应用A蛋白分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体

目的 分离纯化鼠源性抗肥大细胞FcεRIα(高亲和力的IgE的Fc段受体)的单克隆抗体。方法 先培养ER-E5.3细胞,获得大量的含抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体的培养上清。然后应用A蛋白-Sphrose CL-4B制备亲和层析柱,分离纯化细胞培养上清中的单克隆抗体。结果分离纯化的单克隆抗体纯度高,活性强。结论应用A蛋白可以很好分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体。     

FcεR Ⅰ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的 通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FeεR Ⅰα亚基,并用重组蛋白制备单克隆抗体.方法 用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεR Ⅰα蛋白基因,经T-A克隆、亚克隆至pET28a( )原核表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),IPTG诱导表达FeεR Ⅰα亚基蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白;并用其免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果 成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因,且测序正确;构建原核表达质粒FcεR Ⅰα-pET28a( );成功建立4株稳定分泌抗FcεR Ⅰα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为G101、C22、G113、G42.通过细胞免疫荧光实验证实,4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεR Ⅰα亚基.结论 成功利用基因重组技术制备了FcεR Ⅰα亚基蛋白,制备了4株效价高、特异性好的抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,为FeεR Ⅰα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础.     

人FcεRⅠα亚基细胞外区的原核表达及其和IgE结合的机制

应用两种不同的表达系统对FcεRⅠα亚基的细胞外区进行克隆和表达，表达产物经纯化后用免疫斑点杂交法检测其与IgE结合的能力，探索IgE与其高亲和力受体FcεRⅠα亚基的细胞外区结合的机制。结果两种体系均成功表达出FcεRⅠα亚基的细胞外区，pBAD／gⅢA表达的FcεRⅠα亚基的细胞外区能与IgE结合，而PQE30表达的FcεRⅠα亚基的细胞外区不能与IgE结合。提示FcεRⅠα亚基的细胞外区已足够和。IgE结合，无需β、γ亚基的存在，其所具有的一定的空间构型和二硫键的形成在与IgE结合时是必需的，而糖基化位点在与IgE的结合时是非必需的。     

IgE高亲和力受体蛋白的制备及其生物功能的鉴定

目的 通过基因工程技术制备人IgE抗体结合其高亲和力受体α段(FcεRIα)蛋白并对其生物学功能进行鉴定,为探讨FcεRIα在过敏性疾病中的作用奠定研究基础.方法 应用基于PCR的精确合成法(PAS)方法获得人FcεRIα基因,构建原核表达载体pET-FcεRIα,低温诱导表达FcεRIα并采用 His标签纯化重组蛋白;通过ELISA法鉴定重组人FcεRIα蛋白的生物功能.结果 扩增出大小约为560 bp的人FcεRIα基因;pET-FcεRIα质粒经双酶切及测序鉴定正确;诱导表达并纯化出相对分子质量大小约为22000的人FcεRIα;重组人FcεRIα能有效检测人血清中的抗FcεRIα自身抗体水平,并且能够与人血清中IgE抗体高效结合.结论 成功制备人FcεRIα蛋白,并初步具备检测人血清中抗FcεRIα自身抗体及IgE抗体的能力,为后续研究提供了有利的实践基础.     

大鼠IgECH2-3-FasL融合蛋白真核表达质粒的构建

在人类哮喘及其他过敏反应性疾病中 ,肥大细胞始终处于重要地位。IgE的Fc段与肥大细胞上高亲和力受体FcεRⅠ相连接触发过敏反应。单独的Fc段能封闭其高亲和力受体 ,阻断过敏反应 ,且将关键结合位点定位于Fc段的CH3[1 3 ] 。国外研究发现 ,肥大细胞表面表达Fas,抗Fas抗体能够诱     

TGF-βRⅡ/Fc融合蛋白在杆状病毒系统中的表达

目的：构建TGF－βRⅡ／Fc融合蛋白的杆状病毒表达系统，并使之成功表达。为将来TGF－βRⅡ／Fc融合蛋白在肺间质纤维化基因治疗中的应用奠定基础。方法：采用分子克隆技术构建Bac-TRⅡ杆状病毒表达系统；采用DNA脂质体转染技术和昆明细胞培养技术培养和扩增Bac-TRⅡ重组病毒颗粒；采用免疫荧光技术和免疫印迹法检测目的蛋白的表达。结果：在重组的Bac-TRⅡ杆状病毒感染的sf9细胞中可以检测到目的蛋白的表达。结论：重组的Bac-TRⅡ杆状病毒表达系统可以用于正确表达TGF－βRⅡ／Fc融合蛋白。由于杆状病毒表达系统效率较高，因此，今后可利用该系统进行目的蛋白的纯化及进一步的实验研究。     

中国汉族人IgE重链恒定区CH2-CH4 cDNA的克隆

人血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上的IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)结合则是这些Ⅰ型变态反应的关键步骤[1].     

TNF-α对肥大细胞IL-10、IL-12分泌和组胺释放的影响

目的:检测TNF-α对P815肥大细胞IL-10,IL-12分泌和组胺释放的影响。方法:P815肥大细胞培养后,用不同浓度的TNF-α单独或联合用TNF-α单克隆抗体激发肥大细胞,不同时间点收集上清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中IL-10,IL-12和组胺水平。结果:单独作用时,TNF-α促进P815肥大细胞IL-12分泌,而对IL-10分泌和组胺释放无明显影响,TNF-α单克隆抗体的应用可以阻断TNF-α引起的肥大细胞IL-12分泌。结论:TNF-α可以通过促进肥大细胞分泌IL-12参与肥大细胞相关的炎症过程。     

人IgE重链3-4区蛋白的表达、纯化及功能分析

目的通过基因重组的方法表达IgE Cε3-Cε4区,鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的相互作用,并用重组蛋白免疫小鼠制备血清。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞调取IgE Cε3-Cε4cDNA片段,克隆至pET28a(+)构建原核表达载体IgE Cε3-Cε4-pET28a(+),将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达IgE Cε3-Cε4区蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白后,用免疫荧光方法鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的结合能力,并用UniCAP 100全自动分析检测仪对重组抗原进行定量检测与鉴定;用表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗鼠血清,用Western-blot法对多克隆抗体进行鉴定。结果成功调取的人IgE Cε3-Cε4区基因与已报道的序列相一致;获得的IgECε3-Cε4区蛋白相对分子质量(Mr)同预期的结果相一致;IgE Cε3-Cε4能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠ受体;通过UniCAP 100全自动分析检测仪能够检测到重组抗原并精确到国际单位;免疫鼠血清多抗能特异性结合天然人血清IgE。结论成功构建了IgE C...     

ICOS/Fc在CHO细胞中的稳定表达

目的:探讨Picos/Fc融合蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的稳定表达及其表达产物的纯化和初步鉴定,为其功能研究和临床应用奠定基础.方法:将Picos/Fc表达质粒及含G418抗性基因neor的质粒Pegfp共转染CHO细胞,经G418抗性培养基筛选、克隆化培养、夹心ELISA检测,挑选100%强阳性且表达均一的细胞克隆,扩大培养取上清经Protein A亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western印迹等进行分子质量、纯度、抗原特异性的初步鉴定.结果:获得稳定表达ICOS/Fc蛋白的CHO细胞单克隆,制备并经Protein A亲和层析柱获得纯化的ICOS/Fc融合蛋白,SDS-PAGE胶可见一条Mr约70×103的与预期分子质量大小相符的蛋白条带,Western印迹法可在同一位置检测到该蛋白与HRP酶标抗人Fc mAb特异结合.结论:在CHO细胞中成功地建立了稳定表达ICOS/Fc融合蛋白的细胞系,表达并纯化了有抗原特异性的重组ICOS/Fc融合蛋白.     

膜结合型抗大鼠FcεRIα单克隆抗体制备及活性鉴定

目的:建立抗鼠FcεRI单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),为靶向诱导肥大细胞凋亡创造条件.方法:大鼠嗜碱性粒细胞细胞系RBL-2H3免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,ELISA筛选鼠血清和融合细胞产生的抗体,有限稀释克隆化培养.SDS-PAGE胶电泳、免疫扩散鉴定抗体性质,IgE竞争结合、组胺释放检测抗体生物活性,125I-细胞膜抗体复合物免疫沉淀放射自显影鉴定抗体识别抗原成分.结果:获得2株抗FcεRIα McAb生产细胞株ER-E5.3、ER-C7.4,均为IgG1.培养上清和小鼠腹水获得的抗体效价均大于10-5.流式细胞术分析抗体与RBL-2H3结合率均大于95%,与大鼠胸腺细胞和外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)无交叉反应,并能竞争性抑制IgE与肥大细胞结合.抗体触发RBL-2H3脱颗粒,组胺释放效应与抗原特异性IgE对肥大细胞的激活效应相同.酶切的Fab片段能与RBL-2H3结合,也能竞争抑制IgE与肥大细胞的结合,但不致RBL-2H3脱颗粒.抗体结合的细胞膜成分为α亚单位.结论:大鼠肥大细胞免疫小鼠与骨髓瘤细胞融合得到2株抗体产生杂交瘤克隆ER-E5.3和ER-C7.4,抗体效价和功能活性达到了实验要求,抗原识别成分为膜FcεRIα.     

亲和层析法纯化抗大肠肿瘤相关抗原的单克隆抗体

目的制备和纯化鼠源性抗人大肠肿瘤单克隆抗体(单抗),分析其相应抗原在大肠肿瘤细胞中的表达。方法常规方法免疫BALB/c小鼠制备腹水,应用G蛋白亲和层析柱对小鼠腹水样品进行分离纯化。采用SDS-PAGE、间接免疫荧光(IFA)、间接ELISA检测纯化后抗体的纯度、活性、效价和特异性。用免疫细胞化学、流式细胞术和免疫组织化学技术S-P法检测其相应抗原在大肠肿瘤细胞株和组织中的表达。结果还原性SDS-PAGE显示所获抗体为单一组分。应用间接ELISA检测抗体效价为1∶106,纯化后的抗体对大肠肿瘤细胞株具有特异结合活性,并在高分化大肠腺癌组织中表现出更高选择性(P<0.01)。结论G蛋白亲和层析法操作简便,所得单抗的纯度高,特异性强,生物学活性好。对临床上早期诊断大肠肿瘤将具有较大的意义。     

中国汉族人IgE重链恒定区CH2、CH3及CH4亚基cDNA的克隆

人血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)的相互作用则是这些Ⅰ型变态反应的重要调节步骤[1].很长时间以来,找到抑制它们结合从而治疗过敏性疾病的方法,一直是过敏性疾病研究的重点,所以了解这两个蛋白相互识别的方式以及结合的位点是极为重要的.     

分泌载脂蛋白AII单克隆抗体杂交瘤的建立

以人血清载脂蛋白AⅡ为抗原,免疫BALB/C小鼠,将脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,经HAT选择性培养,特异性筛选及克隆化,获得1-C1、2-C2两株分泌抗人血清载脂蛋白AⅡ单克隆抗体杂交瘤细胞株。免疫双扩散确定它们分泌抗体的亚型均为IgG1;吸收试验及ELISA交叉试验表明单克隆抗体的特异性;ELISA测定其培养上清中抗体效价都为1:100,诱生腹水效价分别为1:10000和1:5000;两株杂交瘤细胞染色体均数分别为96.34±6.06、95.01±5.38;采用Protein A Sepharose 4B层析柱纯化了1-C1杂交瘤细胞培养上清中的单克隆抗体。     

抗桥粒蛋白Ⅰ单克隆抗体在肿瘤病理中的初步应用

［１３］抗桥粒蛋白Ⅰ单克隆抗体在肿瘤病理中的初步应用杨举伦等。华西医科大学病理学教研室［中华病理学杂志１９９３；２２（３）：１５４］报告抗桥粒蛋白；（ｄｅｓｍｏｐｌａｋｉｎＩ．ＤＰＩ）单克隆抗体在肿瘤病理学中的初步应用。从水牛鼻表皮中分离桥粒，用制备...     

CD23表达及其调控

IgEFc受体(FcεR)有FcεR Ⅰ和FcεR Ⅱ两种类型,后者即CD 23。它们的分子结构、抗原性、编码基因、表达调控、功能及与IgE的亲合力等特性均不相同。CD 23在细胞分化的特定时期和生长状态下呈现高表达。而对其精细调节机理了解甚少,因而对其表达及调控的研究有利于揭示它的功能,近年来这一领域的     

抗人肺表面活性物质相关蛋白A单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

目的 制备抗人肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)单克隆抗体并对其特性进行鉴定。方法 以自行制备的SP-A蛋白作为抗原免疫Balb／c小鼠，建立分泌抗人SP-A单抗的杂交瘤细胞株，诱发小鼠产生单抗腹水，用(NH4)2SO4盐析纯化腹水，用间接ELISA法测定单抗效价，用Westemblotting测定抗体特异性。结果 建立了3株能持续分泌抗SP-A单抗的杂交瘤细胞株，其中286杂交瘤细胞株抗体效价最高，其染色体数目均大于100条。间接ELISA法测定腹水和细胞培养上清效价，分别为l：50000和l：10000。用Westem blotting在SP-A蛋白泳道上相对分子质量3l000左右位置出现明显的一条染色条带。结论 自行制备的抗人SP-A单抗，其具有特异性强、效价高的特点。     

应用高效疏水色谱分离纯化IgM类单克隆抗体

高效疏水色谱(HPHIC)用于分离分子量高达1000 000的IgM类单克隆抗体还未见文献报道。我们用HPHIC对杂交瘤培养上清中的IgM类单克隆抗体进行了分离纯化,现报告如下。     

IgG1类抗IgE Fc单克隆抗体抑制人肥大细胞脱颗粒作用研究

目的 探究IgG1类抗IgE Fc单克隆抗体对人肥大细胞脱颗粒作用的影响。方法 采用骨髓杂交瘤技术制备IgG1类大鼠抗人IgE Fc单克隆抗体,ELISA法鉴定杂交瘤细胞分泌的特异性抗体亚类;进一步体外培养人LAD2肥大细胞,分别以Compound 48/80、Compound 48/80+hum-IgE-Fc、Compound 48/80+anti-IgE-Fc mAb、Compound 48/80+IgE-Fc+anti-IgE-Fc mAb致敏LAD2肥大细胞48 h, Compound 48/80刺激45 min后甲苯胺蓝染色,收各组上清液,用ELISA检测HIS和TPS的释放浓度,Western blot检测各组TPS和CD32b分子表达水平。结果 成功制备2株分泌IgG1类Anti-IgE-Fc mAb的杂交瘤细胞株,与对照组相比,Compound 48/80促进LAD2细胞脱颗粒效应,HIS和TPS的释放浓度明显增加(P<0.05),且肥大细胞TPS蛋白表达上调。Compound 48/80+hum-IgE-Fc及Compound 48/80+anti-IgE-Fc...     

TGF-βRⅡ/Fc融合基因真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建TGF-βRⅡ/FC融合基因的真核表达载体pIg-TRⅡ，使其在中国仓鼠肾细胞（CHO）中呈分泌性表达，为肺间质纤维化基因治疗的研究奠定基础。方法 采用RT-PCR方法从正常人肺组织中扩增出目的基因TGF-βRⅡcDNA的胞膜外部分，再将TGF-βRⅡcDNA片段亚克隆到pIg真核表达载体，该载体在其多克隆位点下游含有人IgG1Fc基因组片段，由此可形成TGF-βRⅡ/FC融合基因；采用脂质体转染技术转染CHO细胞使其瞬时表达融合蛋白；应用细胞免疫荧光技术检测融合蛋白的表达；采用免疫沉淀的方法检测CHO细胞培养上清内融合蛋白的表达。结果 DNA测序结果在Blast上作同源性比较证明插入片段就是TGF-βRⅡcDNA的胞膜外部分，细胞免疫荧光染色呈阳性反应，CHO细胞培养上清内检测到融合蛋白的表达。结论 pIg-TRⅡ真核表达载体构建成功，并能够在CHO细胞中分泌性表达有活性的融合蛋白TGF-βRⅡ/FC。