构建人热休克蛋白70基因重组腺病毒载体及鉴定

背景:腺病毒载体作为低毒高效的基因载体己被广泛应用,但是人热休克蛋白70基因腺病毒载体较为少见.目的:构建重组人热休克蛋白70基因的腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达.方法:采用AdMax腺病毒系统将外源基因人热休克蛋白70基因重组入腺病毒载体中,转染人胚肾293细胞并重组包装出毒,检测外源基因的表达和病毒滴度.结果与结论:观察转染后的人胚肾293细胞出现明显细胞病变效应后,收获并纯化重组病毒;荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况良好,Western blot检测人热休克蛋白70蛋白表达良好,收获病毒的滴度为1×1011 efu/mL,证明实验己成功构建携带人热休克蛋白70基因的重组腺病毒载体.     

含人Apelin-R重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP的构建

目的 构建含有人Apelin受体(Apelin-R)基因的pDC316-apelinR-EGFP腺病毒穿梭载体,为糖尿病相关基因Apelin的体内研究提供新方法.方法 PCR方法分别扩增Apelin-R基因,测序正确后与载体pDC316-EGFP连接,构建重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP;脂质体法与腺病毒骨架载体共转染HEK293细胞进行重组腺病毒包装,稀释法测定腺病毒滴度.RT-PCR和Western blot方法检测Apelin-R的表达.结果 限制性核酸内切酶鉴定及测序结果均证明Apelin-R基因成功扩增并克隆到重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP.在HEK293中成功包装出含Apelin-R的腺病毒Ad-apelinR-EGFP,病毒滴度为3.1×109 TCID50/ml,感染Ad-apelinR-EGFP的HEK293E细胞中可检测到Apelin-R的mRNA和蛋白表达.结论 成功构建了真核表达载体pDC316-apelinR-EGFP,得到了表达绿色荧光蛋白的Apelin-R腺病毒,该病毒有望用于糖尿病的体内研究实验.     

血管生成抑制因子METH-1腺病毒载体的构建

目的:利用大肠杆菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度的病毒。方法:实验于2004-08/2005-08在中山大学眼科中心国家重点实验室完成。自真核表达载体pMD18-T-METH1中酶切出METH1基因,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-METH1,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-METH1。以pAd-METH1为模板,经DNA测序正确后,用PacI酶切线性化pAd-METH1,转染293细胞,包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察转染细胞增强型绿色荧光蛋白的表达,采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定。结果:①构建了携带外源基因人血管生成抑制因子的穿梭载体pAdTrack-CMV-METH1。②制备了METH1重组腺病毒载体pAdEasy-METH1。③METH1重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制。结论:应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体,制备高滴度重组病毒,为METH1基因功能研究奠定了基础。     

重组腺病毒载体pDC316-hIL-24的构建及病毒滴度测定

目的构建重组腺病毒载体pDC316-hIL-24,并测定病毒滴度。方法从HEK293细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-24基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglⅡ和HindⅢ双酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭质粒中。构建重组穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC316-hIL-24,经HEK293细胞扩增,TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果成功构建出表达hIL-24基因的重组腺病毒载体（pDC316-hIL-24）,获得了高滴度表达hIL-24基因的重组腺病毒。结论重组腺病毒表达载体（pDC315-hIL-24）的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肿瘤的转基因治疗研究。      

人分化抑制因子3重组腺病毒的制备及鉴定

目的构建人细胞分化抑制因子3(Id3)重组腺病毒载体,制备并鉴定人Id3重组腺病毒,为研究Id3基因在细胞中的表达及其对细胞功能的影响奠定基础。方法以pUC57-Id3为模板扩增人Id3基因,克隆到质粒pUC18中,pUC18-Id3经EcoR I和HindⅢ双酶切补平之后与载体pAxCAwtit连接,构建重组粘粒载体pAxCAwtit-Id3,包装试剂盒包装重组粘粒,转染大肠埃希菌,鉴定正确后大量制备重组pAxCAwtit-Id3,经酶切线性化后,用脂质体法转染HEK293A细胞,包装成重组腺病毒Ad-Id3,制备高滴度的重组腺病毒Ad-Id3,利用TCID50法计算重组腺病毒滴度,经RT-PCR及western blot检测Id3基因的表达。结果Id3基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.8×1010PFU/ml,用RT-PCR检测到Id3基因的转录产物,westernblot检测到Id3在A549细胞中的高水平表达。结论成功构建Ad-Id3重组腺病毒载体,并在A549细胞中得到高效表达。     

血管生成抑制因子METH-1腺病毒载体的构建

目的：利用大肠杆菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度的病毒。方法：实验于2004—08／2005-08在中山大学眼科中心国家重点实验室完成。自真核表达载体pMD18-T—METH1中酶切出METH1基因，亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，形成转移质粒pAdTrack-CMV-METH1，在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组，得到重组腺病毒载体pAd-METH1。以pAd-METH1为模板，经DNA测序正确后，用PacⅠ酶切线性化pAd-METH1，转染293细胞，包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察转染细胞增强型绿色荧光蛋白的表达，采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定。结果：①构建了携带外源基因人血管生成抑制因子的穿梭载体pAdTrack-CMV-METH1。②制备了METH1重组腺病毒载体pAdEasy—METH1。③METH1重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制。结论：应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体，制备高滴度重组病毒，为METH1基因功能研究奠定了基础。     

重组腺病毒载体Ad5-hTRX-EGFP的构建及其表达

本研究旨在构建并制备人硫氧还蛋白(hTRX)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因腺病毒载体Ad-hTRX-EGFP,感染HEK293细胞,为基因治疗提供实验基础。设计含有NotⅠ和EcoRⅤ酶切位点的引物,PCR扩增hTRX,将扩增产物连接到带有EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP,利用Lipofectamine2000脂质体的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHG lox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包装扩增病毒,用氯化铯高速梯度离心、纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用流式细胞仪测定感染HEK293细胞的效率,Western blot方法验证细胞表达hTRX蛋白。结果显示,重组腺病毒质粒经PCR和NotⅠ、EcoRⅤ酶切鉴定,证实含有hTRX基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5.558×1010pfu/ml。病毒成功感染HEK293细胞,MOI=100时,感染效率达92.25%。经Western blot方法验证表明,感染后的HEK293细胞高表达hTRX蛋白。结论:应用细胞内同源重组方法成功构建了含hTRX基因的重组腺病毒载体,制备获得高滴度的病毒,能高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白,为后续研究奠定了基础。     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义。目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率。方法：采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV。线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度。用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体αmRNA、蛋白表达。结果与结论：成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×1011pfu/L。重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高。该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础。     

人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率

目的:构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体,并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率。方法:实验于2004-03/2005-04在第三军医大学完成。采用基因工程技术,将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒,将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度,应用Westernblot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达。结果:①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度可达2.5×109pfu/mL,具有很强感染能力。②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48h,Westernblot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达。结论:应用细菌内同源重组法,可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体,且能高效转染大鼠骨髓基质细胞。     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达☆

背景:过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义. 目的:构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率. 方法:采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV.线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒.用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度.用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体α mRNA、蛋白表达. 结果与结论:成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×1011 pfu/L.重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高.该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础.     

构建含人胰岛素样生长因子基因腺病毒载体及在兔骨髓间充质干细胞的表达

背景:Adeasy腺病毒系统是由T.C.He等改良的基于E1和E3区缺失的重组腺病毒系统.相比传统的在真核细胞中收集和测试重组后的病毒颗粒的方法,其采用了在细菌中通过质粒同源重组的方法获得病毒颗粒,从而简化了腺病毒的构建和测试流程,而且,它能够通过整合入病毒基因组的标记基因GFP实现对转染细胞的荧光追踪,从而在近年来被广泛用作基因转染的载体.目的:用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,并检测其在靶细胞骨髓间充质干细胞中的表达.设计:重复测量实验.单位:重庆医科大学儿科研究所.方法:实验于2004-11/2005-03在重庆医科大学儿科研究所完成.①重组腺病毒载体的构建:从pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短的目的基因hIGF-1,按Ad-easy腺病毒系统同源重组的标准步骤获得重组阳性质粒pAd-hIGF-1和重组空白质粒pAd-0,电穿孔转化感受态XL-1细菌,扩增后获得重组腺病毒质粒,去内毒素质粒大抽试剂盒大量抽提质粒备转化HEK293细胞;②腺病毒包装及扩增:Pae Ⅰ酶切线性化pAd-hIGF-1和pAd-0,纯化后转染HEK293细胞,观察GFP的表达,待细胞90%以上漂浮后,冻融法裂解细胞收集第一轮病毒上清即为Ad-hIGF-1(重组目的腺病毒)和Ad-0(重组空白腺病毒),将收集病毒上清重复多次感染293细胞(乒乓交互感染)以提高病毒滴度.③骨髓间充质干细胞的培养及转染!采用通用的标准密度梯度离心法分离纯化兔MSCs于37℃、5%CO2孵箱培养,隔天换液,10 d细胞融合达70%～80%,贴壁紧密,细胞形态均一,呈典型的涡漩状排列,传代至第3代按病毒感染复数分组转染.主要观察指标:①腺病毒载体的构建及鉴定.②目的基因hIGF-1在HEK293的表达及病毒滴度.③目的基因在骨髓间充质干细胞中的表达.结果:①重组腺病毒的鉴定:从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中顺利扩增出约400 bp大小的清晰条带,与预期相符;pMDl8-hIGF-1测序结果经Blast2.0比对与公布序列一致性99.9%(281位碱基同义突变,未影响氨基酸翻译:ggffggc-Gly);pAdtraek-CMV空载体和pAdtraek-MGF-1分别双酶切(Kpn Ⅰ和HindⅢ)鉴定正确.质粒pAdEasey-1和Ad-hIGF-1用Pac I酶切鉴定鉴定正确.证实病毒质粒同源重组成功.②荧光表达及滴度测定:重组质粒pAd-hIGF-1经Pac Ⅰ线性化后转化HEK293E细胞,48 h后在荧光显微镜下即可见GFP的表达,72h表达最强.约5-7 d后细胞出现病毒感染的特征性CPE,由此计算出腺病毒滴度为3.0× 109 pfu/mL.⑨靶细胞的感染及表达效率:病毒转染骨髓问充质干细胞24 h后观察到绿色荧光的表达,72 h左右荧光达到最强.免疫细胞化学SP法DAB染色显示在感染的骨髓间充质干细胞胞浆中有棕黄色阳性颗粒出现.SDSPAGE电泳在7.8 KD附近出现明显条带,与实际人胰岛素样生长因子-1分子量7.6 kD相符,证实转染含目的基因的重组腺病毒后的骨髓间充质干细胞中有较高量的人胰岛素样生长因子-1的表达.结论:本实验用Adeasy系统和扩增的截短型外源性基因hlGF-1构建了具有较强感染能力的腺病毒载体pAd-MGF-1,免疫细胞化学和Western Blot等方法检测证实了目的基因在靶细胞骨髓间充质干细胞得到了理想表达.     

生长抑制因子4基因表达对K562细胞生长的影响

目的 研究生长抑制因子4（ING4）基因表达对K562细胞增殖的影响。方法 将经过定点突变技术人源化改造的ING4（鼠→人）生长抑制因子4基因酶切并连接到pAdTrack-CMV转移质粒上，然后与腺病毒质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack—CMV—hING4，将它转染QBI-293A细胞后收获重组腺病毒Ad—hING4（以下简称为Ad-ING4）。将Ad-ING4感染K562细胞，光学显微镜下观察病毒感染前后细胞形态的变化，免疫细胞化学分析凋亡因子的改变，激光扫描共聚焦显微镜观察K562细胞的凋亡，流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率。结果 成功构建了人ING4腺病毒质粒，获得高滴度的重组腺病毒Ad-ING4，用它感染K562细胞72h后，FCM法测定细胞凋亡率为19．7％，与空病毒对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01），ING4基因能下调K562细胞bcl-2的表达并上调bax的表达，多种方法检测结果表明ING4基因能抑制K562细胞生长，诱导凋亡。结论 重组腺病毒Ad—ING4可以显著抑制K562细胞的生长。     

klf4反义基因腺病毒载体的构建和鉴定

本研究针对klf4基因,利用AdEasy腺病毒载体系统构建人klf4反义基因重组腺病毒载体。klf4基因片段反向克隆到穿梭质粒pShuttle—CMV,利用同源重组技术在大肠杆菌BJ5183内构建重组腺病毒Ad-反义klf4,酶切线性化重组载体,并在293细胞中扩增、制备重组病毒。经限制性酶切、PCR扩增和测序检测鉴定,证明Ad-反义klf4重组腺病毒基因正确插入后,将Ad-反义klf4转染人原代脐静脉内皮细胞,采用real—timePCR、Western blot方法观察其对内皮细胞中KLF4表达的抑制效果。结果表明：成功构建了重组klf4反义基因腺病毒载体,重组腺病毒可明显降低细胞内klf4mRNA和KLF4蛋白表达。结论：成功构建了Ad-反义klf4重组腺病毒载体,这为进一步研究klf4的生物学功能及应用提供物质基础。     

骨髓间充质干细胞中大鼠白细胞介素10复制缺陷型重组腺病毒的表达

背景:研究显示,白细胞介素10在脓毒症等炎性疾病发挥了抑制炎症反应、促进疾病转归的重要作用。目的:构建大鼠白细胞介素10重组腺病毒,并以骨髓间充质干细胞为基因载体,观察外源基因在细胞中的表达情况。方法:采用反转录-聚合酶链反应方法从SD大鼠新鲜脾脏组织中提取出的总RNA中克隆大鼠白细胞介素10基因,通过AdEasy系统成功包装、扩增并纯化出含目的基因的重组腺病毒颗粒。取大鼠骨髓细胞,利用密度梯度离心法和贴壁法分离并扩增骨髓间充质干细胞,并使用流式细胞仪进行表型鉴定。以不同感染倍数的Ad.rIL-10/Ad.GFP感染骨髓间充质干细胞,在荧光显微镜下观察感染效率,并用反转录-聚合酶链反应和Weaternblot方法检测目的基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。结果与结论:成功构建了重组腺病毒Ad.rIL-10,计算病毒滴度为6.0×1010pfu/mL。重组腺病毒Ad.rIL-10对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率,当感染复数=200时为70%。提示含外源基因大鼠白细胞介素10的骨髓间充质干细胞持续高效地表达目的基因,是基因治疗的良好细胞载体。     

重组分泌型TRAIL腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达分泌型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因的重组腺病毒载体。方法采用PCR技术从人肝脏cDNA文库中扩增出编码114-281位氨基酸的TRAIL基因片段。将扩增的TRAIL插入含有分泌性信号肽IL-2的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-IL-2中,将其命名为pAdTrack-CMV-IL-2-TRAIL。pAdTrack-CMV-IL-2-TRAIL经PmeⅠ线性化后,电转化入转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAd-sTRAIL。经HEK293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-sTRAIL,氯化铯密度梯度离心纯化Ad-sTRAIL病毒,并测定病毒滴度。采用RT-PCR法和免疫荧光技术分别检测目的基因的表达。结果纯化后的Ad-TRAIL病毒滴度为3.12×10^15pfu/L。经RT-PCR扩增出长104 bp的基因片段。免疫荧光检测到了目的基因在U251细胞的高效表达。结论成功构建了重组分泌型TRAIL腺病毒载体,为下一步应用于脑肿瘤的基因治疗打下了基础。     

人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

背景：人端粒酶催化亚基与c-myc在喉鳞状细胞癌中有密切的相关性。目的：构建含有c-myc启动子的人端粒酶催化亚基的重组腺病毒载体,观察人端粒酶催化亚基在细胞中表达后对细胞增长的影响。方法：按照人工合成中反向转录的方法设计基因合成引物,用复式PCR获得目的片段ashTERT（322bp）。将片段ashTERT克隆到pUC57（2.7kb）克隆载体,然后热激转化到E.coli感受态细胞中,菌检、PCR、鉴定阳性克隆后,菌液放大培养,提取质粒pUC57-ashTERT,然后对质粒进行测序。将目的基因片段亚克隆到穿梭载体pshuttle-CMVneo上,然后构建重组腺病毒质粒pAd-ashTERT。转入293细胞中进行病毒包装、鉴定和滴度测定。结果与结论：提取质粒pUC57-ashTERT,测序符合序列要求。质粒pUC57-ashTERT转入293细胞后,成功构建了有较强感染能力的含人端粒酶催化亚基基因的重组腺病毒载体。     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体（Ad-BMP-2/GFP）转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。