疏水作用层析法纯化抗乙肝病毒核心抗原单克隆抗体

目的:采用疏水作用层析法纯化小鼠腹水来源的抗乙肝核心抗原(HBcAg)单克隆抗体(mAb),并对分离条件进行优化。方法:采用不同疏水层析介质、溶液pH和NaCl浓度,研究其对抗体吸附的影响,以及分析不同的洗脱方式和洗脱体积对抗体洗脱的影响,并用ELISA法检测纯化后抗体的活性。结果:疏水作用层析法纯化小鼠腹水来源的抗HB-cAgmAb(IgG1)的最适条件是以pH7.0、20mmol/LPB+1.2mol/L(NH4)2SO4为上样缓冲液,采用1.2～0mol/L(NH4)2SO4,12CV梯度进行洗脱,获得的mAb纯度大于75%,回收率达80%,纯化后mAb的活性保持良好。结论:采用疏水作用层析对mAb进行纯化,并优化了各步实验条件,为建立具有抗体纯度高、生物学活性好、易于放大的抗HBcAg的mAb的纯化方法提供了必要的实验基础。     

盐析与疏水电荷诱导层析相结合快速纯化单克隆抗体

目的:建立一种简便、快速纯化抗体的疏水电荷诱导层析(HCIC)方法。方法:小鼠腹水先经硫酸铵沉淀处理,然后经HCIC后得到单克隆抗体(mAb),纯化的mAb的活性用间接ELISA法测定。同时比较了不同pH洗脱液对mAb纯度的影响。结果:用pH为4.5的洗脱液进行洗脱,获得的mAb纯度大于90%,总的回收率为65%。结论:盐析与HCIC相结合的抗体纯化法,纯度高、生物活性好,适合在基层实验室推广。     

两步串联层析法纯化鼠抗人CD28单克隆抗体2F5

目的建立从小鼠腹水中纯化鼠抗人CD28单克隆抗体(mAb)2F5的两步串联层析法。方法将含mAb2F5的腹水经离心、过滤及缓冲溶液变换预处理后,先经固相化金属螯合亲和层析法(immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)纯化,去除大部分杂蛋白,再经凝胶过滤层析法(gelfiltration,GF)精细纯化,并探讨了上样的流速和洗脱液的种类对mAb2F5纯度的影响。纯化的mAb2F5的生物学活性用3H-TdR掺入法进行分析。结果以两步串联层析法纯化的鼠抗人CD28mAb2F5的纯度大于90%,总回收率达70%。纯化的mAb2F5在体外对PBTC具有明显的促增殖作用;而且其促增殖作用的活性优于ProteinG亲和层析法(affinitychro-matography,AC)纯化所获得mAb。结论建立的两步串联层析纯化方法操作简便,所得mAb的纯度高、生物学活性好。     

一种利用HCIC快速纯化抗rhTF_(243)单克隆抗体方法的研究

目的:建立从小鼠腹水中快速纯化抗人重组组织因子243(recombine human tissue factor243,rhTF243)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的方法。方法:含抗rhTF243单克隆抗体的腹水经离心、过滤及缓冲溶液变换等预处理后,先经疏水电荷诱导层析纯化处理,去除大部分杂蛋白,再经Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析柱进一步纯化。结果:经两步纯化后获得抗rhTF243单克隆抗体,其生物学活性高、纯度大于95%,抗体效价保持良好,抗体总回收率达73%,且具有明显的抗促凝作用。结论:建立的单克隆抗体纯化方法简便、高效,所得mAb的纯度高、生物学活性好。     

阴离子交换层析法纯化gp130单克隆抗体B-S12

目的：建立一种从小鼠腹水中获得高纯度、活性好、纯化过程易于放大的抗gp130单克隆抗体B-S12的纯化方法。方法：经硫酸铵沉淀等预处理后的腹水样品，在阴离子交换层析柱上进行分离纯化，用MTT法检测纯化后抗体的生物学活性。结果：腹水样品经硫酸铵沉淀、PBS复溶，用pH 7．0、20mmol／L Tris—HCl缓冲溶液稀释10倍后上强阴离子交换层析柱，NaCl梯度洗脱，可获得纯度大于95％的B-S12抗体，回收率达73％，在体外对XG-2细胞有明显的促增殖作用。结论：建立了快速高效从小鼠腹水中纯化B-S12的方法，为该抗体的进一步应用提供了必要的实验基础。     

结核分枝杆菌Rv3881c抗原鼠单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗结核分枝杆菌Rv3881c抗原鼠mAb。方法:采用杂交瘤技术,获得了11株针对结核分枝杆菌Rv3881c抗原鼠mAb杂交瘤细胞株,对其中的5株进行了小鼠腹水的制备及相关鉴定。结果:5株mAb的腹水效价达到1∶32 000～1∶512 000,将这5株mAb进行了纯化,纯化后纯度大于90%,抗体亚类(型)均为IgG1/κ型,ELISA结果显示制备的mAb与结核分枝杆菌Rv3881c抗原可发生特异反应。结论:制备了抗结核分枝杆菌Rv3881c抗原鼠mAb,为结核分枝杆菌Rv3881c生物学功能的研究奠定基础。     

125I标记抗MIF单克隆抗体制备及其生物学活性的研究

目的:建立125I标记抗巨噬细胞移动抑制因子(MIF)单克隆抗体(mAb)方法,探讨其在体内外生物学活性.方法:①利用Iodogen法,Na125I标记Anti-mMIF mAb,用Sephadex G-25柱凝胶过滤层析法分离纯化,测定其标记率.纸层析法测定放射化学纯度和稳定性.②采用ELISA和改良MMI鉴定其免疫活性及生物学活性.③观察小鼠体内的生物学分布情况.结果:①标记的最佳条件为Iodogen 40～100μg、抗体20～50μg[Iodogen(m):抗体(m)=2:1],加入Na125I15～30 MBq、室温反应10～15 min,标记率为(90.40 4±3.34)%,放射化学纯度为(97.60±1.14)%,比活度为12.2～26.0 MBq/μg;标记物4℃条件下放置3周后放射化学纯度仍为90.36%.②125I-mMIF mAb能与抗原MIF特异性结合,较好地保持其免疫活性及生物学活性.③体内生物学分布,在肺、肝、脾、肾内具有较高的放射性计数.结论:Iodogen法获得高标记率和放射化学纯度的125I-mMIF mAb,具有很好的体外稳定性,其在体内外保持较好的生物学活性.为进一步应用125I-mMIF mAb进行放射免疫显像和靶向治疗奠定了实验基础.     

~(125)Ⅰ标记抗MIF单克隆抗体制备及其生物学活性的研究

目的:建立125Ⅰ标记抗巨噬细胞移动抑制因子(MIF)单克隆抗体(mAb)方法,探讨其在体内外生物学活性。方法:①利用Iodogen法,Na125Ⅰ标记Anti-mMIF mAb,用Sephadex G-25柱凝胶过滤层析法分离纯化,测定其标记率。纸层析法测定放射化学纯度和稳定性。②采用ELISA和改良MMI鉴定其免疫活性及生物学活性。③观察小鼠体内的生物学分布情况。结果:①标记的最佳条件为Iodogen 40~100μg、抗体20~50μg[Iodogen(m)∶抗体(m)=2∶1],加入Na125I15~30 MBq、室温反应10~15 min,标记率为(90.40±3.34)%,放射化学纯度为(97.60±1.14)%,比活度为12.2~26.0 MBq/μg;标记物4℃条件下放置3周后放射化学纯度仍为90.36%。②125Ⅰ-mMIF mAb能与抗原MIF特异性结合,较好地保持其免疫活性及生物学活性。③体内生物学分布,在肺、肝、脾、肾内具有较高的放射性计数。结论:Iodogen法获得高标记率和放射化学纯度的125Ⅰ-mMIF mAb,具有很好的体外稳定性,其在体内外保持较好的生物学活性。为进一步应用125I-mMIF mAb进行放射免疫显像和靶向治疗奠定了实验基础。     

小鼠抗星形胶质细胞上调基因1(AEG-1)单克隆抗体的制备及应用

目的制备并纯化具有高特异性的抗星形胶质细胞上调基因1(AEG-1)单克隆抗体(mAb),并进行异硫氰酸荧光素(FITC)标记,鉴定标记的mAb与肿瘤细胞的结合能力。方法小鼠腹水诱生法制备并纯化抗AEG-1 mAb,Western blot法和免疫组织化学染色检测mAb的纯度及免疫活性。流式细胞术检测FITC标记mAb的标记效率,流式细胞术及免疫细胞化学染色检测FITC标记mAb与肿瘤细胞的结合能力。结果纯化得到了具有较高纯度的抗AEG-1 mAb,免疫活性良好;流式细胞术检测结果显示,FITC标记的mAb标记的肿瘤细胞表面荧光强度明显增加,标记率可达到90%以上;FITC标记的mAb可特异性识别并结合AEG-1阳性表达的肿瘤细胞,还能与小鼠体内注射的肿瘤细胞结合,在BALB/c小鼠血液中可检测出荧光染色阳性的肿瘤细胞。结论成功制备出小鼠抗AEG-1 mAb并进行了FITC标记,标记的mAb在体内外均可与肿瘤细胞特异性结合。     

重组人颗粒溶素的纯化及其单克隆抗体的制备

目的:纯化原核系统表达的颗粒溶素(GNLY),并制备其单克隆抗体(mAb)。方法:用Ni亲和层析纯化重组人GNLY,用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。mAb纯化后,用间接ELISA法测mAb的效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸盐洗脱法测定mAb的相对亲和力指数,并进行Ig亚类、特异性及杂交瘤细胞分泌mAb的稳定性检测。结果:经Ni亲和层析纯化的可溶性GN-LY融合蛋白,其纯度和含量分别为95%和0.8g/L。共筛选出能稳定分泌抗人GNLYmAb的杂交瘤细胞4株,分别为6C8、9C6、5G7和5E5。4株杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价分别为1∶100～1∶3200和(0.1～8)×10-4,5E5mAb的Ig亚类为IgM,其余3株mAb均为IgG1。结论:成功地纯化人GNLY融合蛋白。以其为免疫原制备的鼠抗人GN-LYmAb,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

用膜亲和层析法纯化小鼠腹水中的单克隆抗体

目的 用膜亲和层析法（MAC）纯化小鼠腹水中单克隆抗体（mAb)。方法 采用尼龙滤膜ZBM作为介质吸附抗人血清白蛋白（HSA）,将含mAb的腹水滤过此ZBM,再将吸附于ZBM上的mAb解离下来,获得纯化的mAb。结果 直径50mm吸附了HSA的ZＢＭ。经１０mL腹水循环滤过两次,即可达到最大mAb结合量。从ＺＢＭ上解离mAb,仅需解离液滤过１次就可完成,纯化的mAb经ＰＡＧＥ检测,只显示１条带。用纯化的mAb做金标记斑点免疫渗滤法（ＤＩＧＦＡ）检测ＨＳＡ标准品时,其灵敏度较用未纯化的腹水时提高了２０倍,结论 用尼龙滤膜ＺＢＭ改进的膜亲和层析法,可用于纯化中的单克隆抗体 且简便、省时、有效。     

抗人Flt-1单克隆抗体的制备和活性鉴定

目的:制备小鼠抗人血管内皮生长因子受体-1(Flt-1)的单克隆抗体(mAb),并鉴定其免疫学特性。方法:以重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白为抗原,通过经典的杂交瘤制备和活性筛选方法建立能稳定分泌抗Flt-1蛋白的mAb杂交瘤细胞株。结果:经传统的小鼠腹水型抗体的制备和纯化方法获得了高纯度的抗人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白的mAb。ELISA方法测定出该抗体的免疫球蛋白亚型为IgG1,轻链为κ链。West-ern blot结果显示该抗体能特异性地识别重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白,FACS结果表明该抗体能结合到Flt-1阳性的脐静脉内皮细胞和K562/A02细胞表面,并呈现出抗体浓度依赖性。结论:成功建立了1株能够稳定分泌抗重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白的mAb细胞株XA12,为今后进一步开展Flt-1及其胞外Ⅲ区蛋白的生物学功能研究以及基因工程抗体研究奠定了基础。     

Purification of murine IgG3 and IgM monoclonal antibodies by euglobulin precipitation

We describe a simple and efficient non-chromatographic method for the purification of murine IgG3 and IgM monoclonal antibodies (MAbs) which takes advantage of their euglobulin properties. Following filtration, ascitic fluid is dialysed against demineralized water and centrifuged at 22,000 X g for 30 min. The resulting precipitate is dissolved in a high salt buffer (0.1 M Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 8). A second cycle of dialysis and centrifugation yields a product of high purity. Nine IgG3 MAbs and eight IgM MAbs were purified by this procedure. Recovery was greater than 90% for seven of nine IgG3 MAbs. It was less reproducible for IgM MAbs and ranged from 40% to greater than 90% depending on antibody and batch. Purity was assessed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The purified immunoglobulin was essentially free of albumin, transferrin, and other mouse ascites proteins. No loss of antibody function was observed.     

人源化抗人肺癌单域抗体基因的构建、表达及活性分析

目的： 构建人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3VH基因, 在大肠杆菌中表达, 对其蛋白活性进行分析.方法： 采用CDR移植技术对mAb3D3的重链可变区进行人源化, 通过重叠PCR获得hu3D3VH的基因.构建pET22（b＋）/hu3D3VH表达载体, 并转化大肠杆菌BL21（DE3）, 在IPTG诱导下表达.表达产物通过Ni亲和层析柱纯化.采用间接ELISA和竞争抑制ELISA法进行活性分析.结果： 通过重叠PCR获得序列正确的目的基因.目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白的30%以上.纯化后, 目的蛋白的纯度达95%以上.hu3D3VH具有与亲本抗体相同的抗原反应性, 并能抑制mAb3D3与L342细胞的结合.结论： 获得的人源化单域抗体hu3D3VH, 保留了与mAb3D3相同的反应性和特异性, 为进一步临床应用奠定了基础.     

亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体

目的：纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体，建立稳定、适于生产应用的纯化工艺。方法：以原核表达的重组人源性抗HBs scFv免疫BALB／c小鼠，经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株14F7。将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水，经辛酸沉淀纯化后，制备亲和层析柱。纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体。结果：用抗scFv mAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAg Fab的纯度可达95％以上，回收率可达70％～85％。结论：人源性抗HBs scFv制备mAb作为亲和层析的介质，可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAg Fab，适用于大规模生产重组人源性抗HBsAg Fab。     

金属螯合亲和层析法对抗HBs Fab段的纯化

为了对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进行简便有效的纯化，在Ｆａｂ段表达载体上插入了一段编码６个组氨酸的ＤＮＡ片段，使所表达的Ｆａｂ段在Ｆｄ段的羧基端带有６个连续的组氨酸，通过锌离子金属螯合亲和层析法对大肠杆菌表达的Ｆａｂ段进行纯化，利用不同ｐＨ梯度缓冲液洗脱，一步即可达到９５％以上纯度的纯化，为基因工程抗体的制备开发提供了有效手段。     

β-淀粉样蛋白单链抗体表达和纯化条件的优化

目的:优化β-淀粉样蛋白单链抗体(scFv)的诱导表达和纯化条件。方法:在固定诱导表达时间和诱导表达温度的条件下,采用不同终浓度的IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析全菌液总蛋白中目的蛋白E3 scFv的表达水平,确定所需诱导剂IPTG的最佳浓度。在目的蛋白结合到亲和层析柱之后,采用不同终浓度的咪唑溶液进行洗脱,通过收集各管洗脱液、Western blot等方法确定预洗脱液咪唑的最佳浓度。结果:E3 scFv在20℃诱导表达18 h时,所需诱导剂IPTG的最佳浓度为0.1 mmol/L;纯化时,预洗脱液咪唑的最佳浓度为10 mmol/L。结论:通过优化上述条件,我们建立了一个高效表达及纯化E3 scFv的方法,为后续的研究奠定了基础。     

Performance of Protein-A-Based Affinity Membranes for Antibody Purification

The preparation of affinity membranes for application in antibody purification studies is described here. Protein-A-attached poly(hydroxyethyl methacrylate-N-methacryloyl-L-alanine) (PHEMAAL) membranes were produced by a photopolymerization technique and then characterized by swelling tests, surface area measurements, contact angle and scanning electron microscopy (SEM) studies. The water swelling ratio of the PHEMAAL membrane was 133.2%. PHEMAAL membranes have large pores with a size in the range of 5–10 μm. Protein A was covalently attached onto the PHEMAAL membranes via cyanogen bromide (CNBr) activation. Maximum protein A loading was 4.7 mg/g. There was a very low non-specific IgG adsorption onto the PHEMAAL membranes, about 0.38 mg/g. The maximum IgG adsorption on the PHEMAAL–protein A membrane was found to be 9.8 mg/g at pH 7.4 from aqueous solutions. Higher adsorption amount was observed from human plasma (up to 37.3 mg/g). Adsorbed IgG was eluted using 0.1 M glycine-HCl buffer (pH 3.5) with a purity of 93%. PHEMAAL–protein A membrane was used for repetitive adsorption/elution of IgG without noticeable loss in IgG adsorption amount after 10 cycles. The PHEMAAL–protein A membrane showed several advantages, such as simpler preparation procedure, good selectivity for IgG purification from human plasma and good stability throughout repeated adsorption–elution cycles.     

Detection and Quantitation of Human Ia-Type Antigens with Iodinated Protein A and Specific Purification of Antibodies Against Ia-Type Alloantigens

Antibodies directed against specific human Ia-type antigens can easily be detected and quantitated by an improved radioimmunoassay using iodinated protein A bound to a specific antibody-Ia-antigen complex on the surface of freshly drawn peripheral human leukocytes, cultured human cell lines, or lymphoid cells fixed with glutardialdehyde or formaldehyde. The same principle can also be used for the detection of Ia alloantigens on human lymphocytes when testing them with specific antisera known to contain antibodies against transplantation antigens. These anti-Ia-alloantigen antibodies had been purified by a two-step procedure involving ion-exchange chromatography on DEAE-cellulose at pH 6.3 and the specific absorption on formaldehyde-fixed Ia-alloantigen-carrying homozygous cell lines, followed by elution of these antibodies with isotonic citrate buffer at pH 3.0. In this way an about 90-fold purification could be achieved. After such a purification the highly enriched antibody fraction still reacted selectively with one specificity of the Ia antigen system.