组织工程血管种子细胞的培养

目的：为构建组织工程血管提供种子细胞。方法：全麻下取兔的主动脉，分别采用酶消化法和组织块贴壁法培养血管内皮细胞和平滑肌细胞，并传代，免疫组化鉴定及倒置显微镜下形态学观察。结果：成功地培养出血管内皮细胞和平滑肌细胞并传代，倒置显微镜下血管内皮细胞呈“鹅卵石”形态，平滑肌细胞呈典型的“峰—谷”状。免疫组化鉴定内皮细胞Ⅷ因子（ ），平滑肌细胞α—肌动蛋白( )。结论：所培养的血管内皮细胞和平滑肌细胞为研究组织工程血管提供了细胞来源。     

组织工程血管种子细胞的培养

目的:为构建组织工程血管提供种子细胞。方法:全麻下取兔的主动脉,分别采用酶消化法和组织块贴壁法培养血管内皮细胞和平滑肌细胞,并传代、免疫组化鉴定及倒置显微镜下形态学观察。结果:成功地培养出血管内皮细胞和平滑肌细胞并传代。倒置显微镜下血管内皮细胞呈“鹅卵石”形态,平滑肌细胞呈典型的“峰-谷”状。免疫组化鉴定内皮细胞Ⅷ因子(+),平滑肌细胞α-肌动蛋白(+)。结论:所培养的血管内皮细胞和平滑肌细胞为研究组织工程血管提供了细胞来源。     

血管组织工程中单根主动脉培养的内皮细胞和平滑肌细胞形态学和生长增殖

目的:探索体外培养及扩增同一来源内皮细胞和平滑肌细胞的有效方法,为研究内皮细胞和平滑肌细胞相互关系和体外构建组织工程血管提供理论和实践基础。方法:在体外用酶消化法和组织块贴壁法分别建立内皮细胞和平滑肌细胞的原代,并应用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸钠传代培养。应用光镜、透射电镜和细胞计数对内皮细胞和平附肌细胞的形态和增殖进行研究。结果:酶消化法和植块培养法可以有效的建立起内皮细胞和平滑肌细胞的原代。讨论:内皮细胞和平滑肌细胞作为血管构成的基本细胞,对于它们的形态学、体外培养和扩增以及相互关系的研究具有重要的意义。     

血管组织工程中单根主动脉培养的内皮细胞和平滑肌细胞形态学和生长增殖

目的：探索体外培养及扩增同一来源内皮细胞和平滑肌细胞的有效方法，为研究内皮细胞和平滑肌细胞相互关系和体外构建组织工程血管提供理论和实践基础。方法：在体外用酶消化法和组织块贴壁法分别建立内皮细胞和平滑肌细胞的原代，并应用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸钠传代培养。应用光镜、透身电镜和细胞计数对内皮细胞和平滑肌细胞的形态和增殖进行研究。结果：酶消化法和植块培养法可以有效的建立起内皮细胞和平滑肌细胞的原代。讨论：内皮细胞和平滑肌细胞作为血管构成的基本细胞，对于它们的形态学、体外培养和扩增以及相互关系的研究具有重要的意义。     

体外修复血管平滑肌细胞的方法学研究

目的:采用不同方法体外培养人脐动脉平滑肌细胞,选择以获得体外修复受损平滑肌细胞的最佳方法。方法:实验于2004-12/2005-10在哈尔滨医科大学附属第一医院实验中心卫生部细胞移植重点实验室进行。①取新生儿脐带约5cm长(家属志愿提供)原代分离血管平滑肌细胞;分别用贴块法和胰酶/胶原酶酶解法分离、培养血管平滑肌细胞。②贴块法:将血管平滑肌细胞组织块20%M199完全培养基(200mL/L胎牛血清 10mL/L双抗 5mL/LL-谷氨酰胺)贴壁24h后,补足完全培养基培养;胰酶/胶原酶酶解法:第1步胰酶消化:将脐动脉剪成1mm×1mm大小。装入含2.5g/L胰酶培养瓶中,消化15～30min,加入20%M199完全培养基终止消化。第2步胶原酶消化:将上述处理过的组织块放入含1g/LⅠ型胶原酶的无血清M199培养基中,过夜,离心,收集细胞,以1×104个细胞/cm2密度接种培养皿中,补足20%M199完全培养基培养。③对两种方法培养的细胞生长形态、数量及平滑肌а-肌动蛋白表达情况进行观察和检测。结果:①贴块法:组织块种植后2周时,多数细胞已贴壁伸展。4～6周细胞达80%融合时,镜下成“峰与谷”样,可传代培养,传代间隔期一般是两三周;胰酶/胶原酶酶解法:细胞多为伴有胞质突起的多角形大细胞,达到生长融合时细胞密度低。2周左右细胞融合,可传代培养。传代间隔期一般是一两周。②贴块法获得的细胞初期生长速度慢,但达到融合前细胞数量多,细胞得率高;胰酶/胶原酶酶解法获得的细胞初期生长速度快,群体倍增时间短,但达到融合前细胞数量少于贴块法,细胞得率低。③胰酶/胶原酶法α-肌动蛋白阳性细胞率高于贴块法(93.1%,71.4%,χ2=4.626,P<0.05)。结论:两种方法均可成功培养人血管平滑肌细胞;贴块法合成表型细胞比例大,胰酶/胶原酶酶解法收缩表型细胞比例大,后者所获得的细胞更适合用作修复血管平滑肌细胞的种子细胞。     

体外修复血管平滑肌细胞的方法学研究

目的：采用不同方法体外培养人脐动脉平滑肌细胞，选择以获得体外修复受损平滑肌细胞的最佳方法。方法：实验于2004—12／2005—10在哈尔滨医科大学附属第一医院实验中心卫生部细胞移植重点实验室进行。①取新生儿脐带约5cm长（家属志愿提供）原代分离血管平滑肌细胞；分别用贴块法和胰酶／胶原酶酶解法分离、培养血管平滑肌细胞。②贴块法：将血管平滑肌细胞组织块20％M199完全培养基（200mL/L胎牛血清＋10mL／L双抗＋5mL/L-谷氨酰胺）贴壁24h后，补足完全培养基培养；胰酶／胶原酶酶解法：第1步胰酶消化：将脐动脉剪成1mm&;#215;1mm大小。装入含2．5g／L胰酶培养瓶中，消化15-30min，加入20％M199完全培养基终止消化。第2步胶原酶消化：将上述处理过的组织块放入含1g／LⅠ型胶原酶的无血清M199培养基中，过夜，离心，收集细胞，以1&;#215;10^4个细胞／cm^2密度接种培养皿中，补足20％M199完全培养基培养。③对两种方法培养的细胞生长形态、数量及平滑肌α-肌动蛋白表达情况进行观察和检测。结果：①贴块法：组织块种植后2周时，多数细胞已贴壁伸展。4～6周细胞达80％融合时，镜下成“峰与谷”样，可传代培养，传代间隔期一般是两三周；胰酶／胶原酶酶解法：细胞多为伴有胞质突起的多角形大细胞，达到生长融合时细胞密度低。2周左右细胞融合，可传代培养。传代间隔期一般是一两周。②贴块法获得的细胞初期生长速度慢，但达到融合前细胞数量多，细胞得率高；胰酶／胶原酶酶解法获得的细胞初期生长速度快，群体倍增时间短，但达到融合前细胞数量少于贴块法，细胞得率低。（曼）胰酶／胶原酶法α-肌动蛋白阳性细胞率高于贴块法（93．1％．71．4％，x^2=4．626，P〈0．05）。结论：两种方法均可成功培养人血管平滑肌细胞；贴块法合成表型细胞比例大，胰酶／胶原酶酶解法收缩表型细胞比例大，后者所获得的细胞更适合用作修复血管平滑肌细胞的种子细胞。     

血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞生长增殖的影响

背景:在体外构建组织工程材料的过程中,快速获得足够数量且纯度高的种子细胞极为重要,但目前人脐静脉间充质干细胞原代培养的增殖率仍较低.目的:观察血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞原代生长、增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008 03/07在辽宁医学院解剖学实验室完成.材料:正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条,由锦州市凌河区妇幼保健院及辽宁医学院附属第一医院提供.方法:采用胶原酶消化法分离人脐静脉间充质干细胞,以1×105L-1的密度接种于24孔培养板,设立2组,实验组加入150 g/L 血管内皮细胞生长因子,对照组不加入任何细胞因子.主要观察指标:观察细胞形态变化,MTT法检测细胞生长曲线,免疫细胞化学法鉴定细胞CD166的表达.结果:接种后6 h细胞开始贴壁,48 h后细胞完全贴壁生长,出现呈椭圆形、多角形的内皮细胞,以及呈梭形的成纤维样细胞,有的形成漩涡状生长集落;原代培养1周后细胞以梭形为主;传代后24 h细胞基本完成贴壁,48 h细胞开始分裂增殖,5～7 d可见多核的成纤维样细胞贴壁,呈长杆状、三角形、梭形等.与对照组比较,实验组细胞生长状态较好,增殖较快,单位时间内获得的细胞数量明显增加(t=2.235,P＜0.05),CD166阳性细胞率显著升高(t=-1.638,P＜0.01).结论:血管内皮细胞生长因子可促进入脐静脉间充质干细胞贴壁,且更有利于间充质干细胞的增殖和纯化.     

兔阴道平滑肌细胞体外分离与培养

背景:阴道平滑肌细胞原代培养主要有两种方法:酶消化法和组织块贴壁法。前者培养所需时间短,产量高,但所需组织量较大,且试验中污染机会大,最佳消化时间不易把握;后者虽方法简便、有效,但培养所需时间较长。目的:观察组织块 酶消化法原代培养兔阴道平滑肌细胞时间,并与组织块法比较。设计、时间及地点:体外观察实验,于2005-02/2006-02在南昌大学第一附属医院烧伤研究所及动物实验室完成。材料:四五个月龄雌性新西兰大白兔,体质量2.0～2.5kg。方法:①组织块法原代培养阴道平滑肌细胞:将修剪好的1mm×1mm×1mm组织块均匀地接种于培养皿中,然后放入37℃恒温培养箱中静置培养3.0～4.0h,待组织块贴壁牢固后,再补加含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液,使组织块浸于培养液中,37℃恒温静置培养3.0～4.0d,待细胞游出后换液,大约每3天换液一次。②组织块 酶消化法原代培养阴道平滑肌细胞:将组织块用0.1%胶原酶Ⅳ在37℃培养箱中消化0.5～1.0h,至组织块边缘变毛时中止消化,然后将消化好的组织块接种于培养皿上,其余步骤同组织块法。③传代培养:第1次传代时机应根据细胞生长具体情况而定,在细胞达50%～60%融合时即进行传代培养。第2次以后传代,在细胞生长达80%融合时进行传代培养。主要观察指标:①原代培养所需时间。②第3代阴道平滑肌细胞表面结构和超微结构。结果:组织块 酶消化法原代培养细胞萌出时间较组织块法早1.0～2.0d,细胞融合时间较组织块法早3.0～4.0d,细胞可稳定传5～6代。倒置显微镜下观察两种方法所培养细胞呈梭形或多角形,融合时部分区域细胞出现平滑肌细胞特征性生长表现"峰-谷"状结构。透射电镜下观察,第3代阴道平滑肌细胞核呈锯齿状,胞浆内含平滑肌细胞特征性结构肌丝和密体,含有大量高尔基体,粗面内质网扩张,游离核糖体丰富,提示获得合成表型阴道平滑肌细胞比例大。结论:组织块 酶消化法原代培养周期较短,需要注意的是在取材、分离整个操作过程中需保持阴道组织块湿润;胶原酶消化组织块时间不应过长,以组织块周边呈现毛须状为度;此外应在静置状态下培养。     

本刊组织构建栏目已出版“血管组织工程”研究的相关文章

血管组织工程种子细胞原代培养技术的改良唐新华,黄玲,夏宁,等.2008,12(42):8277-8280[关键词]血管组织工程;血管内皮细胞;血管平滑肌细胞血管组织工程种子细胞在再生医学中的应用李春民,汪忠镐2010,14(32):6022-6026[基金]国家高技术研究发展计划(863)基金资助项目(2006AA02A134)[关键词]种子细胞;内皮细胞;平滑肌细胞;间充质干细胞;     

两种消化酶在培养晶状体上皮细胞中的消化作用

目的：分析Ⅰ型胶原酶和胰酶在晶状体上皮细胞体外培养中的不同消化作用,以寻找更好的实验方法。方法采用胰酶消化培养法,Ⅰ型胶原酶消化培养法,分别进行晶状体上皮细胞的原代培养,设立对照组和实验组,倒置相差显微镜观察细胞的生长情况,并通过台盼蓝染色观察经消化酶解后游离细胞的存活数量,判别两组间消化作用的差异。结果Ⅰ型胶原酶消化的组织片更容易贴壁,生长速度更快,其游离细胞台盼蓝不着色率为（78．85±6．78）％,胰酶消化法为（27．20±3．28）％,两种酶消化后细胞存活率比较,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论Ⅰ型胶原酶消化法培养晶状体上皮细胞的成功率远优于传统改良的胰酶消化法。