靶向调控破骨细胞活性治疗骨质疏松的研究进展

骨质疏松症是以骨组织微结构退行性变和骨量丢失为显著特征的一种全身性代谢性骨病,结构的改变引起骨生物力学特性发生改变,在外力作用下骨折发生率大大增加。骨骼结构在一生中时刻在发生精微的变化,需要成骨细胞和破骨细胞的参与,其中破骨细胞参与骨吸收,当骨吸收多于骨形成时就会削弱骨强度,引起骨质疏松,因此抑制骨吸收便成为治疗骨质疏松的重要途径。本文从激素、细胞因子、益生菌、中草药有效成分及其信号通路等重要的破骨细胞活性调节点入手进行综述,以期为骨质疏松破骨细胞的靶向治疗提供新的思路。     

白细胞介素1刺激破骨细胞性骨吸收作用的实验研究

目的：了解白细胞介素1β（IL－1β）在破骨细胞性骨吸收中的刺激作用及其相应的作用机制。方法：分别将新生大鼠破骨细胞单独以及和成骨细胞联合接种于预置象牙片的培养板中。24h后培养液中加入不同浓度的IL－1β。继续培养48h,然后取出象牙片,超声处理后行甲苯胺蓝染色,光镜下观察骨吸收陷窝的数目并计算其部面积。结果：IL－1β能够明显增加坡骨细胞和成骨细胞联合培养组象牙片上吸收陷窝的数目和面前,且刺激作用呈剂量依赖性,但对单独培养的破骨细胞无明显刺激作用。结论：IL－1β的刺激骨吸收作用由成骨细胞所介导,而非直接作用于破骨细胞。     

氟对兔体外破骨细胞性骨吸收影响的研究

目的:探讨不同剂量氟化钠 (Na F)对兔体外破骨细胞功能的影响。方法:从新生兔四肢长骨中分离破骨细胞 ,采用体外培养破骨细胞的方法 ,用倒置相差显微镜和计算机图像分析技术 ,测量在含有不同浓度 (1.0 0×10 - 7～ 1.0 0× 10 - 4m ol/ L )的 Na F培养液中骨吸收陷窝数和表面积。结果:染氟 1.0 0× 10 - 6 、1.0 0× 10 - 5和 1.0 0×10 - 4m ol/ L 组骨片上骨吸收陷窝数量和表面积与对照组比较均减少 (P <0 .0 1) ,而且骨吸收陷窝数及表面积随氟浓度的增加而减少。 结论 :氟对体外培养的破骨细胞有直接的损伤作用。     

OPGL诱导小鼠外周血单核细胞分化为破骨细胞及其破骨活性

目的 :观察在小鼠外周血单核细胞培养中破骨细胞抑制因子配基 (osteoprotegerinligand ,OPGL)诱导单核细胞分化为破骨细胞的作用 ,以及地塞米松对破骨细胞分化和骨吸收活性的影响 .方法 :将外周血单核细胞分组培养 ,在A组中加入巨噬细胞集落刺激因子和OPGL ,B组中再加入地塞米松 .多核巨细胞形成后行抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartratere sistantacidphosphatase,TRAP)及甲苯胺蓝染色 .将象牙骨片上骨吸收面积经计算机图像分析以确定其差异 .结果 :外周血单核细胞培养 7～ 10d ,可以见到大量的多核巨细胞 ,体积巨大 .B组中 ,多核巨细胞出现较A组早 .几乎所有的多核巨细胞表现为TRAP强阳性 ,而多数单核细胞和巨噬细胞为TRAP阴性或弱阳性 .在象牙骨片上有大量的骨吸收陷窝形成 ,A、B两组的骨吸收无明显差异 (P >0 .0 5 ) .结论 :OPGL可以诱导小鼠外周血单核细胞分化为破骨细胞并具有骨吸收活性 .地塞米松可加速OPGL诱导的破骨细胞分化作用 ,但对于破骨细胞的骨吸收活性无影响     

破骨细胞体外培养方法的建立与形态观察

1　材料和方法1 1　骨磨片制备　新鲜牛股骨皮质锯成 6ｍｍ× 6ｍｍ×2 0 0 μｍ的小块 ,再磨成 10 μｍ厚。1 2　破骨细胞分离培养　拉颈处死出生 2 4ｈ内的新生Ｗｉｓｔａｒ大鼠 ,75 %乙醇浸泡 5ｍｉｎ。无菌条件下分离股骨、肱骨、胫骨 ,清除骨表面的软组织和骨骺 ,放入培养液 (含ＤＭＥＭ ,2 5ｍｍｏｌ/ＬＨＥＰＥＳ ,15 %胎牛血清 ,青霉素 10 0Ｕ/ｍｌ,链霉素 10 0ｍｇ/Ｌ ,ｐＨ 7 0 )。骨干纵行剖开 ,吸管反复冲洗骨髓腔 ,静止 1ｍｉｎ。取 2 4孔培养板 ,每孔加 1ｍｌ培养液和一个骨磨片或盖玻片 ,37℃、5 %ＣＯ2 孵育箱 1ｈ。吸出培…     

伊班磷酸钠对破骨细胞功能抑制方式的实验研究

【摘要】 目的：研究伊班磷酸钠在体外对破骨细胞的抑制方式 研究背景：由于二磷酸盐对破骨细胞的功能有较强的抑制作用,近年来被作为一种辅助治疗手段应用于骨巨细胞瘤的治疗,文献报道可有效降低骨巨细胞瘤的术后复发率。但对其有效给药方式、用药剂量及用药时间等问题目前尚存有较多争议。我们认为要明确这些问题,应首先明确二磷酸盐类药物在不同药理浓度下对破骨细胞功能的抑制方式。 方法：破骨细胞由小鼠的骨髓单核细胞诱导制备。小鼠的骨髓单核细胞经收集、计数、种植后,向培养液中加入各种必需的诱导细胞因子,同时实验组加入不同梯度浓度的伊班磷酸钠,对照组加入同等量的磷酸盐缓冲液,在无菌条件下培育5天,（细胞核>3个）,通过比较各组不同浓度伊班磷酸钠对破骨细胞（细胞核>3个）形成的抑制情况,获得最低有效抑制浓度。然后观察此浓度下的伊班磷酸钠对破骨细胞的粘附、迁移和骨吸收能力的影响。 结果：伊班磷酸钠可以抑制体外破骨细胞的形成,其最低有效抑制浓度为10-5M。此浓度下伊班磷酸钠可以明显抑制破骨细胞的迁移和骨吸收,但对破骨细胞的粘附能力没有明显影响。 结论：体外高浓度的伊班磷酸钠可以有效抑制破骨细胞形成,减少其对骨质的吸收破坏。提示在应用于骨巨细胞瘤的治疗时,采用有可能达到较高的局部药理浓度的给药方法,才能达到有效的治疗效果。     

骨吸收机理与破骨细胞分子生物学研究的进展

口腔牙齿与牙槽骨和颌骨的吸收是口腔临床医学中的一个极其重要的问题。骨的修复，改建和形态学发生是一个生理控制过程，它包括由成骨细胞作用的骨基质的合成和由破骨细胞作用下的骨的协同吸收，破骨细胞（osteoclast)与成骨细胞（osteoblast)是骨组织形成和吸收的关键性生物活性细胞，在骨组织再生与修复方面，也是矛盾与对立的统一体，近十年来，在破骨细胞与骨吸收机理的分子生物学领域研究方面，已有着长足的进展，在此重点讨论骨吸收机理与破骨细胞分子生物学研究的进展。     

骨片吸收陷窝光镜计数法定量测定破骨细胞功能

目的 研究定量检测体外培养破骨细胞（ＯＣ）骨吸收功能。方法 应用改良Ｆｅｎｔｏｎ等的方法，由１ｄ龄ＳＤ大鼠四肢长骨分离ＯＣ并中于牛皮质骨骨片上连续培养，超声去除细胞后，骨片经１％甲苯胺蓝色３～４ｍｉｎ光镜下对整片吸收陷窝观察并计数，根据骨片上陷窝的数目定量ＯＣ的骨吸收功能。结果 骨片吸收陷窝经甲苯胺蓝染色后光镜下可清晰识别，并为扫描电镜（ＳＥＭ）所证实，甲苯胺蓝染色－光镜观察技术对骨片吸收陷窝计数     

小鼠破骨细胞骨髓诱导模型的建立及功能观察

目的 获得大量高质量小鼠破骨细胞,为体外研究破骨细胞骨吸收功能提供丰富的细胞来源.方法 采用巨噬细胞集落刺激因子(maerophage colony stimulating factor,M-CSF)和破骨细胞分化因子(receptor activator of nuclearfactor-κB ligand,RANKL)诱导小鼠骨髓单核细胞分化为破骨细胞,并通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phos-phatase,TRAP)染色和骨吸收实验来鉴定破骨细胞及其噬骨能力.结果 诱导3 d后可见TRAP( )多核细胞出现,诱导5 d后骨片上可见蓝紫色的吸收陷窝.随着培养时间的延长,TRAP( )多核细胞数目和吸收陷窝呈现时间依赖性增长趋势(P<0.05).结论 M-CSF和RANKL诱导小鼠骨髓单核细胞可产生大量的具有活跃噬骨能力的破骨细胞.     

共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10（CPN10）对成骨细胞（OB）-外周血单个核细胞（PBMs）共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10（10μg/ml）处理组。主要观察指标：①采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,②应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG 相对浓度分别为33.4798±177;2.0929、47.974±177;5.1628、47.0861±177;2.2033、7.4642±177;0.6791（P〈0.05）,对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞（OB-PBMs）共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。     

抗坏血酸抑制核因子κB受体活化子配体诱导RAW264.7细胞的分化和功能

目的研究抗坏血酸对核因子κB受体活化子配体(RANKL)诱导体外培养的破骨前体细胞RAW2647形成成熟多核破骨细胞的影响,探讨抗坏血酸在破骨前体细胞分化中的作用及机制。方法利用不同浓度的抗坏血酸与RANKL单独或共同处理RAW2647细胞,MTT法测定细胞增殖,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法观察TRAP阳性多核细胞,逆转录聚合酶链反应(RTPCR)测定破骨细胞表型基因和功能基因的表达,Western印迹方法检测碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达,破骨细胞的骨吸收功能用骨吸收陷窝面积计数法分析。结果抗坏血酸和RANKL都抑制RAW2647细胞的增殖(P<005),但它们之间无协同作用。抗坏血酸本身不能诱导RAW2647细胞形成破骨细胞,但可抑制RANKL诱导的TRAP阳性多核破骨细胞形成(P<005)。抗坏血酸下调RANKL诱导的碳酐酶Ⅱ和RANK基因mRNA表达及碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达,抑制骨吸收功能(P<005)。结论抗坏血酸能直接抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和功能。     

RANKL浓度对破骨细胞形成与活性的影响

目的 探讨不同浓度RANKL对骨髓单核细胞向破骨细胞分化和活性的影响.方法 50、100和150 μg/L三种RANKL浓度诱导骨髓单核细胞向破骨细胞分化.抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞形态并计数,抗酒石酸酸性磷酸酶活性检测试剂盒检测上清中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性,骨板吸收实验检测破骨细胞骨吸收活力.结果 100 μg/L和150 μg/L RANKL浓度组在破骨细胞数量、细胞大小、核数目,抗酒石酸酸性磷酸酶活性和骨吸收率方面均明显高于50 μg/L组（P＆lt;0.01）,而100 μg/L和150 μg/L组间没有明显差异.结论 100 μg/L RANKL浓度下破骨细胞形成和活性能力强且相对较经济,是破骨细胞诱导培养的理想浓度值.     

两种破骨细胞培养方法的比较及其吸收骨质的动态观察

目的:比较分析破骨细胞(osteoclast, OC)体外分离培养的方法,并动态观察其形态、分化及功能,为进一步探讨药物对OC性骨吸收的作用奠定基础.方法:采用两种OC的培养方法,即从新生24 h的兔长干骨骨髓腔内壁机械分离成熟OC和1,25(OH)2维生素D3诱导鼠骨髓细胞形成破骨样细胞(osteoclast-like cell, OLC)的方法,对获得的OC进行形态学和功能观察.结果: 倒置显微镜下观察,OC是一种多核巨细胞,有伪足并借助伪足的凹凸伸缩而变化形态、运动行走;HE染色均可见OC多核、胞浆有空泡;特异性抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色可见OC胞浆阳性,呈酒红色,多核.体外OC与骨片共同培养形成骨吸收陷窝,且在培养的7 d内陷窝数目和面积逐渐增大.1,25(OH)2维生素D3诱导鼠骨髓细胞形成OLC,其形态结构特征与成熟OC相同,诱导出的破骨样细胞数目多于机械分离的方法,但每个细胞胞核数目总体上少于机械分离的方法,而且胞核多位于细胞周边,在骨片上形成的陷窝也较小而浅;培养液上清中的钙离子含量和酸性磷酸酶(acid phosphatase ,ACP)含量在培养的1～12 d内随时间逐渐增加.结论: 针对不同实验目的可以采用不同的分离培养OC方法.从骨髓腔内壁机械分离培养的方法可获得骨吸收功能较活跃的OC.1,25(OH)2维生素D3诱导鼠骨髓细胞形成的OLC数量较多,适于对OC分化过程的研究.     

CD38分子与破骨细胞活性调节的研究进展

CD38分子是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，广泛表达于造血细胞及非造血细胞系。近年发现CD38分子具有许多复杂而又独特的生物学特性及功能，其中CD38环化酶在调节破骨细胞(OC)活性中起一定作用，可能对骨质疏松的治疗有重要意义。     

巴戟天与雌激素对骨质疏松大鼠破骨细胞RANK和CAII的表达影响

目的: 探讨巴戟天、雌激素对骨质疏松大鼠破骨细胞核激活因子kb受体（RANK）和碳酸酐酶II（CAII）的表达水平间关系。方法: 选择月龄为4个月的SPF级成年健康雌性SD大鼠,建立去势大鼠骨质疏松模型,分离大鼠原代破骨细胞并分为6组:空白对照组、17b-雌二醇10^-6mmol/L组、0.1 g/d巴戟天组、0.5 g/d巴戟天组、1.0g/d巴戟天组、17b-雌二醇10^-6mmol/L和1.0g/d巴戟天组进行培养,观察比较各组 CAII、 RANK mRNA表达等指标差异。结果: 17b-雌二醇10^-6mmol/L组、0.5 g/d巴戟天组、1.0g/d巴戟天组、17b-雌二醇10^-6mmol/L联合1.0g/d巴戟天组破骨细胞数量均较空白对照组明显减少,而17b-雌二醇10^-6mmol/L联合1.0g/d巴戟天组减少最明显（P<0.05）,0.1 g/d巴戟天组与对照组无显著差异（P＞0.05）;17b-雌二醇10^-6mmol/L组、0.5 g/d巴戟天组、1.0g/d巴戟天组、17b-雌二醇10^-6mmol/L联合1.0g/d巴戟天组骨吸收陷窝面积相均低于空白对照组（P<0.05）,而17b-雌二醇10^-6mmol/L联合1.0g/d巴戟天组骨吸收陷窝面积明显低于其他组（P<0.05）,0.1 g/d巴戟天组与对照组无显著差异（P＞0.05）;17b-雌二醇10^-6mmol/L组、0.5 g/d巴戟天组、1.0g/d巴戟天组、17b-雌二醇10^-6mmol/L联合1.0g/d巴戟天组CAII、RANK mRNA基因表达水平明显低于空白对照组（P<0.05）,0.1 g/d巴戟天组与对照组无显著差异（P＞0.05）,17b-雌二醇10^-6mmol/L组和0.5 g/d巴戟天组RANK mRNA基因、CAII mRNA基因表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）,17b-雌二醇10^-6mmol/L联合1.0g/d巴戟天组CAII、RANK mRNA基因表达水平最低（P<0.05）。结论: 巴戟天联合雌激素能有效诱导骨质疏松大鼠破骨细胞内RANK和CAII处于低表达状态,从而有效预防骨质疏松的发生。     

OPG/RANK/RANKL系统在实验动物骨骼发育营养需要评估中的应用

OPG/RANK/RANKL系统是调节骨代谢的主要信号通路,在维持骨形成和吸收之间的动态平衡中发挥着重要作用。本文主要综述OPG/RANK/RANKL的特点、作用机制,及其在骨代谢疾病、药物和相关营养因素干预效果评价等领域的应用现状,并展望将其引入实验动物骨骼发育营养评估领域的应用前景。     

破骨细胞对不同底物的吸收活性比较

目的:比较破骨细胞对牛皮质骨片及牙本质片的吸收活性。方法:采用25 ng/ml 巨噬细胞集落刺激因子+30 ng/ml核因子κB受体活化因子配体诱导 RAW264.7细胞分化获取破骨细胞,并分别与牛皮质骨片及牙本质片共培养。通过检测抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色阳性细胞数、骨吸收陷窝面积,比较破骨细胞在不同底物上的骨吸收活性。结果:与不同底物共培养形成的TRAP阳性细胞数差异无统计学意义(P>0.05),而牛皮质骨片吸收陷窝的面积显著大于牙本质片(P结论:破骨细胞对牛皮质骨片的吸收活性强于牙本质片。     

大面积烧伤患者应用重组人生长激素的临床研究

目的：探讨重组人生长激素对大面积烧伤病人血糖、蛋白质代谢及创面愈合能力的影响。方法：选择大面积烧伤病人37例,随机分为重组人生长激素(rhGH)治疗组和对照组,分别于伤后3～5d皮下注射rhGH(0．2～0．25u／kg／d)和等量等渗生理盐水。于用药后7、14d分析比较两组血糖、蛋白质代谢变化及创面愈合时间。结果：大面积烧伤患者应用rhGH后血糖与对照组比较无明显升高,血清总蛋白及白蛋白较对照组有明显升高,供皮区愈合时间缩短。结论：大面积烧伤患者早期应用中等剂量rhGH能促进机体蛋白质合成,缩短创面愈合时间,对血糖无影响。     

谷氨酰胺（Gln）和重组人生长激素（rhGH）对重度烧伤患者的应用

目的探讨联合应用谷氨酰胺（Gin）和重组人生长激素（rhGH）对重度烧伤患者蛋白代谢和愈合的影响。方法选择2007年12月-2010年12月我院收治的46例重度烧伤患者,随机分为rhGH组及Gln＋rhGH组,每组23例。两组患者除全部进行常规治疗外,rhGH组皮下注射rhGH,Gln＋rhGH组在rhGH组治疗基础上静脉给予Gin。伤后1、7、14d对比分析两组患者白蛋白、免疫球蛋白水平,比较两组创面愈合时间及住院天数。结果Gln＋rhGH组伤后14d血浆白蛋白、免疫球蛋白水平及30d创面愈合率均高于rhGH组,差异有统计学意义（P〈0．05）;Gln＋rhGH组住院天数明显少于rhGH组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论应用谷氨酰胺（Gln）联合重组人生长激素能促进蛋白质合成和创面愈合。     

SHP-1基因重组腺病毒的构建与表达

目的 构建并鉴定人蛋白酪氨酸磷酸酶基因(SHP-1)重组腺病毒Ad-SHP1.方法 将人SHP-1 cDNA克隆于穿梭质粒pAdTrack-CMV,PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得带有SHP-1基因的重组腺病毒质粒pAd-SHP1,经PacⅠ线性化后通过Lipofectamine2000转染HEK293包装细胞,观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况.收获重组腺病毒,经PCR和Western Blotting鉴定后,扩增并纯化重组腺病毒,测定病毒滴度.结果 经测序、酶切电泳和感染后蛋白表达检测均表明成功构建重组腺病毒Ad-SHP1;病毒滴度为1.58×1010 pfu/mL.结论 成功构建带有人SHP-1 cDNA的重组腺病毒,为进一步研究结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤发生机制及肿瘤的基因治疗奠定了基础.