胶质瘤SLC22A18耐药细胞株的建立及其耐药机制的研究

目的:以人胶质瘤U251细胞株为载体,探讨胶质瘤获得性SLC22A18 基因耐药的可能机制。方法:用重组腺病毒介导的SLC22A18基因(Ad/SLC22A18)反复处理人胶质瘤U251细胞,得到人胶质瘤耐药细胞株U251-SLC22A18/R。通过MTT和Western blot法检测耐药细胞U251-SLC22A18/R对Ad/SLC22A18杀伤作用的敏感性及凋亡相关的信号分子DR4、DR5、Bax、Bcl-XL和caspase-8的表达情况,分析其获得性耐药的可能机制。结果:耐药细胞U251-SLC22A18/R对Ad/SLC22A18和SLC22A18蛋白处理耐药,但对Bax基因处理仍然敏感。U251-SLC22A18/R细胞内Bcl-XL 的表达显著升高,caspase-8的表达明显下降,caspase-8 活性未见明显的裂解。结论:人胶质瘤U251细胞株经Ad/SLC22A18反复处理后产生针对SLC22A18基因的耐药,其机制可能与Bcl-XL 表达升高和caspase-8 表达下降有关。     

不同化疗药物对胶质瘤获得性SLC22A18基因耐药的逆转作用

目的:探讨临床上治疗胶质瘤的不同化疗药物对胶质瘤U251细胞获得性SLC22A18耐药的逆转作用及可能的分子机制。方法:将重组腺病毒载体(Ad)介导的SLC22A18基因联合替莫唑胺(TMZ)、卡氮芥(BCNU)以及顺铂(DDP)3种常见化疗药物处理对Ad/SLC22A18产生耐药的U251-SLC22A18/R胶质瘤细胞,通过MTT比色法检测处理后胶质瘤细胞的存活率,以评估体外不同化疗药物对SLC22A18耐药的逆转作用;在体内进一步评估该逆转策略的有效性;并且通过免疫印迹等方法探讨逆转耐药的可能的分子机制。结果:在体外只有TMZ和BCNU能够使U251-SLC22A18/R细胞对Ad/SLC22A18重新敏感。进一步的研究结果表明联合TMZ和Ad/SLC22A18能在体内有效地抑制U251-SLC22A18/R细胞来源的胶质瘤生长,且联合TMZ和Ad/SLC22A18抑制作用明显比其它对照组强。Ad/SLC22A18和TMZ的联合治疗可以下调MGMT蛋白的表达,并且Ad/SLC22A18和BCNU的联合治疗可以上调Bax蛋白的表达。结论:联合应用Ad/SLC22A18和TMZ或BCNU能在体内外有效地逆转U251-SLC22A18/R细胞对SLC22A18的获得性耐药,TMZ的逆转作用可能与其诱导的MGMT蛋白低表达有关,BCNU的逆转作用可能与其诱导的Bax蛋白过度表达有关。     

SLC22A18基因转染人胶质瘤U251细胞对放疗敏感性的影响

目的：探讨SLC22A18基因转染人胶质瘤U251细胞对放疗敏感性的影响。方法：用脂质体介导的转染技术将pIRES2-EGFP-SLC22A18表达重组质粒导入U251细胞,通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）检测SLC22A18基因和蛋白的表达。U251细胞分为4组：对照组、转染组、放疗组和转染联合放疗组。集落形成实验检测各组U251细胞集落形成数,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）和流式细胞仪检测各组U251细胞生长抑制率和凋亡率,进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导的pIRES2-SLC22A18表达重组质粒转染U251细胞对放疗敏感性的影响。结果：重组质粒转染组通过RT-PCR和Western blot证实了SLC22A18基因和蛋白在U251细胞中表达。集落形成实验检测发现SLC22A18基因对U251细胞的集落形成数为（60.6±5.2）个,当放射剂量为3、6和9 Gy时,U251细胞的集落形成数分别为（30.0±3.6）、（13.0±3.0）和（4.0±1.0）个。MTT检测发现SLC22A18基因对U251细胞的生长抑制率为（80.12±5.75）%。当放射剂量为3、6和9 Gy时,U251细胞的生长抑制率分别为（17.05±4.24）%、（17.34±1.62）%和（18.71±4.59）%。当SLC22A18基因与放疗（3、6和9 Gy）联合作用时,抑制率分别为（81.45±5.32）%、（90.45±1.65）%和（92.62±2.12）%。SLC22A18基因转染所产生的U251细胞凋亡率为17.68%。放疗（3、6和9 Gy）引起的细胞凋亡率分别为4.64%、4.87%和5.42%。当SLC22A18基因与放疗（3、6和9 Gy）联合作用时,凋亡率分别为18.42%、21.48%和23.92%。体内实验结果显示,SLC22A18基因对U251细胞6 Gy照射的抑瘤率比较为1.81。结论：SLC22A18基因转染增加了人胶质瘤U251细胞对放疗的敏感性。     

沉默长链非编码RNA HULC增加脑胶质瘤对替莫唑胺的敏感性

目的:研究HULC在脑胶质瘤中的表达,探讨HULC对脑胶质瘤对替莫唑胺敏感性的影响.方法:Real-time PCR检测HULC基因在脑胶质瘤组织中的表达.构建HULC基因表达沉默载体sh-HULC并转染U251细胞,Real-time PCR检测转染效果.MTT法检测HULC基因表达沉默对于U251细胞的增殖能力及对替莫唑胺敏感性的影响.结果:HULC基因在脑胶质瘤表达显著上调,HULC的高表达与脑胶质瘤的低分化及高分期相关.HULC基因的表达沉默载体能够显著沉默HULC基因的表达.HULC表达沉默的U251细胞的增殖活力下调明显,对替莫唑胺的敏感性明显增加.结论:长链非编码RNA HULC在脑胶质瘤中高表达,沉默其表达能够抑制脑胶质瘤细胞的增殖活力并提高脑胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性.     

沉默Bcl-XL逆转人胶质瘤获得性SLC22A18的耐药

目的:探讨RNA干扰Bcl-XL(siRNA）在人胶质瘤获得性SLC22A18的耐药中的作用。方法:以Bcl-XL siRNA转染获得性SLC22A18耐药的人胶质瘤U251-SLC22A18/R细胞,用重组人SLC22A18蛋白处理,MTT法和流式细胞仪检测肿瘤细胞的存活率,免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-8的表达情况。结果:Bcl-XL siRNA能够降低U251-SLC22A18/R细胞中Bcl-XL的表达,也能逆转其对SLC22A18的耐药。U251-SLC22A18/R细胞经过Bcl-XL siRNA和重组人SLC22A18蛋白共同处理4 h后细胞凋亡率>50%,细胞存活率<30%;而对照组和重组人SLC22A18蛋白处理组的细胞凋亡率和存活率无明显变化。经Bcl-XL siRNA与重组人SLC22A18蛋白联合处理后,U251-SLC22A18/R细胞中Caspase-3和Caspase-8均明显活化。结论:Bcl-XL siRNA能有效逆转人胶质瘤获得性SLC22A18的耐药,为治疗胶质瘤耐药提供一种新的思路。     

替莫唑胺通过调控miR-216a/PRKCA抑制胶质瘤细胞U251增殖和侵袭作用的研究

目的:探讨替莫唑胺抑制胶质瘤细胞U251增殖和侵袭的作用,推测其作用机制是通过微小RNA-216a（microRNA-216a,miR-216a）/蛋白激酶Cα(protein kinase C-alpha,PRKCA)进行调控。方法:体外培养胶质瘤细胞U251,用不同剂量替莫唑胺染毒48 h后,构建野生型PRKCA 3' UTR-荧光素酶报告载体及检测荧光素酶活性,检测替莫唑胺对胶质瘤细胞U251增殖和侵袭的影响及miR-216a和PRKCA表达的影响。结果:miR-216a mimics使野生型PRKCA 3' UTR-荧光素酶报告载体的活性下降了47.52%,差异具有统计学意义（P＜0.05）;miR-216a mimics使突变型PRKCA 3' UTR-荧光素酶报告载体的活性下降不显著,差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白对照组比较,低、中、高剂量组胶质瘤细胞U251增殖率、侵袭细胞数、PRKCA mRNA相对表达量和PRKCA蛋白表达量均降低,miR-216a mRNA相对表达量均增高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;随着替莫唑胺剂量的增加,胶质瘤细胞U251增殖率、侵袭细胞数、PRKCA mRNA相对表达量和PRKCA蛋白表达量随之降低,miR-216a mRNA相对表达量随之增高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:替莫唑胺可以通过促进miR-216a的表达而抑制PRKCA的表达,降低胶质瘤细胞U251增殖和侵袭。     

TopoⅡ与胶质瘤替莫唑胺化疗耐药性的关系

背景与目的:TopoⅡ与替莫唑胺(temozolomide,TMZ)治疗胶质瘤后产生化疗耐药的关系依然未清楚,本文探讨拓扑异构酶Ⅱ(topoⅡ)与胶质瘤细胞替莫唑胺化疗耐药性的关系。方法:替莫唑胺诱导构建耐药细胞株U251/TR,CCK-8法检测该细胞株的耐药性,RT-PCR法检测topoⅡ在U251和U251/TR中的表达变化。采用siRNA技术沉默耐药细胞株中topoⅡ的表达后,检测其对化疗药物敏感性变化。结果:成功构建TMZ耐药细胞株U251/TR,该细胞系对替莫唑胺有耐药性,其topoⅡ的表达明显升高,沉默topoⅡ的表达后,耐药性成功逆转。结论:TopoⅡ与替莫唑胺化疗耐药性有关。     

和厚朴酚对组织因子途径抑制物 2诱导神经胶质瘤细胞凋亡的实验研究#br#

目的探讨和厚朴酚对组织因子途径抑制物 2（TFPI 2）表达的影响,以及和厚朴酚和TFPI 2过表达对人胶质瘤U251细胞凋亡的影响。 方法体外培养胶质瘤U87、U251、LN18、LN229、A172细胞系,荧光定量PCR（QPCR）检测不同细胞系中TFPI 2的表达。不同浓度（0、10、20、30、40和50 μmol／L）和厚朴酚干预U251细胞,QPCR和Western blotting检测TFPI 2 mRNA和蛋白的表达。采用腺病毒载体pGSadeno TFPI 2过表达U251细胞内TFPI 2的表达,流式细胞术及caspase 3试剂盒检测细胞凋亡率和caspase 3活性。 结果在选取的5种不同胶质瘤细胞株中,U251和A172细胞内TFPI 2 mRNA明显下降（P＜005）。和厚朴酚呈浓度依赖性增加U251细胞内TFPI 2 mRNA水平;其中50 μmol／L和厚朴酚干预24 h后, TFPI 2 mRNA表达水平升高最明显（P＜005）。腺病毒感染U251细胞后TFPI 2表达水平明显增加（P＜005）。过表达TFPI 2和50 μmol／L和厚朴酚干预均可增加U251细胞凋亡水平和caspase 3的活性（P＜005）。 结论和厚朴酚处理可增加U251细胞内TFPI 2的表达;和厚朴酚联合TFPI 2过表达显著诱导胶质瘤细胞凋亡。     

和厚朴酚对组织因子途径抑制物 2诱导神经胶质瘤细胞凋亡的实验研究#br#

目的探讨和厚朴酚对组织因子途径抑制物 2（TFPI 2）表达的影响,以及和厚朴酚和TFPI 2过表达对人胶质瘤U251细胞凋亡的影响。 方法体外培养胶质瘤U87、U251、LN18、LN229、A172细胞系,荧光定量PCR（QPCR）检测不同细胞系中TFPI 2的表达。不同浓度（0、10、20、30、40和50 μmol／L）和厚朴酚干预U251细胞,QPCR和Western blotting检测TFPI 2 mRNA和蛋白的表达。采用腺病毒载体pGSadeno TFPI 2过表达U251细胞内TFPI 2的表达,流式细胞术及caspase 3试剂盒检测细胞凋亡率和caspase 3活性。 结果在选取的5种不同胶质瘤细胞株中,U251和A172细胞内TFPI 2 mRNA明显下降（P＜005）。和厚朴酚呈浓度依赖性增加U251细胞内TFPI 2 mRNA水平;其中50 μmol／L和厚朴酚干预24 h后, TFPI 2 mRNA表达水平升高最明显（P＜005）。腺病毒感染U251细胞后TFPI 2表达水平明显增加（P＜005）。过表达TFPI 2和50 μmol／L和厚朴酚干预均可增加U251细胞凋亡水平和caspase 3的活性（P＜005）。 结论和厚朴酚处理可增加U251细胞内TFPI 2的表达;和厚朴酚联合TFPI 2过表达显著诱导胶质瘤细胞凋亡。     

EZH2基因沉默对人脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡影响的研究

目的:研究RNA干扰技术抑制zeste基因增强子人类同源物2(EZH2)的表达对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响.方法:构建靶向EZH2基因的shRNA质粒并转染至U251细胞中,采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测EZH2 mRNA和蛋白的表达情况,利用四甲基偶氮哇盐(MTT)实验和Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验观察转染后U251细胞增殖和凋亡情况.结果:靶向EZH2基因的shRNA质粒成功抑制了U251细胞EZH2基因的表达,mRNA和蛋白表达抑制率分别为56.00％和88.73％;转染shRNA EZH2后,U251细胞的生长受到明显抑制(P＜0.01),在转染96 h后,生长抑制率达35.79％;转染48 h后,U251细胞早、晚期凋亡率分别为(26.59±0.83)％和(38.63±0.80)％,较阴性质粒组和空白对照组均增加,以晚期明显,差异有统计学意义,P＜0.01.结论:EZH2基因的沉默能有效抑制胶质瘤U251细胞的增殖、促进其凋亡,提示EZH2可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点.     

Elevated expression of solute carrier family 22 member 18 increases the sensitivity of U251 glioma cells to BCNU

Previous studies showed that solute carrier family 22 member 18 (SLC22A18) is involved in tumorigenesis. The aim of this study was to examine the role of SLC22A18 in glioma cells. Glioma U251 cells were transfected with the human SLC22A18 gene. Transfection of the empty vector pcDNA3.1 was used as a negative control. Sensitivity to BCNU was measured by Annexin V staining. The expression of caspase-3 and bcl-2 was determined by immunohistochemistry. The transfection was confirmed by PCR, RT-PCR and Western blotting. Augmented apoptotic cell death was observed in the SLC22A18-transfected cells, compared to the non-transfected cells or cells with the empty vector. Caspase-3 expression increased in U251-SLC22A18 cells, whereas the bcl-2 expression decreased. These results indicated that SLC22A18 has a pro-apoptotic function in glioma cells.     

U251源性脑肿瘤干细胞的耐药性及耐药酶的表达

背景与目的：从胶质瘤中分离的肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）是胶质瘤的种子细胞和复发的源泉,它们不能被有效的杀死导致胶质瘤的预后不理想。本研究旨在探讨胶质瘤来源的肿瘤干细胞对化疗药物的耐药性及相关耐药酶的表达。方法：用免疫磁珠法从U251细胞中分选肿瘤干细胞（U251-CSC）后继续培养;MTT比色试验法观察化疗药物替尼泊苷（Vm-26）、卡莫司汀（BCNU）和顺铂（DDP）对U251和U251-CSC的增殖抑制作用,流式细胞仪检测3种化疗药物引起的细胞凋亡;Western blot免疫印迹法检测3种耐药酶LRP、MGMT和TopoⅡα的表达。结果：在3种药物作用下,U251的生长抑制比U251-CSC明显,U251的细胞凋亡率高于U251-CSC;U251-CSC表达LRP、MGMT和TopoⅡα的强度高于U251。结论：胶质瘤肿瘤干细胞对化疗药物Vm-26、BCNU和DDP有高耐药性,原因可能是肿瘤干细胞高表达耐药酶LRP、MGMT和TopoⅡα。     

干扰素和环孢霉素A 协同逆转K562/ ADM细胞对阿霉素的耐药性

  目的 观察干扰素(α-Interleron，α-IFN)和环孢霉素A(Cyclosporine A,CsA)对白血病K562/ADM细胞耐药性的协同逆转效应。方法 以多药耐药基因／P-糖蛋白(Muhidrug resistance gene／P-glycoprotein，mdrl／P-gp)超表达的K562／ADM细胞为靶细胞，MTT比色法检测药物的细胞毒效应；流式细胞仪检测细胞P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表达水平；激光共聚焦显微镜观察细胞内阿霉素含量变化。结果 K562／ADM细胞对阿霉素呈高度耐药性，并与柔红霉素和鬼臼乙叉甙交叉耐药，但与CsA无交叉耐药。CsA和α-IFN单独或联合应用均对K562／ADM细胞的耐药性有较强的抑制效应。流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析发现α-IFN和CsA单独或联合均不能下调细胞mdrl/P-gp的表达，反而应激性地刺激耐药细胞P-gp的合成增加，但可抑制P-gp的功能、增加K562／ADM细胞内阿霉素的积聚。结论 α-IFN和CsA联合可协同逆转耐药白血病细胞的耐药性，其作用机制为抑制P-gp的功能而非下调mdrl／P-gp的表达水平。     

shRNA逆转耐阿霉素人乳腺癌细胞株（MCF-7/AdrR）的多药耐药性

目的〖HT5"SS〗： 利用短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达载体逆转耐阿霉素人乳腺癌细胞株(MCF7/AdrR)的多药耐药性（multidrug resistance,MDR）。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 构建2个MDR1基因shRNA表达质粒,稳定转染MCF7/AdrR细胞。RTPCR分析MDR1基因mRNA的表达,Western blotting检测P糖蛋白(Pgp)的表达,流式细胞术和MTT法分别检测乳腺癌细胞的凋亡和对阿霉素的敏感     

非小细胞肺癌中SLC22A18的表达及其临床意义

背景与目的已有的研究证明:多药耐药(multidrug resistance,MDR)是肺癌化疗失败的主要原因,研究MDR的产生机制对于提高肺癌的化疗疗效有着重要的临床意义。SLC22A18基因编码蛋白与跨膜转运体相似,影响药物敏感性、细胞代谢和生长,可能在肺癌MDR的产生中发挥一定作用。本研究旨在检测SLC22A18在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)及相应正常组织中的表达,并分析其与组织学类型、分级和TNM分期的关系。方法应用免疫组化EnVinsion法检测SLC22A18在96例NSCLC及正常组织中的表达,结果用统计学软件SPSS17.0进行分析。结果 SLC22A18主要定位于胞膜和胞质中。SLC22A18在NSCLC中的表达高于正常组织,差异明显(P<0.01),鳞癌、腺癌阳性率分别为68.0%和78.2%,差异性有统计学意义(P<0.05)。鳞癌、腺癌不同病理分级、TNM分期间SLC22A18表达差异性均有统计学意义,癌组织分化越差、分期越晚,SLC22A18表达越高(P<0.05)。结论 SLC22A18在NSCLC组织中高表达,表达的高低与组织学类型、分级、TNM分期有关,本研究为进一步探讨SLC22A18在肿瘤中的表达及可能的耐药作用提供了实验依据。