Western blot）检测药物处理前后Panc-1细胞TFPI-2基因的甲基化状态,mRNA及蛋白表达的改变。结果MSP检测Panc-1细胞TFPI-2基因药物作用后异常甲基化得到逆转,RT-PCR检测到不同浓度5-Aza-dC处理后TFPI-2基因mRNA重新表达,相对表达量分别为（0.211±0.087）,（0.327±0.068）,（0.609±0.017）,Western blot检测TFPI-2基因蛋白重新表达,相对表达量分别为（0.429±0.121）,（0.675±0.044）,（1.132±0.124）,以上作用呈时间、剂量依赖性（P<0.05）,差异具有统计学意义。结论胰腺癌细胞系Panc-1中抑癌基因TFPI-2启动子高甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5-Aza-dC能够较成功的逆转胰腺癌细胞Panc-1中TFPI-2基因的高甲基化状态,并能恢复TFPI-2基因的mRNA及蛋白重新表达。     

mdr1启动子调控CD∷UPP基因对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的杀伤作用

目的:探讨腺病毒介导的mdr1启动子调控胞嘧啶脱氨酶∷尿嘧啶磷酸核糖转移酶(CD∷UPP)融合基因联合5-氟胞嘧啶(5-FC)对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的特异性杀伤作用。方法:扩增、纯化含有mdr1-CD∷UPP基因的重组腺病毒,转染人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol和亲本细胞株A2780,RT-PCR检测mdr1和CD∷UPP基因的表达水平;之后加入5-FC,MTT法检测细胞抑制情况及旁观者效应,并观察腺病毒转染后裸鼠移植瘤的生长情况。结果:mdr1和CD∷UPP基因在A2780/Taxol细胞中可稳定表达,转染后A2780/Taxol组的细胞生长明显低于A2780组;转基因的A2780/Taxol细胞联合5-FC后可通过旁观者效应杀伤周围未转基因的耐药细胞;耐药组移植瘤生长明显受到抑制,肿瘤体积为(569.10±187.93)mm3,对照组肿瘤体积为(2111.98±230.82)mm3,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:mdr1启动子可调控CD∷UPP基因特异性表达并特异性杀伤紫杉醇耐药卵巢癌细胞。     

5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌裸鼠移植瘤的抑制作用

背景与目的:5-杂氮-2′-脱氧胞苷是DNA甲基转移酶抑制剂,能使因甲基化而失活的抑癌基因重新激活,进而抑制肿瘤的生长。本文观察了5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞及其裸鼠移植瘤的抑制作用,探讨其抗肿瘤效应及可能的机理,寻找鼻咽癌治疗的新靶点。方法:用5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理人鼻咽癌细胞,观察其对细胞生长的抑制及死亡相关蛋白激酶基因(death-associated proteinkinase,DAPK)甲基化情况。建立人鼻咽癌移植瘤裸鼠模型,用5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理裸鼠,观察移植瘤的生长情况,并用RT-PCR和免疫组织化学技术检测DAPK基因mRNA及蛋白表达的变化。结果:未经5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理的CNE细胞中DAPKmRNA不表达。经5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理后,不同药物浓度组的细胞中均有DAPKmRNA表达,且表达随浓度增高而增强。5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞及其裸鼠移植瘤的生长均有明显的抑制作用,且能使失活的DAPK基因重新激活。药物作用4周后,用药组裸鼠体重(22.35±2.02)g与对照组(21.68±2.14)g之间无显著性差异(t=0.011,P>0.05),用药组肿瘤的体积(195.32±27.57)mm3较对照组(343.67±23.08)mm3明显减小,两者之间有显著性差异(t=10.11,P﹤0.01)。在鼻咽癌移植瘤中,对照组DAPK均不表达,而用药组出现表达。结论:5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞及其裸鼠移植瘤的抑制作用可能是因为其使因甲基化而失活的抑癌基因DAPK再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的生长和增殖。     

血管内皮生长因子介导的卵巢恶性肿瘤浸润生长的实验研究

 目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)在卵巢癌细胞肿瘤血管形成及浸润中的作用。方法脂质体介导VEGFcDNA转染卵巢癌细胞OVCAR3,并经Northernblot和Westernblot法检测转染VEGFcDNA前后卵巢癌细胞中的VEGFmRNA和蛋白表达水平。将VEGF表达阳性的细胞接种于裸鼠皮下观察负荷瘤生长速度、重量并采用免疫组化的方法检测其微血管密度(MVD)。结果(1)VEGFcDNA转染后的卵巢癌细胞系VEGFmRNA和蛋白表达水平明显高于转染前(P<0.05)。(2)体外实验显示转染与非转染细胞系生长曲线基本相同。(3)VEGFcDNA转染后的卵巢癌细胞系接种裸鼠后其负荷瘤生长速度和重量均明显高于未转染的裸鼠负荷瘤(P<0.05)。(4)VEGF表达阳性的裸鼠负荷瘤其MVD也明显高于VEGF表达阴性的裸鼠负荷瘤(P<0.05)。结论VEGF通过促进肿瘤新生血管的增多进而在卵巢癌浸润生长中发挥作用。     

Gene therapy for ovarian cancer using adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene and uracil phosphoribosyltransferase gene directed by MDR1 promoter

OBJECTIVE: To evaluate the specific killing effects of the adenoviral vector in which the CD::UPP genes were directed by the MDR1 promoter on Taxol-resistance ovarian cancer cells in vitro and in vivo. METHODS: Taxol-resistance (A2780/Taxol, SKOV3/Taxol) ovarian cancer cells and Taxol-sensitive (A2780, SKOV3) ovarian cancer cells were infected with adenovirus vector carrying the CD::UPP gene driven by the MDR1 promoter, followed with 5-fluorocytosine administration. Sensitivity to 5-fluorocytosine (5-FC) was analyzed. The AdMDR1-CD::UPP was subcutaneously injected into the xenografts of the nude mice and 5-FC intraperitoneally. The overall survival and anti-tumor effects were observed. RESULTS: In vitro, AdMDR1-CD::UPP showed a stronger cytotoxicity in A2780/Taxol cells and SKOV3/Taxol cells than that in A2780 cells and SKOV3 cells. Subcutaneous injection of AdMDR1-CD::UPP into the xenografts of mice bearing tumors of A2780/Taxol cells could significantly suppress the tumor growth and prolong survival as compared with the group of A2780 cells. CONCLUSION: AdMDR1-CD::UPP in combination with 5-FC is an effective approach to suppress the growth of Taxol-resistant ovarian cancer.     

TGFBI promoter hypermethylation correlating with paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer

The purpose of this study is to determine the methylation status of Transforming growth factor-beta-inducible gene-h3 (TGFBI) and its correlation with paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer. The methylation status of TGFBI was examined in ovarian cancer and control groups by methylation-specific PCR (MSP) and bisulfite sequencing PCR (BSP). The TGFBI expression and cell viability were compared by Quantitative Real-Time PCR, Western Blotting and MTT assay before and after demethylating agent 5-aza-2''-deoxycytidine (5-aza-dc) treatment in 6 cell lines (SKOV3, SKOV3/TR, SKOV3/DDP, A2780, 2780/TR, OVCAR8). In our results, TGFBI methylation was detected in 29/40 (72.5%) of ovarian cancer and 1/10 (10%) of benign ovarian tumors. No methylation was detected in normal ovarian tissues (P < 0.001). No statistical correlation between RUNX3 methylation and clinicopathological characteristics was observed. A significant correlation between TGFBI methylation and loss of TGFBI mRNA expression was found (P < 0.001). The methylation level of TGFBI was significantly higher in paclitaxel resistant cell lines (SKOV3/TR and 2780/TR) than that in the sensitive pairs (P < 0.001). After 5-aza-dc treatment, the relative expression of TGFBI mRNA and protein increased significantly in SKOV3/TR and A2780/TR cells. However, no statistical differences of relative TGFBI mRNA expression and protein were found in other cells (all P > 0.05), which showed that re-expression of TGFBI could reverse paclitaxel chemoresistance. Our results show that TGFBI is frequently methylated and associated with paclitaxel-resistance in ovarian cancer. TGFBI might be a potential therapeutic target for the enhancement of responses to chemotherapy in ovarian cancer patients.     

MicroRNA-150对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移能力的影响

目的 研究microRNA-150(miR-150)在人上皮性卵巢癌细胞中的表达情况,及其对人上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移能力的影响。方法 通过荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测各处理组细胞中的miR-150表达水平;利用MTT法、流式细胞技术、Transwell法探究miR-150的表达对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移能力的影响。结果 与正常卵巢上皮细胞(T29)相比,上皮性卵巢癌细胞(A2780和OVCAR3)中miR-150表达显著降低(P＜0.01);转染miR-150mimic后,A2780和OVCAR3细胞中miR-150水平明显升高(P＜0.01);MTT试验显示,转染培养三天后,miR-150 mimic组细胞OD值(A2780:1.12±0.03;OVCAR3:1.91±0.03)较Blank组(A2780:2.35±0.09;OVCAR3:2.63±0.07)及miR-150 NC组(A2780:2.18±0.07;OVCAR3:2.43±0.11)明显降低(P＜0.01);细胞凋亡检测显示:miR-150 mimic组凋亡率(A2780:16.10±0.58%;OVCAR3:15.16±1.30%)较Blank组(A2780:10.07±0.66%;OVCAR3:3.81±0.24%)及miR-150 NC组(A2780:10.36±1.08%;OVCAR3:4.89±0.07%)明显升高(P＜0.01);Transwell试验显示:miR-150 mimic组穿膜细胞数(A2780:38.67±2.03;OVCAR3:28.67±2.03)较Blank组(A2780:76.30±7.45;OVCAR3:55.67±3.18)及miR-150 NC组(A2780:74.33±5.78;OVCAR3:56.33±3.84)明显减少(P＜0.01)。结论 miR-150在上皮性卵巢癌细胞中表达降低,可能是上皮性卵巢癌增殖、侵袭转移的机制之一;上调miR-150的表达可以抑制上皮性卵巢癌细胞增殖、促进细胞凋亡,并且降低上皮性卵巢癌细胞侵袭转移能力。