L-选择素在肝癌细胞株HepG2中的表达

目的:观察L-选择素在人正常肝细胞株(L-02)和人肝癌细胞株(HepG2)中的表达。方法:应用RT-PCR法检测肝癌细胞株HepG2、正常肝细胞株L-02中L-选择素mRNA表达情况;应用流式细胞术检测HepG2细胞、L-02细胞中L-选择素的蛋白表达。结果:L-选择素mRNA在HepG2细胞中有表达,而在正常肝细胞株L-02细胞中无表达;HepG2细胞L-选择素的表达量为(10.09±0.51)%,而在L-02细胞中则无表达。结论:L-选择素在HepG2细胞中有表达而在L-02细胞中不表达。     

Apaf-1通过wnt/β-catenin信号通路调控肝癌的机制研究

目的 研究Apaf-1基因在wnt/β-catenin信号通路中的作用及在肝癌细胞中的调控表达机制.方法 通过TOP-flash实验验证Apaf-1基因在wnt/β-catenin信号通路中调控作用机制;采用实时定量PCR方法检测各种肝癌细胞株(HepG2、H HCC、HB611)及正常肝细胞株(LO2)中Apaf-1基因的表达量;构建Apaf-1 RNA干扰质粒,转染到HepG2中并检测转染效率,检测相关基因及蛋白表达.结果 TOPflash实验发现Apaf-1可以抑制wnt/β-catenin信号通路,并且这种抑制作用具有剂量依赖效应;在肝癌细胞株中,Apaf-1表达量较正常肝细胞表达量降低,且在HepG2细胞株中表达量最低;在肝癌细胞株(HepG2)中RNA干扰Apaf-1基因,Apaf-1基因的的表达量显著降低,wnt信号通路下游基因及蛋白(β-catenin、Cyclin A、CDK2、wnt5a、STAT3、EGFR、APC)的表达量均显著性升高或降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Apaf-1基因通过wnt/β-catenin信号通路在肝癌细胞的生成过程中具有重要功能.     

过表达外源性Cyr61对人肝癌细胞株HepG2生长和迁移的影响

目的 采用AdEasy系统构建的带有标记基因RFP的重组腺病毒Ad-Cyr61感染人肝癌细胞株HepG2,并观察外源性cyr61对肿瘤细胞生长和迁移的影响.方法 Ad-Cyr61与Ad-RFP分别感染人肝癌细胞株HepG2,荧光倒置显微镜观察荧光表达,通过RT-PCR、免疫组化实验分别检测Ad-Cyr61的mRNA和蛋白的表达;通过M1Tr实验、细胞计数实验、克隆形成实验和划痕愈合实验,观察Cyr61对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖和迁移的影响.结果 Ad-Cyt61感染人肝癌细胞株HepG2,与对照组比较细胞数量增多,集落形成增加,细胞划痕逐渐愈合.结论 Ad-Cyr61感染人肝癌细胞株HepG2后可促进细胞增殖和迁移,提示Cyr61在肿瘤发生和转移中可能起到重要作用.     

信号转导及转录活化因子3在肝癌细胞株及组织内的表达

目的研究信号转导及转录活化因子3(STAT3)在肝癌细胞株及肝癌组织中的表达。方法 RT-PCR、Western blot检测人肝癌细胞株HepG2、Hep-3B、Bel-7402、SMMC 7721及正常永生化人肝细胞L-02细胞内STAT3 mRNA和蛋白的表达;取肝癌组织标本,RT-PCR和免疫组化检测肝癌组织和癌旁组织内STAT3 mRNA转录水平以及STAT3蛋白表达。结果所检测肝癌细胞株中STAT3的转录水平均高于L-02,HepG2 STAT3蛋白表达显著高于L-02;肝癌组织中STAT3转录及蛋白表达水平均高于癌旁组织。结论肝癌中存在STAT3的异常表达。     

CYR61/CCN1在肝细胞肝癌中的原位表达及其临床意义

目的：观察Cyr61在肝细胞肝癌中表达的意义．方法：采用免疫组化法和RT—PCR共检测65例肝细胞肝癌中Cyr61蛋白和mRNA表达水平,分析其表达与肝癌的临床病理学特征的关系．结果：高分化HCC组织的Cyr61蛋白表达水平高于低分化HCC组织（P〈0．01）;镜下存在静脉浸润、多结节的HCC组织中Cyr61蛋白表达高于无静脉浸润、单结节的HCC组织（P〈0．05）．30例肝癌组织Cyr61mRNA表达均为阳性,86．67％（26／30）癌组织Cyr61mRNA表达低于相应癌旁组织（P〈0．05）．结论：Cyr61可能在肝癌的发生早期发挥重要作用,并与肝癌进程中的间质重建和侵袭转移有关．     

γ-谷氨酰转移酶ⅠmRNA亚型联合甲胎蛋白mRNA检测对肝癌的诊断价值

目的：探讨γ-谷氨酰转移酶ⅠmRNA（GGTⅠmRNA）亚型和甲胎蛋白（AFP）mRNA检测对肝癌的诊断价值。方法：运用RT—PCR检测肝脏组织标本和人肝细胞株QSG-7701、人肝癌细胞株HepG2中GGTⅠmRNAA、B、C3种亚型和AFP mRNA的表达。结果：AFP mRNA在肝癌组织中的表达显著高于非癌肝组织、癌旁组织和远癌组织。GGTⅠmRNAA亚型主要在非癌肝组织中表达，B亚型主要在远癌组织、癌旁组织、癌组织中表达。人肝细胞株QSC-7701中GGTⅠmRNAC亚型阳性表达。人肝癌细胞株HepG2中AFP mRNA、GGTⅠ mRNAB亚型表达阳性。GGTⅠmRNAB亚型联合AFP mRNA诊断肝癌的阳性率可达98．0％，小肝癌的阳性率达95．2％。结论：在肝脏癌变的过程中存在着GC-TⅠmRNAA亚型向B亚型的转化，联合监测GGTⅠmRNA亚型和AFPmRNA有助于对肝癌的早期诊断。     

HBx通过Wnt/β-catenin通路促进HepG2细胞增殖

目的 探讨Wnt/β-catenin通路在稳定表达乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)的HepG2肝癌细胞增殖中的作用机制. 方法 验证前期构建的HepG2/HBx细胞株能稳定表达HBx蛋白.CCK 8法检测HepG2/HBx,HepG2/mock及HepG2 3组细胞增殖情况,RT-PCR及Western-blot法分别检测上述3种细胞中β-cateninmRNA和蛋白表达水平;最后检测β-catenin选择性抑制剂XAV939(20 μmol/L)对各组细胞增殖水平的影响. 结果 前期构建的HepG2/HBx细胞株能稳定表达HBx蛋白.细胞增殖实验表明,HepG2/HBx组细胞增殖能力强于对照组(P＜0.05).RT-PCR及Western-blot检测结果显示,HepG2/HBx组细胞中β-catenin的mRNA及蛋白表达水平均高于对照组(P＜0.05),而HepG2/mock及HepG2组细胞之问则无明显差别.XAV939能够抑制各组细胞的增殖能力,HepG2/HBx组细胞在加入20 μmol/L XAV939作用后的增殖速度较加入相同浓度DMSO的HepG2/HBx组细胞下降(P＜0.05).XAV939对HepG2/HBx组细胞增殖的抑制强于对照组. 结论 HBx蛋白可以上调肝细胞β-catenin表达,激活Wnt邝-eatenin通路,促进肝癌细胞增殖.选择性β-catenin抑制剂可部分逆转该作用.     

人肝癌细胞株VEGF/VEGFR的检测及意义探讨

目的：筛选血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）高表达肝癌细胞株，为进一步研究VEGF在肝癌治疗中的作用提供理论依据。并探讨VEGF受体在肝癌细胞株的表达及意义。方法：ELISA法及Western blot法分别检测人肝癌细胞株培养上清及细胞内VEGF蛋白的表达。免疫细胞化学方法检测VEGFR在人肝癌细胞中的表达。结果：5株肝癌细胞株均见VEGF蛋白表达，其中SMMC-7721的VEGF表达量最高，VEGF特异性受体Fit-1在HepG2、HHCC、SMMC-7721、Bcl-7402见阳性表达，KDR在HepG2、HHCC、Bel-7402、QGY-7701见阳性表达。结论：肝癌细胞株中VEGF表达量不尽一致，VEGF在肝癌发生发展中可能存在自分泌作用方式。     

β-catenin评价肝细胞癌125I粒子植入治疗的实验研究

  目的 研究β-catenin在HepG2肝癌细胞株中的表达以及125I粒子对其表达的影响,以β-catenin为检测指标,评价肝细胞癌125I粒子植入治疗的疗效。方法 采用免疫荧光法、Western blot和real-time PCR的方法观察β-catenin在125I粒子照射1,2,4周各组HepG2肝癌细胞株中的表达。比较各实验组和对照组β-catenin在HepG2肝癌细胞株中表达。结果 免疫荧光实验显示照射后β-catenin在肝癌细胞中的表达与照射前比较明显降低,Western-blot实验显示125I粒子照射后β-catenin蛋白的表达较照射前明显降低（P=0.009）,并且与照射时间呈正相关（P＝0.041）。real-time PCR实验显示125I粒子照射后,肝癌细胞β-catenin RNA明显下降（P=0.000）,并且下降程度也同125I粒子照射时间呈正相关（P＝0.009）。结论 在HepG2肝癌细胞株中存在β-catenin的高表达。125I粒子近距离照射后,β-catenin在HepG2肝癌细胞株中的表达呈下降趋势,并且下降程度与125I粒子照射时间呈正相关。125I粒子近距离照射对于HepG2肝癌细胞株具有疗效。     

不同转移潜能的肝细胞肝癌细胞中EMS1/cortactin的表达与定位

目的:研究不同转移潜能的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中株中EMS1/cortactin的表达与定位,探讨EMS1/cortactin与HCC细胞生物学行为的相关意义。方法:在不同生物学特性的HCC细胞株[较高转移潜能的MHCC-97H(97H),惰性潜能的SMMC-7721(7721)和HepG2]中采用RT-QPCR、Western Blot和免疫荧光方法检测EMS1基因和cortactin蛋白的表达,在共聚焦显微镜下观察cortactin蛋白在细胞中的定位。结果:97H、7721、HepG2细胞中EMS1 mRNA水平分别为正常肝细胞株L02的23.5倍、15.3倍和10.5倍;cortactin水平分别为L02的3.6倍、2.7倍和2.6倍(均P<0.05)。HCC细胞株中cortactin蛋白表达高于L02。97H细胞中EMS1/cortactin的表达均高于其他两株HCC细胞。各型HCC细胞株中cortactin蛋白聚集在细胞膜下的皮质区。L02细胞中cortactin蛋白弥散分布在胞质中。结论:HCC细胞中EMS1基因和cortactin蛋白高表达在癌细胞膜下的皮质区,与癌转移潜能相关。     

肝癌细胞铁蛋白磁共振成像的实验研究

目的 研究肝癌细胞中内源性铁蛋白的表达情况,并进一步分析铁蛋白的表达与磁共振成像（MRI）的信号关系如何。方法 对3种肝癌细胞株QGY-7703、HepG2、SK-Hep-1以及正常肝细胞L02,4种细胞株内源性铁蛋白表达情况进行检测,用RT-PCR方法 检测基因表达,Western blot检测细胞株中铁蛋白表达,同时测定细胞培养液上清中铁蛋白的分泌量。最后检测4种细胞磁共振信号的情况,分析细胞铁蛋白表达与磁共振信号的关系。结果 RT-PCR与Western Blot均显示铁蛋白的基因表达与蛋白表达,HepG2与QGY-7703表达最强,SK-Hep-1表达中等,L02表达很弱。4种细胞培养液上清中HepG2与QGY-7703分泌铁蛋白量较高,SK-Hep-1分泌较低,L02分泌量很低。磁共振细胞显像,T1WI、T2WI及PD均显示HepG2与QGY-7703磁共振信号强度低,而SK-Hep-1与L02信号强度较高。结论 各种肝癌细胞中铁蛋白表达水平不同,铁蛋白表达水平与磁共振细胞显像信号强度呈负相关。     

瘦素及其受体蛋白在肝癌细胞中的表达及意义

目的:研究瘦素及其受体在人肝细胞癌细胞株中的表达情况,探讨其在肝癌发生过程中的可能作用。方法:制备人正常肝细胞株L02及人肝细胞癌细胞株HepG2、SMMC7721的细胞爬片,采用免疫组织化学染色法检测上述细胞株中瘦素和瘦素受体蛋白的表达,以医学图文分析系统进行定量分析。结果:人正常肝细胞株L02及人肝细胞癌细胞株HepG2、SMMC7721中均存在瘦素及其受体蛋白的阳性表达,并且瘦素及其受体蛋白的表达水平均是人肝癌细胞株高于人正常肝细胞株,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:瘦素及其受体以双重表达方式存在于人肝细胞癌细胞中,可能在肝癌的发生中起到一定作用。     

人肝癌细胞株QGY-7701蛋白质组学研究技术及二维电泳图谱的建立

目的:建立人肝癌细胞株QGY-7701蛋白质组学研究技术.方法:利用两种不同的裂解液提取细胞蛋白,进行双向电泳,经PDQuest软件分析与比较后,挑选匹配良好的10个蛋白点,进行基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的鉴定.结果:建立了稳定的人肝癌细胞株QGY-7701的双向电泳图谱,裂解液Ⅱ比裂解液Ⅰ提取的蛋白质量多25%,2-DE胶上蛋白点数多32%,从10个候选蛋白中鉴定出9个有意义的蛋白(P＜0.05).结论:初步建立了人肝癌细胞株QGY-7701的蛋白质组学研究技术,为进一步开展药物蛋白质组学研究奠定基础.     

β-catenin在原发性肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的探讨肝细胞癌肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）B—catenin的表达与HCC临床病理特征的关系。方法应用Envsion法检测333例HCC,168例癌旁肝组织及89例正常肝组织的β-catenin表达;RT—PCR检测37例HCC及癌旁组织,肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L02的β-cateninmRNA表达。结果β-catenin在HCC胞质、胞核的阳性表达率为79％／37％;在癌旁和正常肝组织中的表达率为72％／0％、70％／0％。差异均有统计学意义（P均〈0．05）。且分化好的癌细胞表达低,分化差的细胞表达高。同时,HCC和HepG2的β-cateninmRNA表达高于癌旁组织及LO2的表达。结论肝细胞癌的β-catenin过表达提示其在癌的发生过程中可能起着促癌的作用。     

Cyr61在人肿瘤组织中的表达

目的观察分析富含半胱氨酸61(cysteine-rich61,Cyr61)在人类肿瘤组织中的表达情况。方法采用HE染色、免疫组化的方法检测多组织肿瘤组织芯片和30例肿瘤组织标本(包括食管癌、胃癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌和肝癌组织标本各5例)中Cyr61的表达。结果组织芯片中79%(38/48)的肿瘤组织Cyr61表达阳性,93%(28/30)肿瘤组织标本中Cyr61表达阳性。其中神经、食管和甲状腺等肿瘤组织中呈强阳性表达,胃、肝、结肠、直肠、肺、肾、子宫、皮肤、卵巢、乳腺等组织的肿瘤呈阳性表达,在膀胱、前列腺和胰腺等肿瘤组织中表达较弱。结论Cyr61在多数肿瘤组织中均过表达,在不同肿瘤组织中表达程度不同,Cyr61可能成为新的肿瘤标志物应用于多种肿瘤的诊断。     

TSA对不同肝癌细胞株增殖和凋亡的作用及其对HBV复制的影响

目的:比较组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)抑制剂HDAC曲古抑菌素A(Trichostain A,TSA)对不同肝癌细胞株和正常肝细胞株增殖和凋亡的作用.初步研究TSA对HBV复制的影响.方法:应用四氮唑蓝(MTT)法,DNA琼脂糖凝胶电泳检测经不同浓度TSA处理过的3种肝癌细胞株HepG2、QGY7701、HepG2.2.15和正常肝细胞株L02,观察细胞增殖和凋亡的改变.用微离子酶联免疫法检测TSA处理组和对照组HepG2.2.15细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量,实时荧光定量PCR检测细胞上清中HBV DNA含量,初步探讨TSA对HBV复制的影响.结果:TSA在一定浓度范围内能明显抑制不同肝癌细胞株的增殖,呈剂量依赖关系.对正常肝细胞株L02的增殖无明显影响.DNA凝胶电泳结果显示:在TSA处理组的3种肝癌细胞株HepG2、QGY7701、HepG2.2.15中可观察到细胞凋亡特异的DNA梯形带,然而,在对照组及正常肝细胞株中未见DNA梯形带.经TSA处理后的HepG2.2.15细胞上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA的含量均高于对照组1倍以上(P＜0.05).结论:组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA虽然可抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡,但是,TSA刺激HBV的复制.因此,对HBV阳性的肝癌患者,应尽量避免使用TSA.     

SYK基因启动子甲基化对肝细胞癌侵袭力的影响

目的 探讨肝癌细胞中SYK基因启动子甲基化的状态及其对肝细胞癌侵袭力的影响.方法 分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法和甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测SYK基因在肝(癌)细胞系L02、HepG2、MHCC97H、MHCC97L中的表达和甲基化状态;对SYK基因甲基化阳性的MHCC97H和HepG2细胞株利用TRANSWELL小室检测去甲基化药物5-氮杂-2＇-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理前后肝癌细胞穿膜的细胞数,作为评价肝癌细胞体外浸润能力的指标.结果 L02、MHCC97L表达SYK mRNA,MHCC97H、HepG2不表达SYK mRNA;L02、MHCC97L细胞SYK基因甲基化阴性,MHCC97H、HepG2细胞SYK基因甲基化阳性.甲基化阳性的MHCC97H、HepG2细胞经5-Aza-CdR处理后,SYK基因异常甲基化状态得到逆转,体外浸润能力显著下降(P＜0.001).结论 肝癌细胞中SYK基因的表达与启动子甲基化有关,SYK基因可抑制肝癌细胞的体外浸润能力.     

鳖甲煎丸对Wnt信号通路中β-catenin/TCF4复合物活性及信号分子cyclin D1、MMP-2的影响

目的探讨鳖甲煎丸抗肝细胞癌转移侵袭的分子机制。方法使用含鳖甲煎丸药物血清培养肝癌细胞HepG2,48 h后采用
免疫荧光技术检测Wnt/β-catenin通路信号分子β-catenin蛋白表达水平,双荧光素酶检测法检测β-catenin/TCF4复合物的活性,
采用RT-PCR技术检测cyclin D1 与MMP-2 基因转录水平,Western blot 技术检测cyclin D1 与MMP-2 的蛋白表达水平。结果
含鳖甲煎丸药物血清可降低肝癌细胞HepG2细胞核中β-catenin蛋白的表达水平,抑制β-catenin/TCF4复合物的活性,明显下调
cyclin D1、MMP-2的基因转录及其蛋白的表达水平。结论鳖甲煎丸可抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制肝癌细胞HepG2
的生长、粘附和转移。
     

人肝癌细胞株QGY-7701亚细胞蛋白质组双向电泳技术的建立

目的优化人肝癌细胞株QGY-7701的蛋白质样品制备方法,建立其亚细胞蛋白质组双向电泳技术。方法分步提取人肝癌细胞株QGY-7701细胞质、细胞膜和细胞核蛋白,采用不同的方法除盐、浓缩样品,然后分别采用2种不同的水化上样缓冲液重悬样品,进行双向凝胶电泳。结果使用三氯乙酸/丙酮的除盐效果好,样品损失少;采用上样缓冲液(7mol/L尿素 2mol/L硫脲 4%CHAPS 40mmol/L Tris 65mmol/L DTT 2%两性电解质)有利于蛋白的溶解,获得更多的蛋白信息,检出的细胞质蛋白点数可达(995±53),细胞膜蛋白点数可达(1035±58),细胞核蛋白点数可达(893±45)。结论获得了清晰的人肝癌细胞株QGY-7701亚细胞蛋白质组双向电泳图谱。     

乙肝病毒X蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路调控Gankyrin表达

目的：研究乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBX）对Gankyrin表达水平的影响以及Wnt/β-catenin信号通路在HBX基因调控Gankyrin表达中的作用。方法：HBX腺病毒表达载体（Ad-HBX-GFP）感染转染2种人肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721细胞,Si-HBX分子（Si-HBX oligo）用 LipofectamineTM 2000转染入HepG2.2.15细胞,用RT-PCR和Western blot法检测HBX与Gankyrin的表达情况;β-catenin腺病毒载体转染HepG2、SMMC-7721细胞,用Western blot法检测β-catenin与Gankyrin的表达情况;在沉默β-catenin表达的HepG2、SMMC-7721细胞中过表达HBX基因,Western blot法检测β-catenin与Gankyrin的表达情况。结果：①HepG2.2.15细胞中Gankyrin mRNA与蛋白表达水平均高于HepG2细胞（P＜0.05）。②HepG2与SMMC-7721细胞系中Ad-HBX-GFP组Gankyrin mRNA与蛋白表达水平均高于绿色荧光蛋白腺病毒表达载体（Ad-GFP）组（P＜0.01）。③HepG2.2.15细胞中Si-HBX组Gankyrin mRNA与蛋白表达水平均低于Si-阴性对照（Si-NC）组（P＜0.01）。④在HepG2与SMMC-7721细胞系中过表达HBX后,Ad-HBX-GFP组β-catenin的蛋白表达水平均高于Ad-GFP组（P＜0.01）。⑤在HepG2与SMMC-7721细胞系中过表达β-catenin后,β-catenin腺病毒表达载体（Ad-β-catenin-GFP）组Gankyrin的蛋白表达水平均高于Ad-GFP组（P＜0.01）。⑥在HepG2与SMMC-7721细胞系中沉默β-catenin后,过表达HBX基因,Si-β-catenin腺病毒表达载体（Ad-si-β-catenin-RFP）组与红色荧光蛋白腺病毒表达载体（Ad-RFP）组相比,Gankyrin的蛋白表达水平未见升高（P＜0.01）。结论：HBX-Wnt/β-catenin-Gankyrin信号转导通路存在与肝癌细胞中,抑制β-catenin的功能可阻遏HBX对Gankyrin的上调作用,本结果将可能为肝癌的治疗提供新的思路。