基因表达谱芯片技术筛选XTP1基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP1蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-XTP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为eDNA,与转染空表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和。DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有3个基因表达水平显著上调,24个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP1蛋白可能的生物学功能提供依据。     

应用基因表达谱芯片技术筛选XTP6基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP6的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP6蛋白可能的分子生物学功能.方法设计并合成XTP6基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP6基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP6编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析的DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现21个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP6转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP6蛋白可能的生物学功能提供依据.     

应用基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒HBsAg基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因表达谱芯片技术研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)主蛋白的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响.方法设计并合成HBsAg主蛋白基因序列特异性的引物,以含有HBV全基因组的质粒G376 A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HBsAg蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达栽体pcDNA3.1(-)-HBsAg.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,29个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了HBsAg转染细胞后差异表达的基因,为深入研究HBsAg可能的生物学功能提供依据.     

不同基因区反义寡核苷酸抑制乙型肝炎病毒基因表达的比较

目的探讨反义寡核苷酸（ＡＳＯＮ）特异性抗病毒作用。方法在ＨｅｐＧ２２．２．１５细胞中观察了４段１６聚针对乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因不同功能区的ＡＳＯＮ对病毒复制的抑制作用。结果ＡＳＯＮ能显著抑制ＨＢＶ基因的抗原表达（Ｐ＜０．００１），在Ｓ基因区设计的ＡＳＯＮ对ＨＢｓＡｇ的抑制作用明显优于Ｃ基因区的ＡＳＯＮ（Ｐ＜０．０５）。反之，在Ｃ基因区设计的ＡＳＯＮ对ＨＢｅＡｇ的抑制作用又明显优于Ｓ和Ｐｒｅ－Ｓ２基因区的ＡＳＯＮ（Ｐ＜０．０１）。４段ＡＳＯＮ的联合用药并不能增强其对ＨＢＶ的抑制作用。结论ＡＳＯＮ可能成为一种有开发潜力的抗病毒药物。     

基因表达谱芯片技术筛选XTP4基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP4的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP4蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP4基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP4基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP4编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP4。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有21个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP4转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP4蛋白可能的生物学功能提供依据。     

乙型肝炎病毒前C区变异对HepG2细胞HLA-I表达的影响

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）前 C区热点变异对宿主细胞HLA—I分子表达的影响。方法 构建HBV前C区野毒株及A83、A83/A86变异株真核表达质粒,转染HePG2细胞,鉴定目的基因在宿主细胞中的生物活性,流式细胞术检测HLA—I分子的表达。结果 PCR和 ELISA法分析能检测到目的DNA片段和HBeAg,转染细胞表达HLA—I分子的平均荧光强度不同,野毒株为1.3,前C区变异后平均荧光强度增加,尤以A83变异表达增强显著（17.6）,A83/A86为7.3。结论 前C区热点变异后宿主细胞HLA—I分子的表达为上调。     

QSG-7701和HepG2细胞支持不同乙型肝炎病毒复制模式及其机制

目的研究QSG-7701及HepG2细胞支持HBV复制模式的差异及其内在机制。方法质粒PUC18-HBV1.2转染QSG-7701与HepG2细胞后定量检测细胞上清液中HBV DNA和HBsAg;采用基因芯片技术比较分析二者基因表达差异并用实时定量PCR验证。结果HepG2细胞在转染后6 d内培养上清液可检出HBV DNA及HBsAg,QSG-7701细胞转染后2周内均可检出HBV DNA及HBsAg,且HBV DNA在10 d内保持相对稳定的高水平复制(1×107～3×107拷贝/ml);基因芯片检测结果示QSG-7701细胞中与HBV生活周期相关的因予如HLF、RXRα、IL-6高表达,而HBxIP、SPIK1为低表达,MMP3不表达。结论QSG-7701支持高水平的HBV复制,并可维持cccDNA池的相对稳定,基因差异表达可能为二者支持不同HBV复制模式提供解释。     

X基因突变乙型肝炎病毒表达质粒的构建及细胞转染

对HBV X基因进行改造,通过插入合成DNA片段,造成X基因的缺陷,构建真核细胞表达质粒,研究X基因缺陷的HBV在肝癌细胞株的表达复制效果。 1.材料与方法:pBR322HBV_2质粒获赠于第二军医大学军队卫生教研室;Dmen、脂质体Lipfect 2000Mine及胎牛血清均为美国Gibco公司产品。乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测仪器为德国Roche公司的Lightcycler荧光PCR检测仪。由上海Sangon公司合成55bp双链DNA片段(L55),两端有ApaL I限制性内切酶识别序列,中间含有Pst I内切酶识别序列,两条单链分别为:a.5′TGCAC TTTGC GAGCC CGTTACACGT GGCCT GG CGC CCGCC ATCTG CAGGCATGCG C3′,b.3′-GAAAC GCTCG GGCAA TGTGCACCGG ACCGC GCGCG GTAGA CGTCC GTACGCACGT 5′。对HBV adrⅠ型基因组酶切位点分析及获赠质     

乙型肝炎病毒前C区变异对HepG2细胞HLA-Ⅰ表达的影响

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)前C区热点变异对宿主细胞HLA-Ⅰ分子表达的影响. 方法构建HBV前C区野毒株及A83、A83/A86变异株真核表达质粒,转染HepG2细胞,鉴定目的基因在宿主细胞中的生物活性,流式细胞术检测HLA-Ⅰ分子的表达. 结果 PCR和ELISA法分析能检测到目的DNA片段和HBeAg,转染细胞表达HLA-Ⅰ分子的平均荧光强度不同,野毒株为1.3,前C区变异后平均荧光强度增加,尤以A83变异表达增强显著(17.6),A83/A86为7.3. 结论前C区热点变异后宿主细胞HLA-Ⅰ分子的表达为上调.     

硫代磷酸反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒抗原表达的体外抑制作用

目的 研究硫代磷酸反义寡核苷酸（Ｓ－ＡＳＯＮ）的抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）作用。方法 作者以２．２．１５细胞作为研究对象，在ＨＢＶ基因Ｓ区和Ｃ区的翻译起始位点设计合成了２段１６聚Ｓ－ＡＳＯＮｓ，采用酶联免疫吸附试验检测了培养细胞上清中表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）的分泌情况。结果 当Ｓ－ＡＳＯＮ浓度为每天２μｍｏｌ／Ｌ时，对ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的抑制率可分别达到８８％和７５％，而无关     

Detection of hepatitis B virus genotypes using oligonucleotide chip among hepatitis B virus carriers in Eastern China

AIM： TO determine the genotype distribution of hepatitis B virus （HBV） with a newly oligonucleotide chip assay among the HBV carriers in Eastern China. METHODS： An assay using oligonucleotide chip was developed for detection of HBV genotypes in serum samples from HBV DNA-positive patients in Eastern China. This method is based on the principle of reverse hybridization with Cy5-labeled amplicons hybridizing to type-specific oligonucleotide probes that are immobilized on slides. The results of 80 randomly chosen sera were confirmed by direct sequencing. RESULTS： HBV genotype B, C and mixed genotype were detected in 400 serum samples, accounting for 8.3% （n = 33）, 83.2% （n = 333）, and 8.5% （n = 34）, respectively. The evaluation of the oligonucleotide assay showed 100% concordance with the amplicon phylogenetic analysis except 9 mixed genotype infections undetected by sequencing. CONCLUSION： The study indicates that HBV genotype C and B prevail in the Eastern China. It is suggested that the oligonucleotide chip is a reliable and convenient tool for the detection of HBV genotyping.     

HBV复制子pHY106-BHBV转染HepG2细胞基因表达差异

目的:研究乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系基因表达谱的差异,分析参与胆固醇代谢的差异表达基因.方法:应用包含20 000条人类全长基因的寡聚核苷酸芯片ImaGene3.0检测乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系基因表达谱差异,并选择其中参与胆固醇代谢的表达下调基因7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶,用RT-PCR方法进行验证分析.结果:基因芯片筛选出差异表达的基因,其中包括转录因子、细胞周期素、细胞因子相关蛋白、糖脂类物质代谢相关酶及细胞信号转导相关因子等,RT-PCR验证参与胆固醇代谢的几种表达差异的基因,其中7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶表达明显下调,与基因芯片分析结果一致.结论:乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系存在基因表达差异,乙型肝炎病毒感染可能通过抑制参与胆固醇代谢的7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶从而进一步影响机体胆固醇代谢.     

基因芯片监测拉米夫定致乙型肝炎病毒耐药突变的临床研究

目的 研究基因芯片技术在监测拉米夫定致乙型肝炎病毒(HBV)耐药突变中的临床意义。方法应用前瞻性方法,对20例经拉米夫定治疗和10例未治疗的乙型肝炎患者观察18个月,以聚合酶链反应扩增血清HBV,应用已研发的4位点拉米夫定耐药检测芯片监测YMDD相关突变。结果 基因芯片技术监测能有效分辨野生型和突变型HBV。HBV的耐药突变随用药时间延长,突变率显著增加(x~2=6.6 9,P<0.01),突变类型以M539V L515M为主,次之为M539I。HBV在YMDD突变后,继续应用拉米夫定对突变型病毒无效。结论 在应用拉米夫定时需要定期检测YMDD突变,常规的HBV DNA定性技术与基因芯片相比,可能会出现结论偏差,后者是最好的方法之一。出现耐药突变后,继续使用拉米夫定对耐药株无效,应停用或更换其它治疗方案。     

应用人类全基因组寡核苷酸芯片筛查自身免疫性肝炎相关基因

为研究自身免疫性肝炎发病过程中基因表达改变与免疫反应的关系,我们采用人类全基因寡核菅酸芯片筛查自身免疫性肝炎差异表达基因,并对结果进行聚类分析,筛选出与疾病关系最密切的基因功能群,为进一步阐明发病机制,寻找致病基因提供参考。     

携带IFN-5α基因的HBV DNA质粒构建及其表达

目的构建携带人IFN-5α基因的X基因缺陷的HBV DNA真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法在pBR322-B-HBV质粒(含adr Ⅰ型HBV DNA)中插入人工合成片段破坏其HBV—X基因区，再与IFN-5α片段连接，最后克隆入真核表达载体pcCNA3，获得携带人IFN-5α基因的X基因缺陷的HBV DNA真核表达质粒pcDNA3-KN-F1F2-IFN-5α。同时构建两组对照质粒，即连接完整HBV DNA的真核表达质粒和连接X基因缺陷的HBV DNA真核表达质粒，将上述3种质粒以脂质体法同时转染HepG2细胞，G418筛选出稳定表达系统后选用荧光定量PCR法、ELISA法、RT-PCR法检测3种包装病毒。的复制表达以及IFN-5α的表达水平。结果获得目的真核表达质粒pcDNA3-KN—F1F2-IFN-5α；目的质粒转染HepG2细胞后其包装病毒的复制表达水平均较两个对照组降低；插入的IFN-5α片段可以在mRNA以及蛋白质水平表达。结论成功构建携带人IFN-5α基因的X基因缺陷的HBVDNA真核表达质粒，并能在HepG2真核细胞中表达。     

DNA微点阵分析丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对信号传导相关基因表达的影响

目的 采用DNA微点阵（DNA microarray）技术检测致癌相关基因的表达水平，研究丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）非结构蛋白NS4B在HCV致癌中的作用。方法 通过建立稳定表达NS4B的细胞系，用微点阵技术研究NS4B对细胞基因表达的影响，实时定量RT—PCR分析微点阵结果中的两个上调基因（DKK1，FYN）和两个下调基因（AKR1C1，v—fos）的表达，对细胞中AKR1C1的活性进行酶学分析。结果 在2308个信号途径相关的基因中，34个基因表达上调，56个基因表达下调。在表达有明显差异的基因中，大部分原癌基因表达上调，而大部分抑癌基因的表达下调；一些基因与细胞压力有关。实时定量RT—PCR和AKR1C1的酶学分析进一步证实了DNA微点阵的结果。结论 HCV—NS4B在HCV的致癌过程中起一定作用。     

应用基因芯片技术对系统性红斑狼疮患者外周血基因表达谱的初步研究

目的 研究系统性红斑狼疮（SLE）患者与正常对照外周血的基因表达谱的改变，以探讨SLE发病机制，诊断及鉴别诊断，以及基因功能的研究。方法 首先从外周血提取总RNA，反转录合成单链，双链cDNA后，体外转录合成生物素标记的cRNA与基因芯片进行杂交，再通过抗原抗体反应机制标记上荧光染料Cy3后，使用芯片扫描仪进行图像扫描。使用分析软件进行表达差异和聚类分析。结果 在3000多个基因点中，与正常对照相比较，鉴定出94个基因存在表达差异相关基因，其中有33个基因表达上调，61个基因表达下调。这些表达差异基因有细胞因子及受体，转录相关基因，凋亡相关基因，生长分化相关基因，信号转导相关基因，细胞周期相关基因，电子传递和氧化相关基因，转移酶相关, 酶相关基因等。聚类分析结果显示不同的疾病以及不同临床表面的同一疾病其外周血的基因表达谱是有差异的，可以用于疾病的诊断和鉴别诊断。基因聚类发现，根据表达谱聚类在一起的基因存在功能上的相似性，可以用来发现已知基因的免疫相关功能。结论 该基因芯片技术方法有较高的重复性和稳定性，能有效地进行SLE致病基因的筛选，更好地理解SLE发生的分子机制，诊断及鉴别诊断，以及基因功能的研究。