非诺贝特通过上调三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ促进eNOS复偶联

目的探讨非诺贝特发挥降脂外血管内皮保护作用的机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞（HU-VECs）,非诺贝特预处理HUVECs 2 h,再与脂多糖（LPS）共孵育24 h。采用Western blot检测三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ（GTPCH-Ⅰ）的表达水平,高效液相色谱法检测四氢生物蝶呤（BH4）的表达水平,ELISA检测细胞上清一氧化氮（NO）浓度,利用Confocal方法检测细胞活性氧（ROS）产生水平。结果非诺贝特预处理后,较单纯LPS刺激组,细胞内BH4表达水平及细胞上清NO产生增多,伴有细胞内ROS产生减少（P均〈0.05）;此外,单独给予非诺贝特处理内皮细胞后,可见浓度依赖性上调细胞GTPCH-Ⅰ的表达,非诺贝特（10μmol/L）上调GTPCH-Ⅰ的表达在12 h达到高峰。结论非诺贝特通过上调内皮细胞GTPCH-Ⅰ的表达而增加BH4的水平,进而促进内皮型一氧化氮合酶的复偶联,改善血管内皮功能。     

高同型半胱氨酸血症诱导eNOS脱偶联损害冠状动脉内皮功能

目的探讨高同型半胱氨酸血症（HHcy）患者冠状动脉内皮功能是否被损伤,以及这种损伤是否通过内皮型一氧化氮合酶（eNOS）脱偶联实现的。方法 71例参与者被分成健康对照组（n=50）和HHcy组（n=21）,利用多普勒超声心动测定腺苷诱导下冠状动脉左前降支的舒张功能的改变,冠脉血流速度储备（CFVR）由最大血流速度与基线水平的比值计算得出。采用ELISA以及高效液相色谱法测定血浆一氧化氮（NO）、四氢生物蝶呤（BH4）的水平。结果与健康对照组相比,HHcy组患者血浆NO、BH4的水平降低（P〈0.05）;HHcy组CFVR低于健康对照组（P〈0.05）;血浆Hcy水平与NO及CFVR呈负相关（P〈0.05）。结论 HHcy可能通过降低BH4生物利用度,诱导eNOS脱偶联,而导致冠状动脉内皮功能损伤,进而促进不良冠脉事件的发生。     

心血管疾病中氧化应激与一氧化氮合酶脱耦联

<正>血管内皮细胞功能障碍是导致许多心血管疾病的共同病理生理基础,其突出表现为内皮依赖性血管舒张功能障碍,主要由一氧化氮(NO)减少及氧自由基增加所致。内皮型NO合酶(eNOS)脱耦联是导致NO水平下降和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高的重要机制,其中ROS水平升高又是造成eNOS脱耦联的主要原因。减少氧     

内皮型一氧化氮合成酶活性调节的研究进展

一氧化氮合成酶（NOS）目前已克隆提纯了三种亚型：神经型一氧化氮合成酶（nNOS）、诱生型一氧化氮合成酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）。其中eNOS在NO的生成中具有重要的作用,它不仅表达在血管内皮细胞,心肌细胞、血小板、平滑肌细胞、骨骼细胞和神经元细胞上也有表达,深入开展eNOS的研究,有助于进一步探索心血管治疗的新方法。eNOS的调节包括转录水平及翻译后水平的调节。     

高尿酸对血管内皮细胞eNOS基因表达的调节作用及其对血管新生的影响

目的探讨高尿酸对血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达调节作用及其对血管新生的影响。方法人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)在600μmol/L尿酸溶液中培养,应用RT-PCR和Western印迹分别检测各组细胞eNOS mRNA和蛋白表达,应用硝酸还原法检测各组细胞上清液中一氧化氮(NO)含量,应用人工基底膜检测细胞的管腔形成能力,应用鸡胚尿囊膜试验检测细胞的血管新生能力,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组HUVECs的增殖,应用划痕试验检测各组HUVECs的迁移能力。结果与对照组比较,600μmol/L的高尿酸培养HUVECs 48 h后,细胞eNOS mRNA转录水平、蛋白表达量、NO浓度显著下降(P0.01);HUVECs有聚集倾向,但未能形成管腔样网络结构;CAM的血管新生面积比率降低49.78%(P0.01);同时,细胞的增殖能力降低63.68%(P0.05),细胞的迁移能力下降38.70%(P0.01)。结论高尿酸抑制血管内皮细胞eNOS基因表达和NO含量;高尿酸抑制细胞的血管新生能力,同时抑制细胞增殖与迁移,其抑制的可能机制与高尿酸下调eNOS的表达有关。     

抵抗素对内皮细胞NO生成的影响及Akt信号机制

目的探讨抵抗素对内皮细胞NO生成的影响及其可能的信号机制。方法分离、培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,以不同浓度抵抗素（15、50、100ng／ml）干预。荧光显微镜检测各组细胞中N0的生成,RT-PCR检测eNOS mRNA表达水平,Western blot检测Akt和eNOS磷酸化水平。结果15、50、100ng／ml抵抗素干预HUVECs 24h后,胰岛素刺激的内皮NO生成显著降低（三组分别为4．01±0．69、3．764±0．71、3．73±0．45,vs对照组P均〈0．05）,同时伴有内皮Akt和eNOS磷酸化水平的降低（us对照组P均〈0．05）,而eNOS mRNA表达无显著改变。结论抵抗素可通过P13K／Akt途径影响HuVECs eNOS磷酸化水平,进而调节内皮细胞NO生成,但该影响并非Akt依赖性。     

经皮冠状动脉介入治疗后再狭窄的实验研究--非诺贝特对内皮细胞增殖及凋亡的干预作用

目的建立再狭窄内皮细胞模型并探讨非诺贝特对经皮冠状动脉治疗后再狭窄的防治作用。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为:(1)正常对照组,(2)溶血卵磷脂(LPC)组,(3)低浓度非诺贝特组(10μmol/L),(4)中浓度非诺贝特组(50μmol/L),(5)高浓度非诺贝特组(100μmol/L)。分别观测内皮细胞增殖、凋亡及上清液一氧化氮(NO)浓度的的变化。结果与正常对照组比较,LPC抑制内皮细胞增殖,促进细胞凋亡,降低NO浓度。非诺贝特可干预LPC对内皮细胞的作用,使内皮细胞增殖增强,细胞凋亡减少,NO浓度升高。结论非诺贝特可改善LPC对HUVECs的影响,使内皮细胞增殖增强,凋亡减少,升高NO浓度,从而起到防治PCI后再狭窄的作用。     

小葱葱白提取物对人脐静脉内皮细胞一氧化氮及一氧化氮合酶的影响

目的观察小葱葱白提取物对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分泌一氧化氮(NO)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的影响,探讨其对HUVECs血管活性分子分泌的调节作用。方法从小葱葱白中提取活性成分,体外培养HUVECs用不同浓度(100g/L,50g/L,25g/L,12.5g/L)的葱白提取物分别作用于HUVECs。观察细胞形态,MTT法观察葱白提取物对HUVECs活性的影响,比色法测定各组的NO含量,RT-PCR法及Western Blot法测定内皮型eNOS的表达水平。结果和对照组比较,小葱葱白提取物对内皮细胞形态和活性无明显影响,能增加HUVECs释放NO及eNOS生成(P<0.05或P<0.01)。结论小葱葱白提取物可能通过增加eNOS生成而提高HUVECs释放NO,从而保护内皮功能。     

阿司匹林抗高糖诱导内皮细胞衰老过程中对一氧化氮-一氧化氮合酶系统的影响

目的 探讨阿司匹林是否通过影响一氧化氮（NO）-一氧化氮合酶（NOS）系统发挥抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用. 方法 人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）分别于正常糖浓度培养液（5.5 mmol/L）、高糖培养液（33 mmol/L）、含阿司匹林（0.01～1mmol/L）培养液及含L-NAME（300 μmol/L）培养液中培养48 h.采用β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色鉴定衰老细胞,流式细胞仪检测细胞内活性氧簇（ROS）水平.Griess法检测细胞总NO水平,荧光酶标仪检测细胞内NOS活性.Westernblot分析eNOS蛋白及eNOS人丝氨酸（Ser-1177）蛋白表达. 结果 高糖作用内皮细胞48 h后与正常糖浓度相比,SA-β-gal阳性细胞数明显增多.阿司匹林剂量依赖性地减少SA-β-gal阳性细胞数,降低ROS的水平,升高NO的水平、总NOS活性和eNOS Ser-1177蛋白表达（P＜0.05）.L-NAME（NOS的抑制剂）能完全抑制高糖环境下阿司匹林的上述作用（P＜0.05）.各组间eNOS总蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）. 结论 高糖环境下阿司匹林通过提高细胞NOS活性而升高NO水平,降低氧化应激反应而发挥抗衰老作用.     

内皮型一氧化氮合酶与心肌缺血再灌注损伤的关系研究进展

内皮型一氧化氮合酶（eNOS）参与心肌缺血再灌注损伤（MIRI）调控机制和信号通路，其不仅在内皮细胞中表达，也在心肌细胞、肥大细胞、肾上皮细胞、红细胞、白细胞和血小板中表达；eNOS既可以合成NO，扩张血管，也可以合成超氧化物，加剧氧化应激。在MIRI中抑制eNOS解偶联和增加其有益磷酸化，可保护血管内皮功能、抑制氧化应激、逆转凋亡和减轻炎症反应等；eNOS可通过磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/eNOS、沉默信息调节剂1/eNOS、腺苷单磷酸活化蛋白激酶/eNOS/一氧化氮等信号通路在MIRI中发挥重要作用。     

不同剂量白酒对大鼠血管内皮功能、血脂和血糖的影响

目的探讨不同剂量白酒对大鼠血管内皮功能、血脂和血糖的影响。方法将60只雄性SD大鼠随机分成大剂量组（A组）、中剂量组（B组）、小剂量组（C组）和对照组（D组）。酒精灌胃建立动物模型,8周后测定动脉血中NO、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、TC、TG、HDL-C、LDL-C及血糖的含量和一氧化氮合酶（NOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、诱生型一氧化氮合酶（iNOS）活性。结果A、B与D组相比,NO、NOS、eNOS、AngⅡ、TC、血糖改变差异有统计学意义（P〈0．05）,C、D组相比,上述指标改变无统计学意义（P〉0．05）;A、B、C组与D组相比,HDL—C改变差异有统计学意义（P〈0．05）;A组与B、C、D组相比,iNOS改变差异有统计学意义（P〈0．05）。结论小剂量白酒灌胃对大鼠血管内皮细胞功能有保护作用,能升高大鼠血清HDL-C;大中剂量白酒灌胃对大鼠血管内皮细胞功能有损害作用,对血脂有影响,同时血糖升高,并呈明显的量效关系。不同剂量白酒对血管内皮细胞的作用机制与NOS（包括eNOS和iNOS）活性变化有关。     

二甲双胍联合利拉鲁肽对棕榈酸诱导的内皮细胞氧化损伤具有协同保护作用

目的 探讨二甲双胍和利拉鲁肽在改善棕榈酸诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤方面是否具有协同保护效应.方法 分离培养人脐静脉内皮细胞,应用不同浓度棕榈酸处理诱导细胞氧化损伤,观察不同浓度二甲双胍和（或）利拉鲁肽对细胞氧化损伤的影响.流式细胞仪检测细胞内的活性氧簇（ROS）水平,硝酸还原酶法检测上清一氧化氮（NO）的水平,组间比较采用单因素方差分析和Q检验.结果 与对照组相比,0.25和0.50 mmoL/L棕榈酸细胞内ROS水平显著升高[（125±17）％、（189±8）％比100％,P＜0.05],上清NO水平降低[（89.9±6.2）％、（79.8±4.8）％比100.0％,P＜0.05];二甲双胍（0.5 ～ 1.0 mmol/L）和利拉鲁肽（10 ～ 100 nmol/L）单独应用后,可使0.50 mmol/L棕榈酸所致的ROS产生增加和NO产生减低作用下降;低剂量的二甲双胍（0.1 mmol/L）或利拉鲁肽（3 nmoL/L）单独应用对0.5 mmol/L棕榈酸的作用均无明显的影响,但两者联合则可减低上述作用：两者联合组与棕榈酸组相比,ROS水平降低[（158±31）％比（250±27）％,P＜0.05],NO水平增加[（91.7±30.6）％比（82.3±5.0）％,P＜0.05].结论 二甲双胍和利拉鲁肽在改善棕榈酸诱导的内皮细胞氧化损伤方面具有协同效应.     

骨保护素不同层面对内皮细胞的影响

目的：观察骨保护素（OPG）作为始动因素对人内皮细胞的数量变化及内皮型一氧化氮合酶 （endothelial nitric oxide synthase,eNOS）和一氧化氮（NO）产生的影响。方法：常规培养永生化的人内皮细胞,以不同浓度（0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0及100.0 ng/ml,共9组）的OPG作用细胞48 h后,用细胞计数试剂盒 8（cell count kit,CCK 8）来检测细胞的数量及NO检测试剂盒检测NO的产量。用免疫细胞化学染色法检测eNOS蛋白表达的水平,实时定量PCR检测eNOS基因的定量表达。结果： 与对照组的细胞数（0.759±0.067）相比,8.0 ng/ml OPG组的细胞数为（1.091±0.200）,P〈0.05,10.0 ng/ml OPG组的细胞数为（1.103±0.152）及100.0 ng/ml OPG组的细胞数为（1.231±0.192）,均P〈0.01。8.0 ng/ml OPG组NO生成量为（102224±0612） μmol/L（P〈0.05）,10.0 ng/ml OPG组NO生成量为（117.183±0.552） μmol/L和1000 ng/ml OPG组NO生成量为（128.216±0.492） μmol/L（均P〈0.01）。同时eNOS蛋白及eNOS mRNA的表达量在6.0 ng/ml、8.0 ng/ml、10.0 ng/ml及100.0 ng/ml OPG组均显著地呈浓度依赖性增加（均P〈0.01）。结论：OPG具有促进内皮细胞增殖效应,可能在抗动脉粥样硬化过程中有一定意义,且与浓度梯度呈明显的正相关。     

抵抗素对内皮细胞一氧化氮生成的影响及其AMPK信号机制

目的研究抵抗素对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）一氧化氮生成的影响及其信号机制。方法不同浓度人抵抗素（0-100ng／ml）干预HUVEC24h。DAF-2DA染色,激光共聚焦显微镜观察各组一氧化氮生成改变,Western-Blot检测各组eNOS、AMPK磷酸化水平改变。结果15、50、100ng／ml抵抗素干预HUVEC24h后,3组的一氧化氮生成分别为4．014-0．69、3．76±0．71、3．73±0．45,与对照组一氧化氮生成（4．89±0．58）相比显著降低（P〈0.05）;50ng／ml组添加AMPK特异激动剂A／CAR后,一氧化氮生成（5．08±0．70）显著升高（P〈0.01）。各抵抗素干预组的AMPK和eNOS磷酸化水平均明显降低;而添加AMPK特异激动剂AICAR后,伴随AMPK的激活,eNOS磷酸化水平也显著增高（P〈0．05）。结论抵抗素在内皮细胞可通过对AMPK的抑制进而导致eNOS失调,降低内皮一氧化氮的生成。     

GTP cyclohydrolase I gene transfer augments intracellular tetrahydrobiopterin in human endothelial cells: effects on nitric oxide synthase activity,protein levels and dimerisation

OBJECTIVES: Tetrahydrobiopterin (BH4) is an essential cofactor for endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity. BH4 levels are regulated by de novo biosynthesis; the rate-limiting enzyme is GTP cyclohydrolase I (GTPCH). BH4 activates and promotes homodimerisation of purified eNOS protein, but the intracellular mechanisms underlying BH4-mediated eNOS regulation in endothelial cells remain less clear. We aimed to investigate the role of BH4 levels in intracellular eNOS regulation, by targeting the BH4 synthetic pathway as a novel strategy to modulate intracellular BH4 levels. METHODS: We constructed a recombinant adenovirus, AdGCH, encoding human GTPCH. We infected human endothelial cells with AdGCH, investigated the changes in intracellular biopterin levels, and determined the effects on eNOS enzymatic activity, protein levels and dimerisation. RESULTS: GTPCH gene transfer in EAhy926 endothelial cells increased BH4 >10-fold compared with controls (cells alone or control adenovirus infection), and greatly enhanced NO production in a dose-dependent, eNOS-specific manner. We found that eNOS was principally monomeric in control cells, whereas GTPCH gene transfer resulted in a striking increase in eNOS homodimerisation. Furthermore, the total amounts of both native eNOS protein and a recombinant eNOS-GFP fusion protein were significantly increased following GTPCH gene transfer. CONCLUSIONS: These findings suggest that GTPCH gene transfer is a valid approach to increase BH4 levels in human endothelial cells, and provide new evidence for the relative importance of different mechanisms underlying BH4-mediated eNOS regulation in intact human endothelial cells. Additionally, these observations suggest that GTPCH may be a rational target to augment endothelial BH4 and normalise eNOS activity in endothelial dysfunction states.     

内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性与东乡族原发性高血压的相关性

目的探讨东乡族人内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因G894T多态性与原发性高血压（EH）之间的相关性。方法应用聚合酶链反应—限制性内切酶片段长度多态分析法对甘肃临夏东乡族EH患者（EH组）和正常人群（NT组）的eNOS第7外显子894位处进行基因多态性分型,应用硝酸盐还原酶法方法检测血清一氧化氮代谢物（NOM）水平。结果eNOS基因G894T多态性符合Hardy-Weinberg平衡定律,EH组GT＋TT基因型和T等位基因频率均高于NT组（P〈0.05,〈0.01）;EH组中T等位基因携带者的收缩压、舒张压和平均动脉压均高于对应的GG基因型携带者（P〈0.05）。EH组GT＋TT基因型空腹血清NOM低于GG基因型（P〈0.05）。结论eNOS基因第7外显子G894T多态性的T等位基因与东乡族EH的发生相关联,T等位基因（298Glu→Asp）可能通过影响对应编码的eNOS活性而使T等位基因携带者NOM减少,进而参与EH发病。     

二甲双胍对波动性高糖诱导的内皮细胞功能障碍的逆转作用及其机制

目的探讨二甲双胍对波动性高糖诱导的内皮细胞损伤的保护作用及其可能机制。方法以体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为研究对象,分为6组：正常葡萄糖对照组、高渗对照组、持续性高糖组、波动J生高糖组、波动性高糖＋二甲双胍组以及波动性高糖＋二甲双胍＋化合物C组,各组均干预72h。以硝酸还原酶法检测细胞上清液亚硝酸盐浓度代表一氧化氮（NO）产生水平;流式细胞仪分析测定细胞内活性氧簇（ROS）水平;Westernblotting检测单磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（Thr-172,p-AMPK）及三磷酸鸟苷环化水解酶1（GTPCH1）的蛋白表达水平。组间比较采用单因素方差分析和Q检验。结果（1）与正常葡萄糖对照组（100％）相比,波动性高糖组细胞内ROS水平增加[（222．4±62．0）％],NO水平下降[（70．3±7．1）％];添加二甲双胍后ROS水平降低[（100．2±17．4）％],NO水平升高[（96．3±9．2）％];添加AMPK抑制剂化合物c后ROS水平增加[（167．2±19．6）％],NO水平降低[（83．3±8．7）％]。差异均有统计学意义（均P〈0．05）。（2）与正常葡萄糖对照组相比,波动性高糖组p-AMPK[（1．72±0．08）比（2．34±0．09）]和GTPCH1[（4．07±0．17）比（7．83±0．56）]表达水平降低;添加二甲双胍后p-AMPK（2．72±0．22）和GTPCH1（10．24±1．05）表达水平增高;添加化合物C后GTPCH1表达水平降低（2．39±0．34）。差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论二甲双胍可通过激活AMPK信号通路,上调GTPCH1表达,从而改善波动性高糖所致的内皮细胞功能障碍。     

Reversal of endothelial nitric oxide synthase uncoupling and up-regulation of endothelial nitric oxide synthase expression lowers blood pressure in hypertensive rats.

OBJECTIVES: We sought to examine the hypothesis that a pharmacologic up-regulation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) combined with a reversal of eNOS uncoupling provides a protective effect against cardiovascular disease. BACKGROUND: Many cardiovascular diseases are associated with oxidant stress involving protein kinase C (PKC) and uncoupling of eNOS. METHODS: Messenger ribonucleic acid (mRNA) expression was analyzed with RNase protection assay or quantitative real-time polymerase chain reaction, vascular nitric oxide (NO) with spin trapping, and reactive oxygen species (ROS) with dihydroethidium fluorescence. RESULTS: Aortas of spontaneously hypertensive rats (SHR) showed an elevated production of ROS when compared with aortas of Wistar-Kyoto rats (WKY). The aortic expression of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase subunits (Nox1, Nox2, Nox4, and p22phox) was higher in SHR compared with WKY. In SHR, aortic production of ROS was reduced by the NO synthase inhibitor N(G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), indicating eNOS "uncoupling" in hypertension. Oral treatment with the PKC inhibitor midostaurin reduced aortic Nox1 expression, diminished ROS production, and reversed eNOS uncoupling in SHR. Aortic levels of (6R)-5,6,7,8-tetrahydro-L-biopterin (BH4) were significantly reduced in SHR compared with WKY. Midostaurin normalized BH4 levels in SHR. In both WKY and SHR, midostaurin increased aortic expression of eNOS mRNA and protein, stimulated bioactive NO production, and enhanced relaxation of the aorta to acetylcholine. Midostaurin lowered blood pressure in SHR and, to a lesser extent, in WKY; the compound did not change blood pressure in WKY made hypertensive with L-NAME. CONCLUSIONS: Pharmacologic interventions that combine eNOS up-regulation and reversal of eNOS uncoupling can markedly increase bioactive NO in the vasculature and produce beneficial hemodynamic effects such as a reduction of blood pressure.     

Tetrahydrobiopterin, but not L-arginine, decreases NO synthase uncoupling in cells expressing high levels of endothelial NO synthase

Endothelial NO synthase (eNOS) produces superoxide when depleted of (6R)-5,6,7,8-tetrahydro-L-biopterin (BH4) and L-arginine by uncoupling the electron flow from NO production. High expression of eNOS has been reported to have beneficial effects in atherosclerotic arteries after relatively short periods of time. However, sustained high expression of eNOS may have disadvantageous vascular effects because of uncoupling. We investigated NO and reactive oxygen species (ROS) production in a microvascular endothelial cell line (bEnd.3) with sustained high eNOS expression and absent inducible NOS and neuronal NOS expression using 4,5-diaminofluorescein diacetate and diacetyldichlorofluorescein as probes, respectively. Unstimulated cells produced both NO and ROS. After stimulation with vascular endothelial growth factor (VEGF), NO and ROS production increased. VEGF-induced ROS production was even further increased by the addition of extra L-arginine. Nomega-nitro-L-arginine methyl ester decreased ROS production. These findings strongly suggest that eNOS is a source of ROS in these cells. Although BH4 levels were increased as compared with another endothelial cell line, eNOS levels were >2 orders of magnitude higher. The addition of BH4 resulted in increased NO production and decreased generation of ROS, indicating that bEnd.3 cells produce ROS through eNOS uncoupling because of relative BH4 deficiency. Nevertheless, eNOS-dependent ROS production was not completely abolished by the addition of BH4, suggesting intrinsic superoxide production by eNOS. This study indicates that potentially beneficial sustained increases in eNOS expression and activity could lead to eNOS uncoupling and superoxide production as a consequence. Therefore, sustained increases of eNOS or VEGF activity should be accompanied by concomitant supplementation of BH4.