重组反义c-myc腺病毒抑制K562细胞生长、诱导凋亡的作用

目的：研究重组反义cmyc腺病毒（Ad—AS-c-myc）对人慢性粒细胞K562细胞系抑制生长，诱导凋亡作用及分子机制，探讨Ad-As-c—myc用于慢性粒细胞白血病基因治疗的可能性。方法：采用重组腺病毒Lac—Z（Ad—LacZ）及Ad—AS-c—myc联合多聚季胺转染K562细胞，Xgal染色判断转染效率。采用形态学、MTT试验、RT—PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞仪及免疫细胞化学等方法进行研究。结果：多聚阳离子可提高腺病毒载体对K562细胞的转染，Ad—LacZ＋多聚季胺转染率达86％。AdAS—c—myc能抑制K562细胞c—myc基因在转录水平的表达，K562细胞生长受抑（抑制率38％）；Ad—AS-c—myc可使K562细胞G2、G2期阻滞，增殖相关基因PCNA表达降低，Apo2．7蛋白阳性细胞率增高，DNA电泳出现DNA梯形条带。结论：Ad—AS-c-myc对K562细胞具有抑制生长及诱导凋亡作用，其生物学作用与K562细胞c-myc及PCNA的表达降低有关。Ad-AS-c-myc在慢性粒细胞白血病基因治疗中具有潜在的临床价值。     

2-甲氧基雌二醇对白血病细胞K562增生、凋亡及细胞周期的影响

 目的 探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对体外培养的慢性粒细胞白血病（CML）急变期细胞系bcr-abl（+）K562细胞增生、凋亡及细胞周期的影响。方法 将不同浓度和作用时间的2-ME与K562细胞共同培养，采用相差显微镜观察细胞的形态学变化；四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测2-ME对K562细胞增生的抑制作用；流式细胞术分析2-ME对K562细胞凋亡及细胞周期的影响。结果 1~ 16μmol／L浓度的2-ME在24、36、48及60 h均可明显抑制K562细胞增生，并在一定范围内呈时间和剂量依赖性；2-ME作用后G0／G1期细胞增加，并伴随细胞凋亡峰和凋亡率的升高。结论 2-ME可抑制K562细胞增生，诱导其凋亡，为2-ME的临床应用提供实验依据。     

2-甲氧基雌二醇对白血病K562细胞凋亡相关基因表达的影响及其机制

 目的　探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对白血病K562细胞凋亡的影响及其作用机制。方法　实验分为3组,对照组：培养基中不含2-ME;实验组：分别用1、2、4、8、16μmol／L的2-ME处理K562细胞36 h后观察各项指标的变化;阴性对照组：培养液中以无RNase蒸馏水代替K562细胞。应用原位细胞凋亡法（TUNEL）、流式细胞术（FCM）、半定量RT-PCR及黄嘌呤氧化酶法分别检测K562细胞凋亡率、Caspase-3、性连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）及其基因表达、超氧化物歧化酶（SOD）与活性氧（ROS）水平。结果　不同浓度的2-ME与K562细胞作用36 h后,2-ME在一定的浓度范围内以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡;2-ME通过上调促凋亡因子Caspase-3和（或）下调抗凋亡因子XIAP的表达,降低SOD及增加ROS水平等途径促进K562细胞凋亡,这可能是2-ME诱导K562细胞凋亡的机制之一。结论　2-ME能够以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡,显示了其在慢性粒细胞白血病（CML）治疗中的潜在价值。     

cDNA芯片检测STAT5诱骗核苷酸对K562细胞凋亡相关基因的影响

目的：转录因子STAT5在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)中组成性激活,并与CML细胞恶性表型密切相关,本研究用cDNA芯片检测方法探讨诱骗核苷酸(decoy ODNs)抑制STAT5对白血病K562细胞株凋亡相关基因的影响。方法：分别提取decoy ODNs处理前后的K562细胞总RNA,逆转录合成Cy3、Cy5标记的cDNA探针,与人14K基因表达谱cDNA芯片(V2.0)杂交,扫描获得数据后,用Genespring软件分析对照组和实验组的差异表达基因,半定量RT- PCR验证cDNA芯片结果。结果：2张cDNA芯片检测重复性良好(R=0.9799)。在13824个标记的基因中,检出413个上调基因,其中包括：TIAF1、GAB1、GYPA、DAPK3、TNFRSF1B、IRF1和PML等在内的18个凋亡相关基因；在检出的332个下调基因中,发现PIM1、CCND2、CCND1、MYC和BCL2L1等在内的11个凋亡相关基因；部分基因经半定量RT-PCR证实与cDNA芯片结果一致。结论：Decoy ODNs抑制STAT5信号通路后可引起K562细胞多种凋亡相关基因的变化,本实验为进一步研究STAT5信号通路所调控的凋亡相关基因提供了依据。     

水通道蛋白1基因过表达对K562细胞红系分化和增殖的影响

目的:探讨水通道蛋白1(aquaporin-1,AQP1)过表达对人慢性髓细胞白血病(chronic myeloidleukemia,CML) K562细胞红系分化和增殖的影响.方法:以人脑cDNA文库为模板,通过PCR扩增出AQP1基因的编码序列,构建pBABE-puro-AQP1真核表达载体;感染K562细胞,筛选建立稳定过表达AQP1基因的K562细胞株(命名为K562-AQP1);实时荧光定量PCR法、细胞免疫荧光染色法及蛋白质印迹法分别检测AQP1转录和蛋白表达水平.通过MTT法检测细胞生长增殖、实时荧光定量PCR法检测γ珠蛋白表达和分光光度法检测血红蛋白含量,研究AQP1过表达对K562细胞红系分化和增殖的影响.结果:与空载体对照组相比,pBABE-puro-AQP1转染入K562细胞后AQP1 mRNA和蛋白表达水平皆有显著升高(P＜0.01),K562-AQP1细胞中红系分化指标γ珠蛋白和血红蛋白表达水平明显增加,同时细胞生长速度明显降低(P＜0.05).结论:AQP1过表达可以显著促进K562细胞向红系分化,同时抑制细胞增殖.推测AQP1可能成为临床诱导分化治疗CML的基因靶点之一.     

RNA干扰和伊马替尼杀伤K562细胞效果的比较

目的比较RNA干扰（RNAi）和伊马替尼（imatinib）杀伤K562细胞的效果。方法设计有效的bcr—abl干扰shRNA序列，利用基因工程技术插入到干扰载体构建RNAi质粒。测序鉴定正确的RNAi质粒转染K562细胞，48h后荧光显微镜观察转染效率。RT—PCR技术检测K562细胞中bcr—abl表达水平。同时，伊马替尼作用K562细胞。利用凋亡分析、MTT增生实验和磷酸化的酪氨酸蛋白含量检测来评估RNAi和伊马替尼作用效果。结果与伊马替尼一样，RNAi使K562细胞凋亡增强，增生减少，磷酸化的酪氨酸蛋白含量减少。结论RNAi达到伊马替尼杀伤K562细胞的效果，有望在临床用于治疗慢性髓细胞白血病（CML）患者，尤其是那些对伊马替尼等化疗药物不敏感的CML患者。     

PTEN对K562细胞mTOR调控的研究

目的:探讨肿瘤抑制基因PTEN在人慢性粒细胞白血病细胞株K562中对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ,mTOR)的调控作用,以及雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对K562细胞增殖抑制的影响.方法:通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantification PCR,RFQ-PCR)法检测甲磺酸伊马替尼(imatinib mexylate)干预K562细胞后BCR/ABL、PTEN、mTOR mRNA的表达水平及相互关系;Western 印迹法检测甲磺酸伊马替尼干预和以腺病毒为载体感染野生型PTEN(Ad-PTEN-GFP )后K562细胞PTEN、Akt和p-Akt的蛋白表达水平;用MTT和FCM方法检测RAPA对不同腺病毒感染组K562细胞增殖及凋亡的影响.结果:格列卫干预K562细胞后,BCR/ABL和mTOR mRNA表达下调,PTEN mRNA表达上调;与感染Ad-GFP组相比,感染Ad-PTEN-GFP组的mTOR mRNA表达下调;Ad-PTEN-GFP感染与10 nmol/L RAPA联合作用于K562细胞能够发挥协同作用,对K562细胞的增殖抑制率明显高于单独作用组.结论:PTEN是mTOR的上游调控基因,能够抑制mTOR的表达.RAPA与野生型PTEN一起可以协同抑制K562细胞的增殖.     

肝脂素（YS2H）对K562细胞超微结构的影响

目的观察肝脂素（ＹＳ２Ｈ）对Ｋ５６２白血病细胞超微结构的影响。方法应用光镜及电镜观察经不同浓度肝脂素作用一定时间后的Ｋ５６２细胞形态及超微结构的变化。结果光镜下,肝脂素可使Ｋ５６２细胞出现细胞大小不均,形态不规则,细胞核染色质略浓密,核仁模糊,胞浆出现空泡,部分胞浆有灰蓝色或灰红色区域等变化;电镜下,细胞内出现空泡、脂滴、粗面内质网扩张、脱颗粒、线粒体肿胀、嵴减少等变化。结论肝脂素具有抗白血病细胞     

Apollon siRNA对慢性髓系白血病K562细胞株阿糖胞苷敏感性影响研究

目的：研究小干扰RNA（RNAi）技术沉默凋亡抑制蛋白Apollon基因联合小剂量阿糖胞苷（Ara-C）对K562细胞化疗敏感性的影响。方法：构建pGPHI-GFP-Neo-Apollon真核表达载体,经阳离子脂质体转染K562细胞,实验分为RNAi组、阴性质粒组、细胞对照组、Ara-C组和RNAi＋Ara-C组5组,采用RT-PCR和细胞免疫荧光检测干扰效果。RNAi与小剂量Ara-C单独和联合应用后,采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：RT-PCR结果显示,实验组Apollon mRNA的相对表达量为（27.622±0.057）%,与细胞对照组（89.770±0.028）%和阴性对照组（84.868±0.057）%相比明显降低,差异有统计学意义,F=57.573,P=0.012。细胞免疫荧光检测结果显示,实验组细胞Apollon蛋白的荧光强度为（15.96±1.71）%,明显低于细胞对照组（35.36±2.90）%和阴性对照组（34.97±2.65）%,差异有统计学意义,F=71.063,P=0.013。重组载体和（或）10μg/mL Ara-C作用于K562细胞24、48和72h后,RNAi组和RNAi＋Ara-C组K562细胞增殖抑制率（IR%）明显增高,随着作用时间的延长,抑制效果越明显。流式细胞术结果显示,RNAi＋Ara-C组细胞凋亡率为（30.816±1.06）%,明显高于细胞对照组（4.803±0.112）%、阴性对照组（4.566±0.205）%和Ara-C组（11.61±0.604）%及RNAi组（20.226±0.986）%,差异有统计学意义,F=138.57,P〈0.001。结论：靶向Apollon RNAi联合小剂量Ara-C能有效抑制K562细胞增殖并促进其凋亡,显著减少Ara-C使用剂量,明显提高了K562细胞对Ara-C的敏感性。     

Grb2-SH3抑制剂peptidimer-c对K562细胞凋亡相关基因表达的影响

 目的　分析peptidimer-c对K562细胞基因表达谱的影响,初步探讨peptidimer-c诱导K562细胞凋亡和抑制生长的可能机制。方法　应用锥虫蓝染色法计数经不同浓度peptidimer-c分别作用不同时间后的K562活细胞数;通过透射电子显微镜观察peptidimer-c作用前后K562细胞的超微结构;应用Human U133 Plus 3.0基因表达谱芯片检测peptidimer-c作用前后K562细胞的差异表达基因;并用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）验证芯片结果。结果　peptidimer-c能诱导K562细胞凋亡和抑制生长,peptidimer-c作用于K562细胞后引起大量基因表达的变化,差异表达基因有529个,其中上调455个,下调74个,影响细胞凋亡的基因包括JUN、AXUD1、TNFRSF10B等表达明显上调;RT-PCR验证选取的15个基因的表达差异与芯片结果一致。结论　peptidimer-c可通过上调肿瘤坏死因子及其受体家族成员和JUN家族,启动K562细胞凋亡。     

PKF118-310对白血病K562细胞凋亡的影响及其机制

目的：探讨小分子化合物PKF118-310对人慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞凋亡的影响及其机制。方法用不同浓度PKF118-310处理K562细胞,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测其对细胞增殖的抑制;免疫荧光法观察细胞核β-catenin／TCF转录复合物的形成;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测caspase-3、caspase-8、XIAP、bcl-2、β-catenin、TCF、C-myc及cyclin D1的表达。结果PKF118-310能够抑制K562细胞生长,其对K562细胞在24、48、72 h的半数抑制浓度（IC50）值分别为5.388、3.290、1.566μmol ／L。细胞核内形成β-catenin／TCF转录复合物。分别用1.6、3.2μmol／L的PKF118-310作用于K562细胞48 h后,经Annexin V-FITC／碘化丙啶（PI）双标检测细胞凋亡率分别为（48.0±0.9）%、（80.2±1.2）%,均高于对照组的（1.2±0.6）%（均P＜0.05）。不同浓度PKF118-310处理K562细胞72 h后,caspase-3及caspase-8蛋白表达均高于对照组（均P＜0.05）,而XIAP、bcl-2、β-catenin、TCF、c-myc及cyclin D1蛋白表达均低于对照组（均P＜0.05）。结论PKF118-310可抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡。     

A23187诱导K562细胞分化为树突细胞的实验研究

目的 体外探讨A23187快速将人慢性白血病K562细胞定向诱导分化为树突细胞(DC)的实验方法.方法 K562细胞在含有A23187或细胞因子的条件下诱导分化为DC,倒置显微镜下观察细胞形态的变化,流式细胞术检测DC表面标志的改变,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各表面标志mRNA水平的变化,四甲基偶氮唑蓝(...     

HnRNP E2诱骗RNA对白血病K562细胞增殖的影响及其可能机制

背景与目的:BCR/ABL诱导多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly(rC)-bindingproteinE2,hnRNPE2]的异常表达在慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)急变中起着重要作用。本研究探讨hnRNPE2诱骗RNA(decoyRNA)对人白血病细胞K562增殖的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:构建能转录出hnRNPE2诱骗RNA的质粒载体,将其经阳离子脂质体介导转染K562细胞,用G418筛选出稳定表达的细胞,台盼蓝法检测细胞的增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期,并用RT-PCR和Westernblot方法检测下游CCAAT增强子结合蛋白!(CCAAT/enhancer-bindingprotein!,C/EBPα)和c-myc的表达。结果:稳定表达诱骗RNA的K562细胞增殖受抑,增殖抑制率为(62.73±12.92)%;细胞周期阻滞于S期[稳定表达诱骗RNA细胞组(55.59±4.67)%,对照组(44.70±4.21)%,P<0.05];C/EBPαmRNA无改变,但在蛋白水平42ku-C/EBPα表达升高了(49.72±5.58)%;c-mycmRNA下降了(58.27±7.23)%,蛋白水平降低了(57.26±6.52)%。结论:hnRNPE2诱骗RNA能抑制K562细胞的增殖,其机制可能与诱骗RNA阻断hnRNPE2和C/EBPαmRNA的结合后,引起42ku-C/EBPα表达升高有关。     

整合素α5β1在IFNα-2b抑制白血病细胞系K562细胞增殖中的作用

背景与目的:慢性粒细胞白血病ph 细胞大量增殖与整合素β1介导的增殖抑制功能存在障碍密切相关。本研究通过观察整合素α5β1在干扰素(IFNα-2b)抑制慢性粒细胞白血病细胞K562增殖中的作用,探讨整合素β1在CML发病机制中的作用。方法:流式细胞仪检测K562细胞表面整合素α5β1的表达并检测纤维粘连蛋白(FN)与K562细胞的结合以及整合素α5β1单抗阻断两者结合的程度;MTT法测定整合素α5β1对IFNα-2b抑制K562细胞增殖的影响;RT-PCR法检测IFNα-2b作用后K562细胞中粘着斑激酶(FAK)表达量的改变。结果:整合素α5和β1在K562细胞表面高表达,分别为(97.59±1.04)%、(99.24±0.52)%,而健康人骨髓单核细胞为(64.05±2.38)%、(72.40±3.56)%;IFNα-2b不能改变其表达量,但可增强K562细胞整合素与FN的结合能力;K562细胞与FN的结合可被整合素α5和β1单抗阻断。与未处理组相比,IFNα-2b处理组的K562细胞发生增殖抑制(P<0.05),细胞内FAK基因表达水平增加2.21倍(P<0.05)。整合素α5和β1单抗可增强IFNα-2b引起的增殖抑制作用,并阻断IFNα-2b引起的FAK基因表达水平的增加。结论:IFNα-2b通过恢复整合素α5β1功能,增强FN与K562细胞表面整合素α5β1结合的能力而抑制K562细胞增殖并提高细胞内FAK表达量。