尖锐湿疣患者外周血及经体外诱生的HPV16抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞检测

目的 研究尖锐湿疣患者外周血HPV16抗原特异性CD8⁺细胞毒性T细胞(CTL)表型变化及正常人T细胞对病毒抗原肽体外刺激的细胞免疫应答反应在尖锐湿疣发病机制中的作用。方法 采用免疫荧光标染重组MHCⅠ类分子-多肽五聚体技术,流式细胞仪定量检测10例尖锐湿疣患者外周血HPV16E7_11-20(HLA-A^*0201/YMLDLQPETF)抗原特异性CTL(Pent⁺CD8⁺)、活化CTL(Pent⁺CD8⁺CD69⁺)及记忆性CTL(Pent⁺D8⁺CD45RO⁺)数量。同时,用HPV16E7_11-20合成多肽、重组人白介素7、白介素2体外刺激13例正常人外周血单一核细胞产生抗原特异性CTL,并对其进行表型分析,以无关肽HBVcore_18-27作为阴性对照。结果 尖锐湿疣患者外周血CD8⁺T细胞中HPV16抗原特异性CTL、活化CTL及记忆性CTL百分数分别为0.76%±0.43%.0.36%±0.20%及0.33%±0.15%,对照组分别为0.24%±0.07%,0.17%±0.05%及0.15%±0.06%。两组比较,P值分别<0.01,<0.05及<0.01。病毒多肽体外刺激T细胞7d后,抗原特异性CTL、活化CTL及记忆性CTL百分数分别为0.75%±0.16%,0.35%±0.15%及0.33%±0.18%,均比非刺激组的0.24%±0.06%,0.16%±0.03%及0.13%±0.04%明显增多,P值均<0.01。结论 HPV感染诱导CD8⁺T细胞克隆性增殖,产生抗原特异性CD8⁺CTL,高效、特异性直接杀伤病毒感染的靶细胞,在抗病毒T细胞免疫应答过程中发挥作用。     

含人类乳头瘤病毒16E7-L1的嵌合型病毒样颗粒的构建、表达和纯化鉴定

目的 研究人类乳头瘤病毒(HPV)16型的早期基因E7,构建、表达并纯化鉴定了HPV16E7与BPVL1重组的嵌合型病毒样颗粒VLPs.方法HPV16E7基因分3段经PCR扩增后分别克隆入连有BPVL1的质粒PUC形成BPVL1HPV16E7;以质粒PVL1393为载体将BPVL1HPV16E7基因转染杆状病毒并在昆虫细胞中进行表达;用超声粉碎和蔗糖超离、氯化铯梯度离心等方法纯化以及免疫印迹、ECL、透射电镜等方法鉴定表达产物.结果 和结论成功地获得表达BPVL1HPV16E7重组体,形态和结构与野生型HPV几乎一致的嵌合型病毒样颗粒VLPs.将为进一步的HPV16E7的疫苗研究等奠定基础.     

HPV16 CTL表位E749-57以HSP110为分子伴侣的免疫原性研究

目的 探讨以mHSP110为分子伴侣的HPV16 CTL表位E749-57的免疫原性。方法 将mHSP110基因克隆、原核表达和纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定。在热休克状态与E749-57结合形成复合物,高压液相色谱（HPLC）鉴定其结合程度。用mHSP110-E749-57复合物免疫小鼠,IFN-γ胞内染色、MTT法检测小鼠脾细胞中特异CTL。结果 克隆mHSP110片段经DNA序列测定与基因库中其CDS一致,长度为2577 bp;经SDS-PAGE和Western印迹证实mHSP110表达、纯化成功,HPLC分析E749-57能够与mHSP110形成复合物。复合物免疫小鼠的脾淋巴细胞中CD8+IFN-γ+ T细胞的频率、脾淋巴细胞增殖活性明显高于E749-57组、HSP110组和PBS组。复合物免疫小鼠可明显抑制TC-1肿瘤的生长。结论 mHSP110-E749-57复合物能诱导产生特异性CTL并产生抗肿瘤效应。     

HPV16E7多肽体外诱生抗原特异性细胞毒性T细胞表型及功能的研究

目的 探讨高致癌性HPV16E7病毒抗原肽体外诱生HLA-A2阳性正常人外周血抗原特异性CD8＋细胞毒性T细胞（CTL）的表型及功能状态。方法 以HPV16E711－20合成多肽、重组人IL-7、IL-2体外刺激26例HLA-A2阳性正常人外周血T细胞,用HLA-A*0201限制性表位肽/ YMLDLQPETT五聚体技术,结合流式细胞仪对抗原特异性CTL进行频率、表型［CD45RA+CD27-效应性CTL、CD45RA-CD27-效应性记忆CTL（TEM）、CD45RA-CD27＋中枢性记忆CTL（TCM）、CD45+CD27+初始性CTL］及功能（穿孔素、颗粒酶B、FasL）分析,并以无关肽HBVcore18－27作为阴性对照。结果 病毒多肽体外刺激T细胞7 d后,抗原特异性CD8＋ CTL数为（0.73 ± 0.33）%,比未刺激组的（0.02 ± 0.03）%明显增多（P < 0.01）。进一步分析,在抗原特异性CTL中,效应性CTL、TEM、TCM及初始性CTL百分比分别为（26.07 ± 13.46）%、（7.97 ± 7.11）%、（33.25 ± 19.68）%及（32.73 ± 13.89）%,均比未刺激组的（0.02 ± 0.03）%、（0.02 ± 0.03）%、（0.02 ± 0.03）%及（0.02 ± 0.05）% 明显增多,P值均 < 0.01。HPV16E711－20表位特异性CTL分泌穿孔素、颗粒酶B、Fas-L的水平分别为（47.01 ± 18.69）%、（80.53 ± 13.32）%及（26.48 ± 7.81）%,均比未刺激组的（0.38 ± 0.55）%、（0.34 ± 0.22）%及（0.16 ± 0.16）%明显增多,P值均 < 0.01。结论 HPV16E711－20多肽诱导CD8＋ T细胞克隆扩增,产生抗原特异性CD8＋ CTL,分泌毒性细胞因子,通过不同机制特异性杀伤病毒感染的靶细胞,在抗病毒免疫应答中发挥作用。     

HPV16E7_(11-20)配体抗肿瘤免疫的作用

目的比较HPV16型E7抗原CTL表位E711-20(YMLDLQPETT)与其修饰多肽配体APL(YLLDLQPE-VT)诱发特异CTL免疫应答的能力和抗肿瘤免疫治疗的作用。观察E711-20及其APL的小鼠TC-1细胞肿瘤免除率、存活时间与荷瘤小鼠的肿瘤体积变化,了解其预防和治疗效果。方法以E711-20及其修饰多肽配体(APL)免疫C57BL/6小鼠,测定免疫后小鼠脾淋巴细胞的增殖指数;用LDH释放试验检测免疫后小鼠脾淋巴细胞的CTL杀伤活性。结果脾细胞增殖实验中,3组增殖指数如下:IFA+APL组2.42±0.38,IFA+E711-20组1.68±0.32,IFA组1.07±0.22;CTL杀伤效应实验中,3组靶细胞溶破率(%)如下:IFA+APL组54.21±0.12,IFA+E711-20组62.33±0.46,IFA组0.88±0.07;IFA组肿瘤免除率为0,IFA+E711-20组肿瘤免除率为40%,IFA+APL组肿瘤免除率为80%;荷瘤小鼠中,对照组IFA肿瘤体积迅速增大,E711-20和APL组的肿瘤生长速度较慢。APL免疫诱导的小鼠脾淋巴细胞,其CTL杀伤活性和增殖能力强于E711-20;APL对TC-1肿瘤细胞的预防和治疗效果优于E711-20。结论 APL诱导特异性抗肿瘤免疫应答的能力和抗肿瘤效果优于E711-20,可能为针对HPV16E7抗原的肽疫苗分子设计提供理想的CTL表位。     

HPV16E7抗原的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的筛选与鉴定

目的 筛选和鉴定人工合成的人乳头瘤病毒16型E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞预测表位。方法 对预测的E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位运用标准Fmoc方案进行合成与纯化,采用标准⁵¹Cr释放试验检测特异性CTL诱导活性。结果 筛选并鉴定出E711-19(YMLDLQPET)和E7_49-57(RAHYNIVTF)2条人乳头瘤病毒16型E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性CTL表位。结论 E711-19(YMLDLQPET)和E7_49-57(RAHYNIVTF)抗原性较强,有可能作为HPV感染治疗用肽疫苗的候选表位。     

聚合酶链反应诱导HPV16E7C端基因突变和突变蛋白在真核细胞表达

目的 聚合酶链反应(PCR)诱导人乳头瘤病毒(HPV16)早期基因E7C端锌指结合基序基因突变,评价突变对抗原稳定性的影响。方法 采用PCR技术对HPV16E7第58、91位氨基酸进行突变,构建野生型(pcDNA3.1/16E7)和突变型(pcDNA3.1/16ME7)重组体,对其蛋白表达进行比较。结果 HPV16E7C端第58、91位氨基酸突变后真核细胞表达成功,免疫荧光检测在质粒转染COS-7细胞24h后两种重组体均有阳性细胞出现,但在48h时突变型重组体阳性细胞消失。免疫印迹技术在24h和48h时,突变型重组体均未见阳性条带。结论 HPV16E7C端锌指结构对维持蛋白稳定性起重要作用,突变后蛋白稳定性下降。     

人乳头瘤病毒16型E7抗原细胞毒性T细胞预测表位的分子模拟研究

对人乳头瘤病毒（HPV）16型E7抗原的预测表位从理论上分析其与HLA－A2分子结合的情况，推测成为HLA－A2限制性表位的可能性。通过计算机分子模拟，确立各表位及其与HLA－A2分子结合形成复合物的模拟结构。结果发现，各表位的三维结构符合HLA－A2限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位的结构要求，能较好地与HLA－A2分子结合。根据分子模拟提供的理论支持，各预测表位符合要求，提示可在后续实验中进行表位合成、筛选、鉴定和多肽疫苗的研制。     

负载人乳头瘤病毒16型E7多肽树突细胞诱导抗原特异性细胞免疫反应

目 的 观 察 负 载 人 乳 头 瘤 病 毒 16 型 (H PV16)E749-57 多 肽 树 突 细 胞 (DC)体 外 诱 导 针 对H PV16 肿 瘤细 胞 的特 异性 细 胞免 疫反 应 。方 法 用粒 细 胞-巨 噬细 胞 集落 刺激 因 子(GM -CSF)及 白 介素 4(IL-4)从 健康 成人 外 周血 单一 核 细胞 诱导 DC 并 负载 H PV 16 E749-57 多肽 ,流 式细 胞 仪检 测 DC 表 面 抗 原;混 合淋 巴 细 胞 反应 观 察 DC 对 同 种 淋 巴 细 胞 增 殖 的 激 发 效 应 ;乳 酸 脱 氢 酶 (LDH )释 放 法 评 价 DC 诱 导 的细胞 毒 性 T 淋 巴 细 胞 (CTL)对 Caski肿 瘤 细 胞体 外 杀 伤 效应 。 结 果 负 载 H PV16 E749-57 多 肽 的 DC 表面表 达 CD 1a(58.4 ±6.7)%、CD 80(70.6 ±3.4)%及 H LA -DR (74.8 ±4.2)%分 子 ;具 有 刺 激 同 种 T 淋 巴 细 胞增 殖的 能 力 ;其 诱 导 的 抗 原 特 异 性 CTL 对 Caski肿 瘤 细 胞 产 生 特 异 性 杀 伤 ,而 对 SiH a、A N3CA 肿 瘤 细 胞无明 显 杀伤 作用 。 结论 负 载 H PV16 E749-57 多 肽的 DC 体 外可 诱导 高 效、特 异 性的 CTL 效应 。     

含人类乳头瘤病毒16E7—L1的嵌合型病毒样颗粒的构建,表达和纯化 …

目的 研究人类乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型的早期基因Ｅ７,构建、表达并纯化鉴定了６Ｅ７与ＢＰＶＬ１重组的嵌合型病毒样颗粒ＶＬＰＳ。方法ＨＰＶ１６Ｅ７基因分３段经ＰＣＲ增扩后分别克隆入连有ＢＰＶＬ１的质粒ＰＵＣ形成ＢＰＶＬ１－ＨＰＶ１６Ｅ７;以质粒ＰＶＬ１３９３为载体将ＢＰＶＬ１－ＨＰＶ１６Ｅ７基因转染杆状病毒并在昆虫细胞中进行表达;用超声粉和蔗糖超高、氯化工离心等方法纯化以及免疫印迹、ＥＣＬ、透射电     

北京地区人乳头瘤病毒16E6E7基因变异和序列分析

目的 了解北京地区人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7结构特点，为研制HPV16疫苗奠定基础。方法 从HPV感染组织中提取DNA，PCR鉴别其型别，从单独HPV16感染的标本中分离HPV16 E6E7基因，克隆入载体pGEM-3ZF，进行双向测序，与德同标准株进行比较。结果 构建了北京地区HPV16E6E7的重组质粒。测序结果表明该基因全长为776bp，与已发表的德同标准株长度相等，3处核苷酸发生变异，同源性99．7％。分别位于第60、96和565nt(相当于HPV16全长序列中第142、178和647nt)，2处位于F6区，1处位于E7，其对应氨基酸分别为第20、32和188个氨基酸，分别由Pro(CCA)、Asp(GAT)和Asn(AAT）变异为Pro(CCG)、Glu(GAG)和Ser(AGT)。结论 北京地区HPV16E6E7基因结构与德国标准株存在差异。     

钙网蛋白基因120片段和人乳头瘤病毒6bE7基因诱导的小鼠细胞免疫反应

目的研究嵌合DNA疫苗钙网蛋白基因120片段(CRT120)和人乳头瘤病毒6b型E7基因(HPV6bE7)的免疫学特性。方法克隆、构建重组质粒即嵌合DNA疫苗pcDNA3．1-GFP-CRT120／ HPV6bE7、pcDNA3．1-GFP-HPV6bE7、pcDNA3．1-GFP-CRT120;经脂质体转染获得HPV6bE7转染阳性 B16细胞株;用肌内注射法对C57BL/6小鼠进行重组质粒DNA疫苗免疫;检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群变化、小鼠脾细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性以及与靶细胞共孵育后白介素2和干扰素γ的分泌水平。结果获得构建正确的嵌合DNA疫苗pcDNA3．1-GFP-CRT120／HPV6bE7以及稳定表达HPV6bE7 的阳性细胞株。CRT120／HPV6bE7较之HPV6bE7能引起免疫小鼠外周血中CD8 T淋巴细胞亚群分化和 TCRγδ T细胞上调(P<0．05),脾淋巴细胞与靶细胞共孵育上清液中白介素2和干扰素γ的浓度也明显高于HPV6bE7和CRT120组(P<0．05);CRT120／HPV6bE7免疫的小鼠淋巴细胞对靶细胞B16／HPV6bE7 有明显的杀伤活性。结论 CRT120／HPV6bE7嵌合DNA疫苗能够诱导免疫小鼠的病毒抗原特异性细胞免疫。     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因腺病毒载体,并在真核细胞表达。方法用PCR法,扩增出HPV11E7基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体形成重组质粒TOPO-E7。TOPO-E7与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DESTTM重组反应,E7基因被重组到腺病毒载体上。该载体经PacI酶切,脂质体法转染人胚肾293A细胞,获得重组腺病毒载体pAD-E7。pAD-E7转染人HaCaT细胞,激光共聚焦显微镜分析E7蛋白表达情况。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒TOPO-E7成功构建。重组子pAD-E7转染293A细胞后,获得滴度为1.4×107pfu/mL的重组腺病毒载体。该载体转染HaCaT细胞,48h后激光共聚焦显微镜下可见细胞内E7蛋白表达。结论重组腺病毒载体能有效介导HPV11E7基因在真核细胞的表达。     

16型人乳头瘤病毒E6/E7诱导角质形成细胞表达热休克蛋白70

目的 了解１６型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ１６）Ｅ６／Ｅ７、ＨＳＰ７０与角质形成细胞永生化及转化之间的关系。方法 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导法进行转染,以Ｇ４１８筛选阳性克隆,免疫印迹分析及免疫荧光双标记染色结合激光扫描共聚焦显微镜对ＨＳＰ７０和ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７在转染然质形成细胞中的表达进行了观察。结果 免疫印迹分析显示正常负擀形成细胞和转染角质形成细胞均在相对分子质量７００００处出现一条染色带     

表达人乳头瘤病毒6b和11型E6/E7基因的小鼠肿瘤细胞株的建立

目的 构建含有人乳头瘤病毒(HPV)6b和11型E6/E7基因的表达质粒和建立这些基因的转染细胞株。方法 分别将HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7克隆于含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1,经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性克隆,荧光显微镜观察,RT-PCR鉴定mRNA转录。结果 通过酶切鉴定和基因测序证实,构建质粒中目的基因片段序列完全正确。转染后荧光显微镜下可观测到B16细胞发出绿色荧光。以G418筛选的抗性细胞克隆提取RNA并经RT-PCR扩增出与目的基因大小一致的基因片段。结论 建立的小鼠肿瘤细胞B16表达HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7基因。提示转染的细胞株可移植于小鼠,利于体内研究这些基因的生物学作用和免疫学机制。