大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定

[目的] 研究大鼠骨髓间充质干细胞 (MSCs) 的分离纯化和在诱导条件下的成骨能力.[方法] 取SPF级SD大鼠6只,采用全骨髓贴壁培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代的MSCs进行细胞形态和免疫组化鉴定;应用含地塞米松、B-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液诱导传代细胞向成骨细胞分化,检测碱性磷酸酶 (ALP) 的活性和细胞矿化作用进行成骨细胞鉴定.[结果] 全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs,MSCs 在含体积分数为10%胎牛血清的低糖 DMEM(L-DMEM) 养液中生长性状相对稳定,增殖速度快;诱导条件下,细胞ALP活性明显增高,并出现了矿化结节.[结论] 建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓 MSCs 的方法,成骨能力肯定,为中药蛋白质组学研究提供材料基础.     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究

 目的 分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）,并行多向分化潜能的鉴定。方法 经Percoll梯度分离法获得大鼠骨髓单个核细胞。贴壁培养后,通过倒置显微镜进行细胞形态学观察,并采用流式细胞术进行分析。传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞的诱导,并行免疫组织化学鉴定。结果 骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多。经反复传代纯化的MSCs检测CD71、CD29呈阳性表达并证实骨髓间充质干细胞经诱导后分化为脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞。结论 在体外,大鼠骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及分化潜能研究

目的建立一种体外分离、培养和扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性,为利用MSCs进行多种疾病的细胞治疗提供实验基础. 方法分离6～8周龄的大鼠胫骨、股骨,用DMEM/F12培养基冲出骨髓,采用Percoll淋巴细胞分离液获得骨髓中的单个核细胞,并结合MSCs的贴壁特性,获得大鼠MSCs,体外扩增.体外进行多向诱导分化鉴定分离的细胞,并测定传代细胞的生长曲线、观察其接种贴壁率、检测细胞周期和超微结构.结果体外培养的MSCs生长状况良好,并能迅速扩增,具有分化形成成骨和成脂肪细胞的能力;MSCs倍增时间约为28.8h;传代后10h贴壁达95.5% 以上;细胞周期显示有92%细胞处于G0/G1期;电镜显示的结果进一步证实MSCs具备了干细胞的结构特点.结论在本实验条件下,体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定,传代后的细胞适应性强,增殖较快,超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点.使干细胞用于移植治疗、基因治疗成为可能.     

应用全骨髓贴壁法获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态并测定其生长曲线,流式细胞术检测细胞周期,免疫细胞化学法鉴定细胞表面标志CD34、CD44及CD45.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.细胞生长曲线示,在传代后的第4-5天细胞开始明显增殖,进入指数增生期.细胞周期显示81.49%P3代细胞为G0/C1期,经免疫细胞化学染色结果显示CD44阳性,CD34、CD45阴性.结论 体外应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,而且此法简单易行、经济.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件的优化及生物学特性

目的建立一种新的高效体外骨髓间充质干细胞纯化培养方法,并对所获得细胞进行生物学行为研究。方法采用全骨髓培养获得原代骨髓间充质干细胞,经体外成脂、成骨诱导分化并检测细胞表面分子表达对所获得干细胞进行鉴定,传代后低密度接种(3×103/cm2)结合机械擦除对所培养细胞进行纯化,并对未纯化及纯化细胞分别进行集落形成单位实验、生长曲线及细胞周期分析来研究其生物学特性。结果全骨髓贴壁法可以成功培养出骨髓间充质干细胞,细胞呈现干细胞特性生长;可在体外成功地进行成脂、成骨分化;阴性表面标记分子CD34、CD45表达率均小于2%,阳性表面标记CD73、CD90表达率均高于95%。经纯化后的细胞具有更优的生物学行为,表现在:克隆形成率达到(28.80±5.00)%(P<0.01);培养12d后细胞数量增加(26.18±4.80)倍(P<0.05);处于S+G2/M期的细胞比例达到(45.98±1.60)%(P<0.01)。结论低密度接种结合机械擦除方法可以获得高纯度骨髓间充质干细胞,且该细胞具有更佳的生物学特性。     

同种异体大鼠骨髓间充质干细胞共培养及多向分化潜能鉴定

目的 探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞在体外的共培养,并行多向分化诱导鉴定。方法 分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,各传至第3代后,取等量细胞,混合后共培养,共培养之细胞再次传代后,分别进行成骨细胞、成脂肪细胞诱导,并分别行碱性磷酸酶、Von Cossa及油红染色鉴定。结果 全骨髓直接培养法原代细胞形态不均一,但是增殖能力好;密度梯度法分离得到的细胞较为均一,但增殖力不如全骨髓直接培养法。经过3代传代后,细胞均可获得相对纯化。共培养细胞增殖力较好,细胞形态较为均一,且未出现因免疫排斥导致的细胞死亡。共培养之大鼠骨髓间充质干细胞分别经诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞形态（分别经碱性磷酸酶、Von Cossa染色和油红染色证实）。结论 采用全骨髓直接培养及密度梯度离心法,经3-5代培养后均可获得相对纯化之骨髓间充质干细胞。同种异体大鼠骨髓间充质干细胞共培养生长良好,不发生免疫排斥,证实该类细胞的免疫原性极低。在体外,大鼠骨髓间充质干细胞可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞,表明它具有多向分化潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与多向分化鉴定

目的:建立体外分离、培养及纯化大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,并对细胞进行形态学观察、表面标志物鉴定及分化潜能检测,为大鼠MSCs进行细胞移植治疗脑损伤的研究奠定基础。方法:用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠MSCs,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物,定向诱导向成脂、成骨方向分化。结果:72小时首次全量换液7天后观察可见呈放射状排列的细胞集落,以梭形细胞为主,细胞规则、生长旺盛,可连续传代10代以上;取3代MSCs流式细胞仪检测,CD90呈阳性表达,CD34、CD45均呈阴性表达;细胞传代后加入成脂、成骨诱导剂定向诱导分化,油红O染色及茜素红染色均呈阳性。结论:全骨髓贴壁筛选培养法可大量分离、纯化、扩增大鼠MSCs。经诱导鉴定MSCs具有多项分化潜能。     

脂质体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的脂质体介导IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞（MSCS），并研究对MSCS成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法以密度梯度离心结合全骨髓培养法获得纯化骨髓间充质干细胞（MSCs），经流式细胞仪检测，细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，但是CD14和CD45表达阴性。采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3．1-IGF-1转染MSCs，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达行Western blot检测。结果获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞（MSCs）；脂质体为介导将全长兔IGF-1目的基因导入MSCs，Western blot鉴定转染成功，转染后的MSCs较未转染MSCs成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养标记及向移植肺趋化的实验研究

目的观察体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的生物学特征并研究DAPI和GFP双重标记的MSCs向移植肺的趋化现象。方法全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠MSCs,流式细胞法检测细胞表型。观察包括细胞形态学、生长曲线在内的生物学特征。通过定向诱导MSCs向成骨和成脂肪分化鉴定其多向分化潜能。绿色荧光蛋白(GFP)和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)双重标记MSCs,经尾静脉注入受体大鼠,取肺组织冰冻切片,观察MSCs是否趋化到移植肺中。结果成功纯化、扩增MSCs,传代周期约5d,体外传代15代,MSCs仍具有纺锤状形态,保持显著增殖能力及生物学稳定性。流式细胞仪检测结果符合MSCs表型特征。MSCs具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的多向分化潜能。可见GFP和DAPI双重标记的MSCs趋化到移植肺中。结论通过全骨髓贴壁培养纯化的MSCs生物学特征稳定;DAPI和GFP双重标记的MSCs能够趋化到移植肺内并存活。