表达SARS冠状病毒受体人ACE2转基因小鼠的建立

目的:建立表达SARS冠状病毒的功能性受体人ACE2的转基因小鼠.方法:克隆人2型血管紧张素转换酶(hACE2)的cDNA,连入PCAGGS构建转基因表达载体,以显微注射的方法将5.6 kb的转基因片段引入小鼠的受精卵.采用PCR、Southern印迹、RT-PCR、Western印迹、免疫荧光染色的方法对转基因小鼠进行鉴定.结果与结论:获得了在小鼠肺组织中表达有SARS病毒功能性受体hACE2的两个转基因小鼠系,证明了SARS病毒的S蛋白能很好地和转基因小鼠肺组织中表达的hACE2受体结合,这将为SARS的研究提供一种良好的感染动物模型.     

黑色素瘤抗原MAGE-3基因的原核表达

肿瘤抗原基因的克隆、测序和表达是研究肿瘤免疫治疗性疫苗的基础.本研究采用Oligo V6.0基因分析软件,对人黑色素瘤抗原MAGE-3基因序列进行分析后设计引物,扩增和克隆MAGE-3基因片段(210 ～623位碱基),在大肠杆菌中诱导其表达,以期为制备MAGE-3抗体和肿瘤疫苗奠定基础.     

人降钙素基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：利用大肠杆菌表达具有生物活性的人降钙素（ｈＣＴ）。方法：以人类基因组ＤＮＡ，为模板，经ＰＣＲ扩增获取ｈＣＴ基因片段，测序分析克隆到ｐＵＣ１９载体中的ＰＣＲ产物，确定得到两种ＣＴ基因序列，其中１＾＃与文献报道完全一致，２＾＃序列中含有（Ｇ６４／Ａ）点突变，采用带有热诱导启动子的高效表达载体ｐＢＶ２２０，对所获得的基因进行了表达，并利用大鼠降血钙实验，对表达产物的活性进行了检测。结果：所获得的ｒ     

人MEPE基因稳定表达细胞系的建立及MEPE蛋白在DNA损伤应答中的功能初探

目的构建人MEPE基因真核表达载体,稳定转染人胚肾293T细胞,并建立稳定表达细胞株;初步探讨人MEPE蛋白在DNA损伤应答中的作用。方法将人MEPEcDNA克隆至带有HA标签的真核表达载体pREP10上,构建重组质粒;分别将载体pREP10/MEPE-HA和pREP10/HA转染293T细胞;经潮霉素B加压筛选阳性克隆;用RT-PCR和免疫印迹方法分别在RNA水平和蛋白水平鉴定稳定表达MEPE-HA融合蛋白的阳性细胞株;利用一定浓度的DNA损伤诱导剂喜树碱（camptothecin,CPT）处理细胞,通过MTT比色法检测不同时间点细胞存活率的变化,其趋势即可反映出不同细胞株对DNA损伤诱导剂的敏感性。结果经酶切鉴定及序列分析,人MEPE基因真核表达载体pREP10/MEPE-HA构建正确,转染人293T细胞,筛选出MEPE表达较高的细胞株,并且发现该基因的高表达可以使细胞对DNA损伤诱导剂的耐受性提高。结论成功建立了稳定表达人MEPE的293T细胞株,并对人MEPE蛋白在细胞中对DNA损伤诱导剂敏感性的影响进行了初步探讨,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础。     

稳定,高效表达血小板生成素的真核细胞株的构建

目的：血小板生成素（ＴＰＯ）在治疗血小板减少症方面具有潜在的应用前景，为构建体外稳定表达ＴＰＯ的真核细胞株，进行了ＴＰＯ的稳定表达研究。方法：采用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，从水囊引产的胎儿肝组织中得到ＴＰＯ ｃＤＮＡ并进行表达。结果：经过序列分析证明获得了没有错义突变的ＴＰＯ全长ｃＤＮＡ（约１ｋｂ）。在此基础上构建的ＴＰＯ的真核表达质粒在ＣＯＳ－７细胞中瞬时表达的产物能够维持并刺激ＴＰＯ     

X射线照射诱导小鼠junB基因的表达

目的探讨整体照射和不同剂量X射线离体照射后小鼠脾细胞和白血病细胞junB基因的表达。方法3Gvx射线小鼠全身照射及不同剂量X射线照射离体脾细胞和白血病细胞，提取RNA，Northern杂交，定量分析junB mRNA。结果3Gyx射线全身照射后，小鼠脾细胞junB基因增强明显并迅速，C3H／He小鼠30min达高峰，BALB／c小鼠60min达高峰；不同剂量X射线照射离体脾细胞和白血病细胞后，junB基因也迅速被诱导，30～60min达峰值，240min逐渐降回假照组水平。结论junB基因是一个辐射敏感基因，照射后立即表达，有可能在信号传递中起重要作用。     

心脏组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

目的：建立在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。方法：构建了心肌细胞特异性表达Cre重组酶的转基因载体。该载体通过显微注射被导入小鼠受精卵中，通过胚胎移植，获得转基因首建者小鼠。利用PCR检测子代小鼠Cre重组酶整合情况。通过Northern杂交检测Cre重组酶表达的组织特异性。结果：构建了含有心肌细胞特异性α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体α-MHC—Cre—hGH。将转基因载体进行显微注射，共注射了215枚小鼠受精卵，其中202枚移植入13只假孕母鼠的输卵管中发育，获得子代小鼠42只。PCR检测发现有1只小鼠在其基因组上整合有Cre重组酶基因。Northem杂交检测结果显示该转基因小鼠只在心脏组织中特异性地表达Cre重组酶基因。结论：成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠，为利用条件基因打靶技术研究基因在心脏发育与相关疾病中的功能提供了有利的工具。     

我国登革2型病毒株NS1基因的克隆与表达

目的：通过对登革病毒ＮＳ１基因的表达,研究表达的ＮＳ１蛋白的抗原性,为研制新型登革疫苗提供依据。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术将扩增的ＮＳ１基因插入到ｐＢＶ２２０载体中,通过温控诱导进行外源蛋白的表达,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果：获得正向插入的ＮＳ１－ｐＢＶ２２０重组质普,表达产物的相对分子质量约为５１０００,与预期大小一致,并且可与登革２型     

小鼠外周血白细胞节律基因bmal1、clock、cry1、per1表达的近日节律性研究

目的 探讨12 h光照、12h黑暗交替（12 h-light and 12 h-dark cycle,12L/12D）光制条件下,小鼠外周血白细胞中4种节律基因bmal1、clock、cry1、per1近日节律性的表达特点. 方法 将48只雄性C57/BL6小鼠在12L/12D光制条件下饲养4周后,按随机数字表法分为6组,每组8只.分别在6个时相点（9：00、13：00、17：00、21：00、1：00、5：00）取外周血并分离白细胞.抽提总RNA,利用实时聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）方法检测小鼠外周血白细胞中bmal1、clock、cry1、per1 4种节律基因的mRNA水平.用余弦函数作曲线拟合,获取节律参数.并经one-ANOVA分析比较基因表达峰值和谷值的差异. 结果 在明暗交替光制条件下,bmal1、clock、cry1、per1 4种基因存在明显的近日节律性,各基因表达的峰值明显高于谷值（P＜0.01）.利用拟合方程预测的clock表达峰值相位时间在5：00左右,雨bmal1、cry1、per1基因表达的峰值时间在13：00-15：00左右.clock表达的峰值时间比bmal1超前,峰值及振幅也比bmal1高（P＜0.01）;而cry1和per1表达的峰值时间、峰值大小比较接近. 结论 C57/BL6小鼠外周血白细胞bmal1、clock、cry1、per1基因表达存在明显的近日节律性.clock在正反馈中的作用强于bmal1,而cry1、per1在负反馈中的作用相似.     

人黑色素浓集激素1型受体真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人黑色素浓集激素1型受体(MCHR1)真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR1的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR1功能奠定了良好的实验基础.     

人MCHR2基因shRNA真核表达载体构建及鉴定

目的 构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响.方法 根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中,观察其在mRNA和蛋白水平对MCHR2的影响.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞株中.四条shRNA真核表达载体在mRNA水平对MCHR2抑制率分别为54.9%、66.4%、56.9%、45.8%;在蛋白水平对MCHR2抑制率分别为62.0%、81.0%、73.3%、44.2%.结论 针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的基础.     

稳定表达TAT融合蛋白的哺乳动物细胞系的建立

目的 建立能够稳定分泌表达TAT融合蛋白的哺乳动物细胞系.方法 依次将合成的编码TAT蛋白转导域和EGFP的DNA片段插入分泌型真核表达载体pSecTag2A,构建编码TAT-EGFP融合蛋白的重组质粒,转染Vero细胞后,经Zeocin筛选建系,通过荧光显微镜和免疫印迹鉴定表达的蛋白,MTT分析细胞毒性,荧光观察蛋白转导活性.结果 成功获得了稳定分泌表达TAT-EGFP融合蛋白的工程细胞系,表达的TAT融合蛋白具有良好的蛋白转导活性.结论 建立的哺乳动物细胞表达系统能够持续产生具有蛋白转导活性的TAT融合蛋白,为相关应用研究奠定了基础.     

表达人HER2/neu及荧光素酶的小鼠乳腺癌模型的建立

目的建立表达HER2/neu表皮生长因子受体及萤火虫荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞模型。方法将重组人HER2/neu原癌基因真核表达载体与荧光素酶报告基因依次转染小鼠乳腺癌4T1细胞系,用G418与潮霉素加压筛选阳性克隆,Western印迹及活体成像技术鉴定HER2/neu和荧光素酶在4T1细胞中的表达。在BALB/c小鼠前肢乳腺皮下注射该细胞1.5×106个,活体成像观察肿瘤的生长及转移。结果与结论经过两步转染获得抗G418及潮霉素4T1细胞,Western印迹结果显示,该细胞高表达HER2/neu。流式细胞术检测结果提示几乎所有细胞均有GFP的表达。用该细胞株接种小鼠后具有与野生型4T1细胞相似的成瘤性和转移能力。实验结果提示,我们已建立可表达HER2/neu表皮生长因子受体及荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞株,为乳腺癌的研究提供一个良好的模型。     

表达人HER2/neu及荧光素酶的小鼠乳腺癌模型的建立

目的建立表达HER2/neu表皮生长因子受体及萤火虫荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞模型。方法将重组人HER2/neu原癌基因真核表达载体与荧光素酶报告基因依次转染小鼠乳腺癌4T1细胞系,用G418与潮霉素加压筛选阳性克隆,Western印迹及活体成像技术鉴定HER2/neu和荧光素酶在4T1细胞中的表达。在BALB/c小鼠前肢乳腺皮下注射该细胞1.5×106个,活体成像观察肿瘤的生长及转移。结果与结论经过两步转染获得抗G418及潮霉素4T1细胞,Western印迹结果显示,该细胞高表达HER2/neu。流式细胞术检测结果提示几乎所有细胞均有GFP的表达。用该细胞株接种小鼠后具有与野生型4T1细胞相似的成瘤性和转移能力。实验结果提示,我们已建立可表达HER2/neu表皮生长因子受体及荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞株,为乳腺癌的研究提供一个良好的模型。     

Cre重组酶调控的OVA-HBsAg转基因乙肝模型小鼠的制备及鉴定

目的 制备Cre重组酶调控的卵清蛋白(OVA)-HBsAg转基因小鼠,为乙肝的防治提供更好的动物模型.方法 采用原核显微注射方法将线性化的携带OVA-HBsAg基因并带有LoxP位点的质粒注入C57BL/6J×DBA小鼠受精卵的雄原核内,制备受Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与本室饲育的Alb-Cre转基因阳性公鼠进行杂交,获得子代小鼠,观察Cre对OVA-HBsAg转基因小鼠HBsAg的诱导表达情况.采用PCR、ELISA和免疫组化方法检测HBsAg基因、Cre基因在转基因小鼠体内的整合及表达情况.结果 共注射受精卵491枚,成活337枚,成活率68.6％.产下F0代小鼠29只,其中PCR阳性4只,外源基因整合率13.8％.目前已传至F4代,F1-F4代PCR阳性率分别为27.5％、32.0％、22.9％、25.0％,ELISA法未检测到血清中HBsAg表达.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与Alb-Cre阳性公鼠杂交,获得16只子代小鼠,PCR检测Cre基因和HBsAg基因双阳性的子代小鼠有6只,其中2只小鼠血清HBsAg检测为阳性,诱导表达阳性率为33.3％.结论 成功制备出OVA-HBsA转基因小鼠,且可稳定传代,Cre重组酶可以诱导小鼠体内HBsAg的表达.     

arresten cDNA在人胃癌细胞SGC-7901中的表达及活性鉴定

目的：构建arresten cDNA的分泌型真核表达载体，将其转染人胃癌SGC-7901细胞，探讨arresten体外抑制血管内皮细胞生长的活性。方法：利用PCR法将小鼠Igκ链信号序列的60个碱基拼接至arresten cDNA的氨基端，并克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )，然后以脂质体法将重组pcDNA3．1( )-arresten转染SGC-7901细胞，Western印迹检测arresten的分泌表达，最后，提取SGC-7901细胞培养上清，采用内皮细胞增殖抑制试验鉴定上清中arresten活性。结果：成功构建了arresten cDNA的分泌型真核表达载体，获得可表达arresten的SGC-7901细胞系，真核表达的arresten具有抑制血管内皮细胞增殖的活性。结论：arresten是一种有效的血管生成抑制剂，其cDNA的真核表达载体的成功构建为针对人类胃癌的arresten抗血管基因治疗研究奠定基础。     

外源性WAF1-S基因表达对喉癌细胞生长的作用

目的 探索WA1F-S基因在喉癌细胞内表达的作用,为喉癌的基因治疗提供理论依据。方法 采用亚克隆技术,构建WAF1-S真核表达载体pcDNA3-WAF1-S。利用lipofectamine介导,将外源野生型WAF1-S基因导入喉癌细胞系Hep-2,筛选阳性克隆,采用打点杂交技术观察WAF1-S基因mRNA在喉癌细胞中的表达,用Western blot及激光共聚焦方法定量分析WAF1-S基因的蛋白表达产物,MTT及流式细胞仪检测Hep-2细胞的生长状态。同时以空载体质粒pcDNA3为对照,分析WAF1基因对喉癌细胞生长的影响。结果 打点杂交证实转染WAF1-S基因的Hep-2细胞有外源WAF1-S基因的表达,外源基因WAF1-S在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。转染后喉癌细胞中WAF1-S的蛋白表达明显高于对照组。流式细胞仪计数证实WAF1-S能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 导入外源野生型WAF1-S基因可抑制喉癌细胞生长。     

慢性髓细胞白血病相关蛋白CMLAP的基因克隆化研究

目的了解慢性髓细胞白血病(CML)基因表达谱的规律,并对在CML中特异性高表达的一个新基因进行克隆、分析与鉴定。方法应用基因表达谱芯片技术,比较CML患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)基因的表达差异。检索核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt),对差异表达的基因进行生物信息学分析,与已知功能基因序列进行同源性比较。根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因序列,据此设计并合成该基因序列的特异性引物,提取CMLPBMC的总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果在CML患者PBMC中克隆一个新的基因,经测序证实,其编码序列全长为1872个核苷酸(nt),编码产物由624个氨基酸残基(aa)组成,命名为CMLAP。在GenBank中注册,注册号为AY762229。结论基因表达谱芯片技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了在CML中高表达的新基因CMLAP,为进一步研究CML发生发展的分子生物学机制奠定基础。