Bcl—2和caspase—3在创伤性脑损伤后细胞凋亡中的作用

Bcl-2和caspase-3分别是Bcl-2基因族和caspase-3基因族中具有代表性的基因，它们参与对细胞凋亡的调控．研究表明创伤性脑损伤后存在细胞凋亡及凋亡相关基因的表达．从基因水平探讨创伤性脑损伤后细胞调亡调控机制是近年研究的一个热点．本文仅综述Bcl-2和caspase-3基因在创伤性脑损伤研究中的最新进展．     

四环素调控表达的反义bcl-2对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC生长和凋亡的作用

目的 研究由四环素调控的反义bcl-2的表达对人神经母细胞瘤细胞系SK－N－MC细胞的生长和凋亡的作用并初步探讨其相关机制。方法 非定向克隆构建携带反义bcl-2 cDNA片段的由四环素调控表达的真核细胞表达载体PUCCOMB1^CMV/Asbcl-2;应用脂质体Lipofectamine^TM介导转染SK－N－MC细胞,同时以空载体转染细胞作为对照。MTT法研究细胞的生长和增殖状况,提取DNA梯带和应用流式细胞术检测凋亡细胞。逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）研究细胞凋亡中bcl-xL/bcl-xS基因在mRNA水平上表达的变化。Western杂交检测bcl-2及其上下游相关基因caspase-3、PARP的变化。结果 转染反义bcl-2的细胞生长增殖缓慢,在去血清培养的相同的时间内其凋亡细胞数也明显多于对照组细胞,提前出现DNA梯带。在细胞的凋亡过程中检测到非活性caspase-3酶原蛋白减少并检测到bcl-2、PARP蛋白的降解产物条带。但bcl-xL/bcl-xS基因在mRNA水平上表达无明显变化。结论 反义bcl-2 mRNA可抑制SK－N－MC细胞的生长和增殖,促进去血清培养所诱导的SK－N－MC细胞的凋亡。大细胞凋亡过程中caspase-3被激活,bcl-2和PARP蛋白被裂解,但bcl-xL/bcl-xS在反义bcl-2 mRNA诱导的SK－N－MC细胞的凋亡过程中无变化。     

大鼠创伤性脑损伤后海马细胞凋亡及bcl-2、NGF-R阳性细胞的变化

目的：探讨大鼠创伤性脑损伤后不同时相海马细胞凋亡及。bcl-2、NGF—R阳性细胞的变化规律。方法：采用大鼠自由落体脑损伤模型，伤后1、2、3、4、5、7、10d取脑切片，作：Nissl染色，用TUNEL法检测细胞凋亡，免疫组化染色观察bcl-2、NGF-R阳性细胞。结果：Nissl染色可见损伤侧海马CA2、CA3区锥体细胞层细胞消失或排列紊乱。损伤侧海马凋亡细胞伤后5d达到高峰，正常侧海马各时相点均未见到凋亡细胞。损伤侧海马bcl-2阳性细胞数量下降，伤后3d至最低点；NGF—R阳性细胞数量增加，伤后5d达到高峰。结论：大鼠创伤性脑损伤后损伤侧海马细胞凋亡数量的变化与伤后时程有关。伤后细胞bcl-2表达下降、NGF-R表达增加是导致细胞凋亡的因素。     

肿瘤抑制因子RUNX3对人胃癌细胞中凋亡相关基因表达的影响

 目的：研究肿瘤抑制因子人类Runt相关转录因子3(RUNX3)对人胃癌细胞BGC823中凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病基因-2（bcl-2）、bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（caspase-8）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）表达的影响,以揭示RUNX3促进胃癌细胞凋亡的作用机制。方法：首先构建人Runx3的真核生物表达载体pcDNA3.1- Runx3,将pcDNA3.1-Runx3及空载体pcDNA3.1分别转染BGC823细胞48 h后,提取细胞的总RNA和蛋白质,应用逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)和蛋白免疫印迹（Western blotting）分别检测转染不同载体的细胞内RUNX3的表达情况,然后用RT-PCR和Western blotting检测凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达及蛋白的表达,β-actin作为内对照。结果：我们成功构建了人Runx3的真核生物表达载体pcDNA3.1-Runx3,将其转染BGC823细胞后,RT-PCR和Western blotting结果均显示：转染pcDNA3.1-Runx3的细胞中RUNX3的表达水平明显高于转染空载体pcDNA3.1的细胞(P<0.05);转染pcDNA3.1-Runx3的细胞中bcl-2基因的表达水平明显降低,caspase-3、caspase-9基因的表达水平明显增加(P<0.05)。结论：在BGC823细胞中,RUNX3通过下调bcl-2,上调caspase-3、caspase-9的表达促进细胞的凋亡。     

白毛藤多糖抑制人食管癌细胞增殖作用的研究

目的:探讨白毛藤多糖对人食管癌细胞的生长抑制作用。方法:将不同浓度白毛藤多糖作用Ec-9706细胞后,用MTT法检测细胞增殖抑制率,荧光显微镜检测细胞凋亡情况,RT-PCR法检测bcl-2、caspase-3基因表达量的变化。结果:不同浓度白毛藤多糖对Ec-9706细胞的增殖有明显抑制作用,并可诱导Ec-9706细胞凋亡,抑制Ec-9706细胞bcl-2表达,上调caspase-3表达。结论:白毛藤多糖抑制Ec-9706细胞增殖,促进凋亡,其机制可能与激活caspase-3、抑制bcl-2表达有关。     

NKX3.1下调前列腺癌PC-3细胞中抗凋亡基因 bcl-2 的表达

目的: 研究前列腺特异转录因子NKX3.1对 bcl-2 基因表达以及前列腺癌细胞凋亡的影响。方法: 转染pcDNA3.1- NKX3.1 于前列腺癌PC-3细胞中,得到瞬时转染NKX3.1的PC-3细胞,通过RT-PCR和Western blotting方法研究NKX3.1对 bcl-2 基因的表达的影响,并通过EMSA技术,研究NKX3.1诱导 bcl-2 基因下调的分子机制;进一步通过流式细胞术、凋亡小体染色等方法研究NKX3.1对细胞凋亡的影响。结果: NKX3.1可明显下调PC-3细胞中 bcl-2 mRNA及Bcl-2蛋白的表达;EMSA结果证明NKX3.1可与 bcl-2 基因上游调控区中的NKX3.1结合元件相互作用;流式细胞术结果显示,PC-3细胞转染NKX3.1后,细胞凋亡数增加了1.41倍;用Hoechst 33258细胞染色发现NKX3.1可使PC-3细胞凋亡小体数量明显增加。结论: NKX3.1可下调抗凋亡基因 bcl-2 的表达,促进前列腺癌细胞凋亡。     

急性白血病bcl-2表达及与耐药的关系

t(14;18)染色体易位产生融合基因bcl-2/IgH,bcl-2高表达可阻抑细胞凋亡的发生,bax可拮抗bcl-2的抗凋亡效应,起着加速细胞凋亡的作用.bcl-2和bax基因的紊乱是AL(急性白血病)形成与发展的原因之一.这些细胞凋亡调控基因不仅参与了白血病的形成,还与白血病的某些临床特征、疗效及预后因素密切相关.在治疗bcl-2相关肿瘤时,若能联合使用bcl-2反义核酸和其它诱导细胞死亡制剂,可使肿瘤细胞对后者的敏感性增加,从而提高治疗效果.     

Lactobacillus rhamnosus ATCC53103 和Escherichia coli ATCC8739 对结直肠癌细胞CT26 增殖及凋亡的影响

目的:探究Lactobacillus rhamnosus ATCC53103、Escherichia coli ATCC8739 对CT26 细胞增殖、迁移及凋亡的影响。方法:以CT26 细胞为研究对象,1 ‘100 加入L.rhamnosus ATCC53103 与E.coli ATCC8739,定植培养一定时间后,分别采用台盼蓝染色法、划痕法、流式细胞仪检测细胞的增殖、迁移以及凋亡,采用RT-PCR 与Western blot 方法检测凋亡基因Caspase-3、caspase-9、bcl-2、bax、fas 的转录水平与表达情况。结果:L.rhamnosus ATCC53103 和E.coli ATCC8739 对CT26 细胞的增殖与迁移有抑制作用,并促进CT26 细胞的凋亡。两者相比较,L.rhamnosus ATCC53103 的作用更为缓和。经RT-PCR 和Western blot 检测发现,L.rhamnosus ATCC53103 使得CT26 细胞凋亡基因caspase-3、caspase-9 的表达上调,而E.coli 使得CT26细胞凋亡基因caspase-3 表达下调。结论:L.rhamnosus ATCC53103 和E.coli ATCC8739 能抑制CT26 细胞的增殖、迁移,促进细胞的凋亡,L.rhamnosus ATCC53103 可能通过线粒体相关途径使细胞发生凋亡;而E.coli ATCC8739 则不是通过caspase-3 执行细胞的凋亡作用。     

白藜芦醇诱导KG-1细胞凋亡作用机制的初步研究

通过观察白藜芦醇诱导人急性白血病细胞株KG-1凋亡的作用,检测bcl-2、caspase-3的表达,探讨白藜芦醇诱导白血病细胞凋亡的作用机制。采用噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长状态;瑞-吉染色、透射电镜观察KG-1细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡与周期分布;半定量RT-PCR检测bcl-2 mRNA、caspase-3 mRNA表达水平。结果显示白藜芦醇可明显抑制KG-1细胞增殖(P<0.01),与对照组相比,实验组使细胞发生S期阻滞(P<0.01),促进细胞凋亡(P<0.01),使bcl-2的表达下调,上调caspase-3的表达(P<0.05)。结论:白藜芦醇能诱导KG-1细胞凋亡,其机制可能与下调bcl-2、上调caspase-3表达水平有关。     

C-反应蛋白诱导人肾小管上皮细胞凋亡

目的:探讨与微炎症状态相应的C-反应蛋白(CRP)水平是否诱导肾小管上皮细胞凋亡。方法:以微炎症状态相应的CRP浓度刺激HK-2细胞。采用AnnexinⅤ-FITC、PI染色和流式细胞术检测凋亡细胞的百分率。采用Hoechst 33258染色观察肾小管上皮细胞凋亡的形态学改变。比色法检测细胞caspase-3活性。Real-time PCR检测促凋亡基因bax、抗凋亡基因bcl-2的mRNA表达。结果:CRP呈剂量和时间依赖性地诱导HK-2细胞凋亡,细胞凋亡在CRP浓度为10 mg/L时达高峰,在20 mg/L时则以晚期凋亡和坏死为主。Hoechst 33258细胞核染色显示CRP作用的HK-2细胞呈现染色质浓缩、碎裂或染色质边集等细胞凋亡的特点。CRP增高细胞caspase-3的酶活性、上调促凋亡基因bax的表达和下调抗凋亡基因bcl-2的表达。结论:CRP轻度增高可诱导肾小管上皮细胞凋亡。     

慢病毒介导的caspase-3沉默对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响

 目的：探讨沉默caspase-3对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法：构建靶向caspase-3的shRNA重组慢病毒并转染MSCs,通过real-time PCR和Western blotting 在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果。采用MTS法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期。Real-time PCR检测bcl-2和bax mRNA的表达。Hoechst荧光染色法检测细胞的凋亡情况。结果：Real-time PCR和Western blotting结果均表明成功建立稳定转染shRNA-caspase-3的大鼠MSCs细胞株。沉默caspase-3使MSCs的增殖率明显提高（P＜0.05）,且S期细胞百分比明显增多,为（52.66±0.30）%。沉默caspase-3后bcl-2 mRNA表达上调,bax mRNA表达下调,bcl-2/bax比值升高（P＜0.05）。转染组的细胞凋亡率为（15.01±1.73）%,低于空载体组的（25.67±3.05）%和空白对照组的（23.67±1.16）%（P＜0.05）。结论: 沉默caspase-3能调控MSCs的细胞周期,促进细胞增殖,减少细胞凋亡。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后bcl-2、bax表达和细胞凋亡

目的观察大鼠大脑中动脉重度栓塞后再灌注动物的脑细胞凋亡及其相关调控基因bcl-2和bax阳性蛋白质表达的变化;方法采用插线法制作大鼠大脑中动脉栓塞后再灌注模型,并观察脑缺血/再注不同时点大鼠脑细胞凋亡(TUMEL法)、凋亡相关调控基因bcl-2、bax(S-P免疫组化法)的阳性表达和脑组织含水量(Hallenbeck法)、脑梗塞体积(Nedergaard法)的变化.结果大鼠大脑中动脉栓塞3h、栓塞3h/再灌注24、48h时,细胞凋亡逐步加重,损伤加重,bcl-2、bax表达增强.     

二苯乙烯苷对同型半胱氨酸诱导血管内皮细胞凋亡及bcl-2、bax、caspase-3表达的影响

 目的：研究何首乌二苯乙烯苷（TSG）对同型半胱氨酸（Hcy）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡及bcl-2、bax和caspase-3 mRNA表达的影响。方法：建立Hcy （3 mmol/L）所致培养HUVECs核损伤模型,TSG（1和10 μmol/L）提前2 h预孵育,然后再以Hcy处理,作为TSG保护组。用Hoechst 33342核染色法观察HUVECs细胞核损伤状态,以流式细胞术检测细胞凋亡情况,用实时荧光定量RT-PCR法检bcl-2、bax和caspase-3 mRNA的表达。结果：经3 mmol/L Hcy处理后,与正常培养的细胞相比,HUVECs核损伤加重,凋亡细胞比例升高,bcl-2表达降低（P＜0.01）,bax和caspase-3表达增加（P＜0.01）。TSG 1 μmol/L和10 μmol/L预孵育后再经3 mmol/L Hcy处理,与单经3 mmol/L Hcy损伤模型组相比,HUVECs细胞核损伤降低,凋亡率下降,bcl-2的表达增加（P＜0.05）,bax和caspase-3表达降低（P＜0.05）。结论：TSG具有降低Hcy所致HUVECs的细胞损伤和抑制凋亡的作用,其机制可能与影响bcl-2、bax和caspase-3的表达有关。     

龙牙楤木多糖诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡机制研究

目的:探讨龙牙楤木多糖(AEPS)对体外培养人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:荧光显微镜观察细胞形态学变化,流式细胞术(FCM)检测SMMC-7721细胞的凋亡率;Western blot检测不同浓度AEPS作用36小时凋亡蛋白survivin、caspase-3及bcl-2的表达情况。结果:与对照组比较,AEPS不同浓度剂量组Hoechst33258/PI荧光染色出现典型的凋亡形态学改变;FCM检测表明SMMC-7721细胞凋亡率各实验组均明显高于对照组(P0.01),且呈时间剂量依赖性;Western blot显示与对照组相比,各实验组AEPS可显著下调SMMC-7721细胞survivin和bcl-2的表达(P0.01),而caspase-3的表达显著增加(P0.01)。结论:AEPS能明显诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡,其机制可能与改变凋亡相关基因survivin、caspase-3及bcl-2的表达有关。     

硼替佐米上调fas、bcl2l12、caspase-9和caspase-3基因表达

目的： 探讨硼替佐米诱导慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞凋亡及新基因bcl2l12在其中的作用。方法: MTT比色法观察硼替佐米对K562细胞的生长抑制作用;Annexin-V标记和线粒体跨膜电位（Δψm）分析细胞凋亡;RT-PCR方法检测0、6、12和24 h fas、bcl2l12、bcl-2、 bim、bax、caspase-3和caspase-9基因表达变化。结果: 硼替佐米抑制K562细胞生长呈时间和剂量依赖性,24 h和48 h半数抑制浓度分别为161.41 nmol/L和96.33 nmol/L;硼替佐米诱导K562细胞凋亡,12 h Annexin-V阳性细胞就开始增高,并呈时间依赖性,Δψm减低;RT-PCR显示fas、bcl2l12、caspase-3和caspase-9表达增高,但bcl-2、bim和bax表达无明显改变。结论: 硼替佐米可以抑制K562生长并诱导凋亡,上调fas、bcl2l12,使线粒体膜电位下降,激活caspase-9和caspase-3基因,促使DNA发生断裂可能是其诱导凋亡的机制之一。     

caspase-3、bcl-2蛋白在非霍奇金淋巴瘤组织的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系

目的探讨caspase-3、bcl-2蛋白在非霍奇金淋巴瘤(NHL)发生、发展中的可能作用及相互关系.方法应用TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术和免疫组织化学链霉素抗生物素-过氧化酶(SP)法,检测5例反应性增生淋巴组织和119例NHL组织中的细胞凋亡和增殖细胞核抗原(PCNA)、caspase-3、bcl-2蛋白的表达水平.结果 caspase-3和bcl-2在119例NHL中表达的阳性率分别为86.6%(103例)和53.8%(64例).二者在良、恶性淋巴组织中的表达方式相反在反应性增生淋巴滤泡中心caspase-3高表达而bcl-2阴性表达,滤泡套区caspase-3阴性表达而bcl-2高表达;在肿瘤性滤泡中心bcl-2常高表达而caspase-3常表达减弱或不表达;在NHL中二者的表达与肿瘤恶性度呈相反关系,高度恶性组中caspase-3的表达(44.4%)高于低度恶性组(23.7%,P<0.01),而B细胞性淋巴瘤中bcl-2的表达(42.6%)低于低度恶性组(75.5%,P<0.01);caspase-3的表达与凋亡指数呈正相关(r=0.512, P <0.01)),bcl-2的表达与凋亡指数呈负相关(r=-0.436, P<0.01).此外,NHL的凋亡指数与增殖指数呈显著正相关(r=0.710, P<0.01).结论 caspase-3可能参与了NHL的凋亡调节机制.caspase-3和bcl-2蛋白在良、恶性淋巴组织中常呈现相反的表达方式,提示二者在淋巴细胞增殖动力学调节中可能存在着密切联系.     

硼替佐米上调fas、bcl2112、caspase-9和caspase-3基因表达

目的：探讨硼替佐米诱导慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞凋亡及新基因bcl2H2在其中的作用。方法：MTT比色法观察硼替佐米对K562细胞的生长抑制作用;Annexin—V标记和线粒体跨膜电位（△ψm）分析细胞凋亡;RT—PCR方法检测0、6、12和24h fas、bcl2112、bcl-2、bim、bax、caspase-3和caspase-9基因表达变化。结果：硼替佐米抑制K562细胞生长呈时间和剂量依赖性,24h和48h半数抑制浓度分别为161．41nmol／L和96．33nmol／L;硼替佐米诱导K562细胞凋亡,12hAnnexin—V阳性细胞就开始增高,并呈时间依赖性,AtOm减低;RT—PCR显示fas、bcl2112、caspase-3和caspase-9表达增高,但bcl-2、bim和bax表达无明显改变。结论：硼替佐米可以抑制K562生长并诱导凋亡,上调如、bcl2112,使线粒体膜电位下降,激活caspase-9和caspase-3基因,促使DNA发生断裂可能是其诱导凋亡的机制之一。     

bcl-3基因通过cyclin D1及Bax蛋白影响人结肠癌RKO细胞的凋亡

目的:研究bcl-3基因对人结肠癌RKO细胞迁移及凋亡的影响及机制。方法:采用人bcl-3基因的RNA干扰慢病毒载体沉默人结肠癌RKO细胞bcl-3基因的表达后,划痕实验观察bcl-3基因沉默前后RKO细胞迁移能力的变化,Annexin V/PI双染色法检测bcl-3基因沉默前后RKO细胞凋亡率的变化,Western blot法检测bcl-3基因沉默前后细胞周期蛋白cyclin D1及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的变化。结果:划痕实验显示,划痕后36 h,bcl-3基因沉默前后RKO细胞划痕愈合率分别为84.00%及40.00%,差异具有统计学意义(P0.05)。Annexin V/PI双染色法流式细胞术分析显示,bcl-3基因沉默前后的RKO细胞均经5μmol/L顺铂处理24 h后,沉默前后的RKO细胞凋亡率分别为12.89%及59.67%,差异具有统计学意义(P0.05)。Western blot法检测显示bcl-3基因沉默后cyclin D1蛋白表达显著下降(P0.05),Bax蛋白表达显著上升(P0.05),但Bcl-2表达无明显变化(P0.05)。结论:沉默bcl-3基因后,RKO细胞迁移能力下降,凋亡率增加,并伴细胞周期蛋白cyclin D1及凋亡相关蛋白Bax表达的变化。bcl-3基因可能通过改变cyclin D1及Bax蛋白的表达而影响RKO细胞的凋亡。     

二十碳五烯酸联合视黄酸对HL-60细胞凋亡相关基因表达的影响

目的 研究二十碳五烯酸(EPA)是否协同视黄酸(RA)影响HL-60细胞的凋亡及相应分子机制。方法 流式细胞仪(FCM)检测细胞周期相分布以测定细胞增殖和凋亡功能；Western blot法分析bcl-2和caspase—3表达。结果 与单独应用相比，EPA和RA联合应用可增强HL-60细胞的调亡效应，以及下调节bcl—2和增强caspase-3基因表达。结论 EPA和RA联合应用对HL-60细胞凋亡的增强效应，可能与它们增强caspase-3和降低bcl—2基因表达相关。     

白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡通路的探究

目的：探讨白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡的通路。方法：经小鼠尾静脉注射白色念珠菌后，用ELISA检测小鼠血清TNF-α水平；采用荧光分光光度计检测小鼠胸腺凋亡细胞caspase-3在不同时问组的活性变化；流式细胞仪检测小鼠胸腺细胞hax、p53、bcl-2基因产物水平。结果：TNF-α水平显著升高，caspase-3的活性明显增强，bax、p53基因表达上调。结论：白色念珠菌可能通过刺激机体TNF-α水平升高进而激活caspase-3，同时白色念珠菌上调bax、p53基因表达协同激活caspase-3，从而导致小鼠胸腺细胞凋亡。