自身免疫调节因子促进THP-1细胞的自噬性凋亡

目的 探讨自身免疫调节因子(AIRE)对THP-1单核细胞凋亡的影响及其可能的分子机制.方法 将THP-1细胞以佛波醇酯(PMA)诱导分化后,进行瞬时转染.免疫荧光和Western blot法检测转染效率.通过Annexin Ⅴ-FITC、PI双染色法和流式细胞仪检测过表达AIRE的THP-1细胞凋亡率.通过间接免疫荧光染色和Western blot检测自噬蛋白LC3B的表达.结果 PMA诱导后,THP-1细胞贴壁生长,形态多样,胞质内可见空泡、吞噬细胞碎片等典型成熟分化形态.转染48 h后,THP-1细胞的AIRE蛋白呈现明显高表达.对比空载体转染和阴性对照,过表达AIRE使THP-1细胞的凋亡率上升;同时,Western blot显示LC3B-Ⅱ的蛋白水平也较空载体转染组增高,且间接免疫荧光染色提示单个细胞的阳性LC3B-Ⅱ斑点数目较空载体转染组明显增加(P＜0.05).结论 AIRE可能通过上调THP-1细胞的自噬促进其凋亡.     

人截短型凋亡诱导因子对HeLa细胞的促凋亡作用

目的:观察人截短型凋亡诱导因子(AIF△1-400)对HeLa细胞的促凋亡作用.方法:在AIF△1-120基因克隆成功的基础上进一步改造,构建截去AIF基因线粒体定位信号,FAD结合结构域和NADH结合结构域(1-400位氨基酸)编码序列的AIF△1-400基因,将其克隆入pcDNA3和pIRES2-EGFP真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察,MTT检测等方法检测该基因在转染细胞中的表达及其对肿瘤细胞的促凋亡活性.结果:经酶切鉴定与测序证实,带有AIF△1-400的真核表达载体构建成功.瞬时转染后出现细胞形态变化,随转染时间的延长转染细胞数减少,荧光变弱.经间接免疫荧光检测可观察到截短型AIF蛋白位于细胞质中,部分已位于细胞核内.MTT法检测发现AIF△1-400转染后对细胞生长有明显的抑制作用.结论:AIF△1-400仍然具有诱导HeLa细胞凋亡的作用.     

人截短型凋亡诱导因子AIF△1-480的表达对HeLa细胞的促凋亡作用

目的: 观察人截短型AIF(AIF△1-480)基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用. 方法: 在人截短型AIF(AIF△1-120)基因克隆成功的基础上,进一步改造,构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域(1-480位氨基酸)编码序列的人截短型AIF(AIF△1-480)基因.将其克隆入pIRES2-EGFP绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察、电镜观察等方法,检测目的基因在转染细胞中的表达以及对转染细胞形态的影响.结果: 成功构建了人截短型AIF(AIF△1-480)基因的真核表达载体.转染细胞后,可检测到人截短型AIF(AIF△1-480)分子的表达.转染后48 h,可观察到表达人截短型AIF(AIF△1-480)分子的细胞呈现典型的凋亡特征.结论: 人截短型AIF(AIF△1-480)基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡.     

转染野生型p53对宫颈癌HeLa细胞COX-2表达及生长影响的研究

目的 研究外源性野生型p53（wt p53）基因对宫颈癌HeLa细胞中环氧合酶-2（COX-2）的影响和对HeLa细胞的生长抑制作用.方法 将p53的HeLa细胞按是否转染p53分为实验组和对照组.实验组利用脂质体介导的转染技术将野生型p53基因转染到HeLa细胞中,wt p53的表达使用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）鉴定,用蛋白质印迹法（Western blot）与RT-PCR检测转染前后COX-2蛋白和COX-2 mRNA表达的变化.CCK-8染色法绘制细胞生长曲线.结果 野生型p53基因转染后HeLa细胞中的COX-2蛋白和COX-2 mRNA表达减少.通过对细胞生长曲线的分析,转染后较转染前生长明显减慢（P〈0.01）.结论 外源性wt p53基因表达可抑制宫颈癌HeLa细胞中COX-2蛋白和COX-2 mRNA的表达;wt p53可能通过抑制COX-2对宫颈癌HeLa细胞产生抑制作用.     

GFP-p16融合基因表达载体在BHK HeLa细胞中荧光蛋白表达的研究

本文报道了通过脂质体转染技术将本室构建成的GFP-p16融合基因表达载体——pCp16G和pcGp16分别导入BHK、HeLa细胞中，研究它们在真核细胞中荧光蛋白的表达；结果表明，外源脂质体对BHK、HeLa等真核细胞无损伤，经斑点杂交检测证明，外源基因可以通过脂质体转染技术整合到细胞基因组中。研究结果还表明，p16基因与GFP基因的3′端连接，可以保持GFP的荧光特性，表达荧光蛋白，而与GFP基因的5′端连接，则不能表达荧光。     

肝刺激因子稳定转染人肝癌细胞系的方法建立与表达鉴定

目的 建立稳定表达肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)的BEL-7402肝癌细胞系,并对其生物学特性进行鉴定。方法 采用脂质体法将鉴定后的Flag-HSS-pcDNA3.0质粒转染到肝癌细胞系BEL-7402中,进行G418筛选,获得稳定转染的人肝癌细胞系。通过real-time PCR、 Western blotting和免疫荧光染色等方法鉴定HSS mRNA和蛋白质表达及亚细胞定位。结果 免疫荧光染色实验证实HSS基因能在稳定转染的肝癌细胞系中表达,并定位于线粒体中。同时发现在稳定转染细胞中HSS mRNA和蛋白质的表达也均高于野生型BEL-7402细胞。结论 目前已成功构建稳定转染HSS的BEL-7402肝癌细胞系。为深入研究HSS的生理功能提供实验工具和研究基础。     

稳定表达外源性p53基因U14细胞系的建立及鉴定

目的建立稳定表达外源性p53基因的U14细胞系。方法将提取的含p53质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U14细胞，经含G418选择培养基筛选得到稳定转染的细胞系．用间接免疫细胞化学法鉴定外源性p53基因的表达情况。结果筛选得到的U14细胞系可检测到外源性p53蛋白的表达。结论建立了稳定表达外源性p53基因的U14细胞系，为进一步研究p53基因用于肿瘤免疫治疗奠定基础。     

人granzyme B基因在HeLa细胞中的表达

目的 构建携带人granzyme B基因的真核表达载体，并将其在HeLa细胞中的表达。方法 用反转录PCR获取人granzyme B全长cDNA序列，将其活性型序列克隆进pcD-NA3重组表达质粒。脂质体法转染HeLa细胞，间接免疫荧光检测目的蛋白表达，HE染色观察其对转染HeLa细胞形态的影响。结果工成功获得了野生型granzyme B cDNA，构建了编码活性型granzyme B的真核表达载体pcDNA3-G。转染HeLa细胞后观察到目的的蛋白表达，转染细胞形态发生变化，出现多核大细胞及固缩小细胞。结论 活性型granzyme B哺乳动物表达系统的建立，为进一步研究granzyme B的生物学效应奠定了基础。     

稳定表达人survivin基因的B16细胞系的建立与鉴定

目的构建人survivin真核表达载体,稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,建立稳定表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系。方法采用PCR方法扩增出人survivin全长基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-SUR-(his)6。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹及免疫荧光等检测方法验证人survivin基因在稳定转染B16细胞株中的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-SUR-(his)6重组体构建正确。RT-PCR结果表明:从稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞所抽提的总RNA中能够扩增出survivin基因(约530bp);蛋白免疫印迹结果表明:利用特异抗体能够从稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞中检测到survivin蛋白条带,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的条带;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示,稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞用特异性抗体检测到高效的荧光表达,其中5号单克隆的荧光表达率为91.38%,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的荧光表达。结论成功构建了真核表达载体pIRES-neo-SUR-(his)6,建立了稳定转染高效表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系。     

稳定表达淋巴细胞趋化因子的大鼠系膜细胞载体的构建

目的 探讨以肾小球系膜细胞作为高表达大鼠淋巴细胞趋化因子(Lm)的载体的可行性，从而为深入研究淋巴细胞趋化因子的作用和体内活性创造条件。方法 采用RT-PCR法获得大鼠的Ltn的编码区全长的cDNA序列；应用基因重组技术和限制性内切酶酶切法构建并鉴定pcDNA3．1／Lm真核表达载体；用LipofectAMINEPUUS脂质体转染法将构建的质粒及空质粒瞬时转染于SKOV3细胞；用RT—PCR和ELISA法检测Ltn mRNA及蛋白质水平的表达，进而用pcDNA3．1／LacZ和pcDNA3．1／Ltn稳定转染原代培养的WKY大鼠肾小球系膜细胞，用潮霉素B筛选获得稳定表达报告基因LacZ和大鼠Ltn的细胞克隆。结果 测序结果显示质粒载体中正确地插入了大鼠Lm的编码基因；RT-PCR显示在瞬时转染的SKOV3细胞和稳定转染的4个系膜细胞克隆中Ltn mRNA表达增高；ELISA证实细胞培养上清中Ltn的蛋白质浓度较对照组明显升高。此外，X-gal染色显示获得了2个稳定表达β-半乳糖苷酶基因的系膜细胞克隆。结论 本研究成功地构建了真核表达质粒载体pcDNA3．1／hygro／Ltn，获得了稳定表达大鼠Lm的肾小球系膜细胞克隆，并在mRNA及蛋白质水平上证实了Lm的表达，为进一步研究Lm的体内活性奠定了基础。     

TIF3转基因CHO和COS7细胞株的构建与鉴定

目的：构建TIF3转基因CHO和COS7细胞株并对其构建的细胞株进行鉴定。方法：采用磷酸钙介导转染技术和G418细胞筛选法，以pcDNA3.1/V5-His-TOPO为表达载体，构建TIF3转基因CHO和COS7细胞株；并应用Western Blot技术对转基因表达产物进行分析与鉴定。实验设计分无转染组、载体转染组和目的基因转染组。结果：在7株转染的CHO细胞株中，有3株具有高效稳定表达的TIF3编码蛋白质；在4株转染的COS7细胞株中有2株同样具有高效稳定的TIF3编码蛋白质表达。结论：本研究成功地构建了3株TIF3转基因CHO细胞株和2株TIF3转基因COS7细胞株，它们对今后镉化物相关癌基因的发现及其他生物学功能的研究具有重要的应用价值。     

桦褐孔菌醇对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

目的：研究桦褐孔菌醇（Inotodi01）体外诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用,并探讨其可能的作用机制。方法：以不同浓度的Inotodiol处理HeLa细胞24h、48h和72h,采用MTT法检测细胞增殖情况,透射电镜观察细胞超微结构变化,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫细胞化学法检测caspase-3蛋白的表达。结果：Inotodiol能抑制HeLa细胞的增殖,且呈时间-剂量依赖关系（P〈0．05,P〈0．01）;超微结构观察可见细胞体积缩小、核固缩、核内异染色质增多并边集、凋亡小体形成等典型的凋亡形态学改变;TUNEL法显示,经50μg/ml的lnotodiol处理48h,HeLa细胞发生凋亡;免疫细胞化学结果表明,与对照组相比,Inotodiol组HeLa细胞中caspase-3蛋白表达上调（P〈0．01）。结论：在一定浓度范围内,Inotodiol可在体外抑制HeLa细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与其上调easpase-3蛋白的表达有关。     

IL-24 cDNA转染人喉癌细胞系的建立及其表达的研究

目的 建立转染人白细胞介素-24(hIL-24)基因的喉癌细胞株,并研究hIL-24的表达情况.方法 将携带人白细胞介素-24的质粒peDNA3.1( )-hIL-24转导入人喉表皮样癌细胞Hep-2中,G418筛选阳性克隆,RT-PCR、Western blot和ELISA法对hIL-24的表达进行检测.结果 IL-24基因成功地转导入Hep-2细胞中并能高效表达.RT-PCR电泳结果显示hIL-24基因在mRNA水平有表达;ELISA法测得106个转染阳性细胞24h内培养上清液中hIL-24的含量为162.8±15.4 pg/mL,空载体转染及未转染的细胞未检测到hIL-24.结论 hIL-24基因成功转染人喉癌细胞系Hep-2细胞且能持续大量表达.     

稳定表达外源性p16基因肝癌SMMC-7721细胞株的建立及鉴定

目的构建稳定表达外源性p16基因的肝癌SMMC-7721细胞株。方法利用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体pcDNA3．1( ),将外源性p16基因转染入此基因表达下调的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中,经G418筛选,建立稳定表达的细胞株,用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)及免疫组织化学法鉴定p16基因的表达,同时对细胞株分泌蛋白进行活性检测。结果转染p16基因的SMMC-7721细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达。结论建立稳定表达P16抑癌蛋白的SMMC-7721细胞株有助于研究p16抑癌基因在肝癌发生中的作用。     

真核表达载体pEGFP-VASP-lC的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-VASP-lC并稳定转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞,为进一步探讨VASP-lC区介导的VASP的寡聚化在HeLa细胞迁移中的作用奠定基础。方法:用RT-PCR技术从人内皮细胞株ECV304细胞中获得VASP-lC区的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-C1中,构建的重组质粒经脂质体介导转染HeLa细胞,Western blot鉴定VASP-lC区在HeLa细胞中的稳定表达。结果:RT-PCR成功地扩增出一条约310bp的片段,经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western blot证明人VASP-lC区能以融合蛋白的形式在HeLa细胞中稳定表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-VASP-lC,获得了稳定表达人VASP-lC区基因的HeLa细胞克隆,便于进一步探讨VASP-lC区介导的VASP的寡聚化在HeLa细胞迁移中的作用。     

羟基喜树碱对宫颈癌HeLa细胞的放射增益作用及影响因素的研究

目的研究羟基喜树碱(HCPT)对人宫颈癌HeLa细胞系的放射增益作用以及给药时序、药物浓度和作用时间对放射增益作用的影响。方法MTT法测定HCPT作用于HeLa细胞的IC50。应用克隆形成和单击多靶数字模型方法检测HCPT的放射增益作用及不同给药时序、不同药物浓度和不同作用时间的细胞存活率及放射增益比(SER)。结果HCPT对HeLa细胞的IC50为62.1μmol/L。取2.85μmol/L(IC20)HCPT联合射线照射作用HeLa细胞,先给药后照射组SER=1.187、给药中照射组SER=1.573、先照射后给药组SER=1.850;而用28.5μmol/L(10×IC20)HCPT作用HeLa细胞,先照射后给药组SER=1.897;HCPT作用HeLa细胞4 h内放射增益作用改变明显,其后延长作用时间对放射增益无明显影响。结论HCPT对HeLa细胞具有放疗增益作用,其增益作用有时序、浓度和时间依从性。     

RT-PCR法检测HNP1基因在气管上皮细胞转染后的表达

采用脂质体转染法将人中性粒细胞防御素（ Ｈ Ｎ Ｐ１ ）的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 重组真核表达质粒ｐ Ｂａｂｅ Ｎｅｏ Ｈ Ｎ Ｐ１导入无血清培养的人和兔的气管粘膜上皮细胞,利用逆转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）法,在核酸水平检测 Ｈ Ｎ Ｐ１ 在气管上皮细胞的表达。结果：在人和兔的转染上皮细胞中均可检测到 Ｈ Ｎ Ｐ１ｍ Ｒ Ｎ Ａ 的表达,而在未转染的上皮细胞中 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ检测结果呈阴性。这一结果与作者先前用免疫组化法在蛋白质水平上检测的结果一致,并证明ｐ Ｂａｂｅ Ｎｅｏ Ｈ Ｎ Ｐ１ 转染至气管粘膜上皮细胞后能得到有效表达。     

稳定表达绿色荧光蛋白的COS7细胞系的筛选和鉴定

目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的COS-7细胞系,为相关实验对照提供方便. 方法 常规方法培养COS-7细胞,将含pEGFP-N3基因的质粒转染COS-7细胞,G418抗性筛选,并用荧光显微镜进行跟踪检测,挑选耐药单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株. 结果 G418筛选的最适浓度为500 μg/mL.筛选到的COS7 -GFP克隆荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光,细胞的生物学性状保持稳定,通过Western blot能检测到GFP蛋白. 结论 成功筛选并建立了稳定表达的COS7 -GFP细胞系.     

高温阻滞HeLa细胞于G1期并引起G1期细胞凋亡

目的探讨高温阻滞HeLa细胞周期进程及其与细胞凋亡的关系。方法HeLa细胞经培养增殖后分为37℃、40℃、43℃和45℃共4个温度组。每组分别在0．5、1、2和4h共4个时间点取材，经PI染色在流式细胞仪上检测4种温度条件下，4个时间段时HeLa细胞的凋亡指数和在各细胞周期时相中的指数。结果37℃时，60％的细胞处于G，期，S期及Gz／M期的HeLa细胞分别为17％和18％，约5％细胞凋亡。40℃时，细胞周期受到抑制，G1期的HeLa细胞明显增加，达73％，S及G2／M期的细胞分别为9％和15％，凋亡细胞占3％。43℃时，不但细胞周期受阻，而且凋亡细胞极明显地增加，达19％，G1期细胞为61％，S期细胞为9％，G2／M期细胞为11％。45℃时，细胞凋亡数和在细胞周期各时相的细胞数与40℃时的分布相似。结论温度升至40℃时对HeLa细胞的增殖活动有明显的抑制，使HeLa细胞滞留于G1期。43℃时除了细胞周期受抑制外，凋亡细胞明显增加，这可能是由于细胞周期受阻和高温启动了凋亡机制而诱发了细胞凋亡，凋亡的细胞主要为G1期的细胞。45℃以上的高温对HeLa细胞的杀伤失去对周期时相的选择性，均等地杀伤细胞周期各时相的细胞。