老年大鼠组织mRNA分析中内参基因的选择

 目的 探讨用于老年大鼠组织基因mRNA表达分析的内参基因选择。方法 用实时反转录PCR技术评价5个管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶（G3pd）、?-肌动蛋白 (ACTB)、H3组氨酸3B（H3f3b）、酸性核糖体磷蛋白P0（Arbp）和18S核糖体RNA (18S)的表达水平。结果 老年大鼠肾组织中表达最稳定的是管家基因ACTB,心脏和肺组织中表达最稳定的是G3pd;而Arbp在不同组织之间的表达差异最小。结论 老年大鼠组织间基因表达mRNA分析应使用至少两个参照基因：一个是核糖体基因18S,另一个适合的内参基因是Arbp。     

实时PCR法验证心肌梗死大鼠模型正常组织及心肌梗死组织与血管新生途径相关差异基因的表达****

背景：研究表明急性心肌梗死后血管新生过程受众多基因调控。 目的：观察急性心肌梗死后与血管新生途径相关的差异基因的表达。 方法：建立急性大鼠心肌梗死模型,在基因芯片结果基础上选取5个特定的表达差异基因：分泌磷酸蛋白1、趋化因子受体2、人血管生成素样蛋白4、CXC趋化因子配体5和白细胞介素1β。采用实时PCR法验证5个基因在心肌梗死大鼠模型正常组织及心肌梗死组织中的表达。 结果与结论：分泌磷酸蛋白1、趋化因子受体2和人血管生成素样蛋白4在心肌梗死急性期表达上升显著(P < 0.05),呈时间依赖性。CXC趋化因子配体5和白细胞介素1β基因表达水平呈低位波动,变化不显著。其中分泌磷酸蛋白1与趋化因子受体2与急性心肌梗死后炎性、细胞黏附、迁移和趋化相关,而人血管生成素样蛋白4与血管新生和细胞分化相关。     

大鼠急性心肌梗死模型的制备

许多实验室在制作小型动物心肌梗死(myocardial infarction,MI)模型时要使用气管插管和呼吸机辅助呼吸[1～2],其操作复杂,总死亡率高.本实验就这一特点对已往制作的动物MI模型加以改进,使制作大鼠MI模型的方法简单、有效,并可对MI后大鼠进行超声心动图检测.     

冠心病相关基因表达分析中管家基因表达水平比较

比较β-肌动蛋白（β-actin）、信号识别颗粒14（SRP14）和18S-rRNA等3个管家基因在冠心病（CAD）患者和健康对照人群中的表达差异。提取外周血RNA,经逆转录和聚合酶链反应,应用荧光标记技术及GenomeLab GeXP基因表达分析系统检测3个管家基因的表达水平。结果发现3个管家基因在对照组和CAD组中β-actin表达的差异最小,SRP14次之,18S-rRNA的表达差异较大,提示管家基因β-actin和SRP14可作为检测CAD相关基因表达水平的内部参考基因。     

制备心肌梗死大鼠模型方法的改进

背景：心肌梗死动物模型对于研究人类冠心病的发病机制、病理生理改变以及对治疗方法的评估具有重大意义,提高存活率及制模成功率是许多研究者追求的目标。 目的：对大鼠心肌梗死模型制备方法进行改进。 方法：选取Wistar大鼠100只,分为模型组(n=80)和假手术组(n=20)。3%戊巴比妥钠腹腔麻醉,气管切开,小动物呼吸机辅助呼吸,左侧胸部开胸,第4肋间入胸,结扎左冠状动脉前降支。假手术组大鼠只穿线不结扎。逐层关胸,撤除呼吸机,拔除气管插管。为防止窒息,不缝合气管及颈部切口。 结果与结论：通过观察心脏形态及苏木精-伊红染色鉴定证实心肌梗死模型制作成功率为98.6%。模型组术后3周成活率为88.75%,共死亡9只,其中术中及术后24 h内死亡7只,后期死亡2例,假手术组存活率为100%。通过对大鼠心肌梗死模型制作方法的改进,如麻醉方法、气管切开时采用纵行切口、术后不缝合气管切口,开关胸方法的改进等,提高了手术成功率及大鼠存活率。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

大鼠急性心肌梗死模型制作方法的改良

目的:为大鼠急性心肌梗死模型制作提供更快、更稳定的方法。方法:所有大鼠按气管插管方法-开胸扩开第3肋间隙方法随机分为:灌胃针-开睑器组(传统组)、灌胃针-缝合线开睑器组、自制插管-开睑器组、自制插管-缝合线开睑器组(改良组),麻醉后分别用相应方法行气管插管和开胸,暴露术野,结扎冠状动脉前降支,记录每组大鼠气管插管时间、气管插管次数、手术时间、术后呼吸道哮鸣音发生率、肺损伤程度和死亡率。术后第2天和第4天随机取各组大鼠5只,行心电图、左心室插管和心肌染色检测模型心功能及心肌梗死面积。结果:使用自制插管的两组插管时间和次数与使用灌胃针的两组差别无统计学意义,但术后呼吸道哮鸣音发生率及死亡率明显低于使用灌胃针两组;使用缝合线开睑器的两组手术时间、术中肺损伤程度及术后死亡率明显低于使用开睑器的两组;各组间心功能及心肌梗死面积差异无统计学意义,改良组组内心功能及梗死面积差异性较小。结论:改良后大鼠急性心肌梗死模型制作方法简单、成活率较高、模型质量较高,值得推广。     

大鼠急性心肌梗死后的心肌细胞凋亡和凋亡相关基因表达的变化

目的： 观察大鼠急性心肌梗死（AMI）后的心肌细胞凋亡和caspase-3、Bcl-2和Bax表达的变化。 方法: 105只雌性SD大鼠，随机取78只结扎左冠状动脉建立AMI模型，24 h存活43只作为心肌梗死组（MI组）；另27只设为假手术组（S组）；两组再按观察时点随机分为48 h和4周两亚组，即：MI 48 h（n=11）和MI 4周（n=13）组，S48 h（n=10）和S4周（n=10）组。末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术（TUNEL）和DNA凝胶电泳检测心肌细胞凋亡。免疫组化方法和Western blotting检测caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。 结果： MI 48 h组动脉收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、平均压（MAP）、左心室收缩压（LVSP）和左心室内压最大上升下降速率（±dp/dt）均显著低于S组（P<0.05, P<0.01），左心室舒张末压（LVEDP）显著高于S组（P<0.05）；MI 4周组除SBP、DBP和MAP无显著差异（均P>0.05）外，上述其它指标的变化与MI 48 h组相同，且LVEDP升高更为显著（P<0.01）；MI 48 h和4周两组梗死/疤痕区、梗死边缘区和非梗死区的心肌细胞凋亡指数均显著升高P<0.05,P<0.01），心肌细胞中“凋亡执行因子”caspase-3和“凋亡促进基因”Bax的表达亦均显著增高（P<0.05,P<0.01），而“凋亡抑制基因”Bcl-2仅在MI 48 h组梗死区心肌细胞中表达增加，“抑制凋亡复合基因”Bcl-2/Bax的比值仅在MI 48 h组降低。 结论： 大鼠AMI后，梗死区及其边缘区和非梗死区均有心肌细胞凋亡发生，伴“凋亡执行因子”caspase-3和“凋亡促进基因”Bax的表达增加；AMI早期，“凋亡抑制基因”Bcl-2在梗死区表达增加，但“抑制凋亡复合基因”Bcl-2/Bax的比值下降。     

心肌梗死模型大鼠心肌组织中白细胞介素17的表达**☆◆

背景：白细胞介素17在多种心血管疾病中如自身免疫性心肌炎、病毒性心肌炎、扩张型心肌病、不稳定型冠心病等表达增加,在心血管病慢性炎症性过程起到了一定作用。 目的：分析白细胞介素17在心肌梗死大鼠心肌中的表达特点。 方法： 采用液氮冷冻法建立大鼠心肌梗死模型,将造模成功的66只大鼠按照不同的观察时间随机摸球法均分为1,3 ,7,14,28,56 d组,另设对照组8只。采用酶联免疫吸附测定法、免疫荧光激光共聚焦技术及蛋白免疫印迹法检测白细胞介素17的表达。 结果与结论：造模成功率为73%。大鼠心肌梗死的发生发展过程中,白细胞介素17在心肌组织大量表达,且随着时间变化而逐渐升高,在28 d时表达最为显著。说明白细胞介素17作为一种强力的促炎症因子在心肌梗死大鼠心肌组织中大量表达,有可能与心肌梗死后的心室重塑及心律失常的发生有关。 关键词：白细胞介素17;心肌梗死;大鼠;模型;心肌组织 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.020     

大鼠催乳素瘤形成过程中催乳素基因的表达

给ＳＤ大鼠皮下埋植内含１７β－雌二醇硅橡胶管３０、６０、１２０天后，发现大鼠垂体重量随给药时间延长呈持续性增加；用放射免疫法测定血浆催乳素含量，亦依次明显升高；用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交方法检测垂体细胞中ＰＲＬ基因，发现ＰＲＬ ｍＲＮＡ含量也依次显著增加，但其增加却远低于血浆ＰＲＬ含量的增加，提示β－雌二醇除了促进ＰＲＬ基因的转录外，还可能增加ＰＲＬ ｍＲＮＡ的翻译效率。     

大鼠心肌梗死后心力衰竭模型的建立及评价

目的 探讨大鼠心肌梗死后慢性心力衰竭模型建立方法及指标评价体系.方法 SD大鼠麻醉后开胸,手术组结扎左侧冠状动脉前降支,制备心梗后心衰模型,假手术组采取仅在相同结扎位置穿针,不结扎的方法.术后8周处死.术前、术后5分钟、处死前分别记录标准肢体导联心电图、心脏超声,评价电生理、心功能指标;处死后采用苏木素-伊红(HE)染色、Masson染色评价病理改变;使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中B型尿钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)浓度.结果 该研究中手术组及假手术组手术存活率分别为72.5％、75.0％;手术组术后5分钟心电图Ⅰ、Ⅱ、aVL导联出现ST段抬高,T波高耸的典型心肌梗死心电图改变,术后8周ST段、T波回落;此外,术后8周的手术组左室射血分数和左室短轴缩短率均低于假手术组(均为P＜0.01),HE染色可见残存心肌细胞、成纤维细胞、毛细血管增生等慢性纤维化表现,Masson染色显示梗死区残存心肌纤维之间纤维瘢痕组织形成;血清BNP水平也明显高于假手术组(均为P＜0.01).结论 冠脉结扎法建立心梗后心衰模型存活率高、简单易行,采取的心电、心功能、病理、检验评价指标获取简单、重复性强,便于对模型进行筛选.     

小鼠哮喘模型颈静脉-结状神经节内参基因的筛选

目的　观察12个常用看家基因在正常小鼠和哮喘小鼠颈静脉-结状神经节的表达变化,选择合适的内参基因为进一步基因表达分析研究得到可信数据提供依据。 方法　雌性BALB/c小鼠随机分为哮喘模型组和对照组,制备哮喘模型,用实时荧光定量PCR技术,经geNorm及Normfinder程序分析,评价了12个常用看家基因CYC1、UBC、RPL13、YWHAZ、18srRNA、B2M、SDHA、ATP5B、CANX、　ACTB、EIF4A2和GAPDH在小鼠颈-结状神经节的表达稳定性。 结果 12个候选看家基因在小鼠神经节的表达差异较大,其中GAPDH、18srRNA、CANX、ACTB和EIF4A2表达相对稳定,而CYC1、UBC和RPL13的表达在两组小鼠神经节变化幅度较大,结合两种分析证实GAPDH是其中最稳定的内参基因。 结论 本研究结果提示GAPDH是研究哮喘小鼠和正常小鼠颈静脉-结状神经节基因表达的最佳内参基因,同时也为进一步认识在不同实验模型确定适宜内参基因的重要性提供依据。     

Identification of best housekeeping genes for the normalization of RT-qPCR in human cell lines

The identification of the best reference gene is a critical step to evaluate the relative change in mRNA expression of a target gene by RT-qPCR. In this work, we evaluated nineteen genes of different functional classes using Real Time Human Reference Gene Panel (Roche Applied Sciences), to identify the internal housekeeping genes (HKGs) most suitable for gene expression normalization data in human cell lines. Normal cell lines CCD-19LU (lung fibroblast), HEK-293 (epithelial cell of embryonic kidney), WI-26 VA4 (lung fibroblast), and human cancer cells, BT-549 (breast cancer), Hs 578T (breast cancer), MACL-1 (breast cancer), HeLa (cervical carcinoma), U-87 MG (glioblastoma/astrocytoma), RKO-AS45–1 (colorectal carcinoma), and TOV-21G (ovarian adenocarcinoma) were cultivated according to manufacturer’s protocol. Twelve candidate reference genes were commonly expressed in five cell lines (CCD-19Lu, HEK-293, RKO-AS45–1, TOV-21G, and U-87 MG). To verify the expression stability, we used the RefFinder web tool, which integrates data from the computational programs Normfinder, BestKeeper, geNorm, and the comparative Delta-Ct method. The ACTB was the most stable reference gene to the CCD-19Lu and HEK-293 cells. The best combination of HKGs for the RKO-AS45–1 and TOV-21G cell lines were B2M/GAPDH and PBGD/B2M, respectively. For the U-87 MG cells, GAPDH and IPO8 were the most suitable HKGs. Thus, our findings showed that it is crucial to use the right HKGs to precise normalize gene expression levels in cancer studies, once a suitable HKG for one cell type cannot be to the other.     

Livin基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗对急性心肌梗死大鼠心功能的影响

 目的: 探讨livin修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)移植改善急性心肌梗死大鼠心功能的作用及livin和促凋亡蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9在感染后的表达情况。方法: 通过全骨髓培养法分离培养骨髓间充质干细胞,感染携带livin基因的重组腺病毒后用流式检测其对MSCs凋亡的影响。通过Western blot法分别检测livin、caspase-3、caspase-7和caspase-9的蛋白表达情况。采用冠状动脉左前降支结扎法建立心肌梗死模型,然后实验分4组进行:无胎牛血清的DMEM组;单纯干细胞治疗组(MSCs组);空载腺病毒转染干细胞组(rAd-control/MSCs)组;livin基因转染干细胞组(rAd-livin/MSCs组)。1个月后采用生理仪记录各组大鼠左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(+dp/dt_max)和左室内压最大下降速率(-dp/dt_max)来评价大鼠心功能。结果: rAd-livin/MSCs组凋亡率较MSCs组和rAd-control/MSCs组显著降低(P<0.05);rAd-livin/MSCs组抗凋亡蛋白livin明显上升(P<0.05),促凋亡蛋白caspase-3、caspase-7及caspase-9表达显著下降(P<0.05);细胞移植后1个月,rAd-livin/MSCs组心功能比MSCs组改善更明显(P<0.05)。结论: rAd-livin感染MSCs后可促进抗凋亡蛋白livin的表达,同时降低促凋亡蛋白caspase-3、caspase-7和caspase-9的表达及细胞凋亡率。rAd-livin/MSCs移植能进一步改善心肌梗死大鼠心功能。     

Regulation of genes involved in dopamine transporter modulation by acute cocaine in rat striatum

It is well established that acute administration of psychostimulants alters dopamine transport. However, the exact mechanism of this modulation is still unknown. In this study we examined the mRNA levels of several proteins involved in the various proposed processes following cocaine administration. The expression levels of several immediate early genes were also studied. This was performed in rat striatum using real-time quantitative PCR. As expected, a marked increase of the immediate early genes Fos, Egr1 and Egr3 was observed. Egr2 was also found up-regulated. Among the different genes studied only Synaptotagmin4 in the SNARE family and Synphilin1 in the synaptic vesicles binding family were modulated by acute cocaine treatment. Interestingly, acute amphetamine treatment did not increase either Synaptotagmin4 and Synphilin1 mRNA levels, although increases in early genes expression were noted.     

Effect of amitriptyline on the messenger RNA of thyroid hormone-responsive genes in rat cerebral tissue

To determine the molecular mechanisms of the potentiating effect of thyroid hormones (TH) on the therapeutic efficacy of tricyclic antidepressants (TCA), the expression of two known TH-responsive mRNAs was measured in control rats and rats treated with triiodothyronine (T3, 10 microg/100 g for 10 days), amitriptyline (10 mg/kg for 10 days), or combined T3 and amitriptyline. Northern blot analysis was carried out to measure the cerebral tissue content of a novel translational repressor (NAT-1) and another thyroid hormone-responsive (THR) mRNA. Rats treated with the combination of T3 and amitriptyline had significantly higher NAT-1 expression (2691.1+/-134.1 arbitrary units) than rats treated with T3 only (1688.5+/-77.8) or with amitriptyline only (1452.5+/-87.5) or the untreated control rats (731.3+/-23.0), P<0.01. Amitriptyline treatment did not alter the expression of THR mRNA or THR protein in either control or T3-treated rats. It is concluded that alterations in the expression of selective T3 responsive genes in cerebral tissue could be a mechanism of the known T3 potentiation of the therapeutic efficacy of TCA.     

MSC-based VEGF gene therapy in rat myocardial infarction model using facial amphipathic bile acid-conjugated polyethyleneimine

Mesenchymal stem cells (MSCs) have attracted much attention in regenerative medicine owing to their apparent usefulness as multi-potent replacement cells. The potential of MSC therapy can be further improved by transforming MSCs with therapeutic genes that maximize the efficacy of gene therapy and their own therapeutic ability. Since most conventional transfection methodologies have shown marginal success in delivering exogenous genes into primary cultured cells, efficient gene transfer into primary MSCs is a prerequisite for the development of MSC-based gene therapy strategies to achieve repair and regeneration of damaged tissues. Herein, facially amphipathic bile acid-modified polyethyleneimine (BA-PEI) conjugates were synthesized and used to transfer hypoxia-inducible vascular endothelial growth factor gene (pHI-VEGF) in MSCs for the treatment of rat myocardial infarction. Under the optimized transfection conditions, the BA-PEI conjugates significantly increased the VEGF protein expression levels in rat MSCs, compared with traditional transfection methods such as Lipofectamine™ and branched-PEI (25 kDa). Furthermore, the prepared pHI-VEGF-engineered MSCs (VEGF-MSCs) resulted in improved cell viability, particularly during severe hypoxic exposure in vitro. The transplantation of MSCs genetically modified to overexpress VEGF by BA-PEI enhanced the capillary formation in the infarction region and eventually attenuated left ventricular remodeling after myocardial infarction in rats. This study demonstrates the applicability of the BA-PEI conjugates for the efficient transfection of therapeutic genes into MSCs and the feasibility of using the genetically engineered MSCs in regenerative medicine for myocardial infarction.     

ADA—LacZ融合基因直接注射导入大鼠骨骼肌后的表达

ＡＤＡ－ＬａｃＺ融合基因经直接注射导入大鼠骨骼肌内，用Ｘ－ｇａｌ和ＡＤＡ组化染色方法检测的结果表明：在大鼠骨骼肌细胞中，可检测到由ｐＦＰ表达的ＡＤＡ和β－ｇａｌ活性。这提示有望探索出一条对某些遗传性疾病、肿瘤及其它多种疾病导入外源基因实施基因治疗的便捷、可行的途径