气虚证H22荷瘤小鼠甲状腺独特上下调基因的表达特征

目的：揭示荷瘤小鼠气虚证甲状腺基因表达的特征。方法：采用荷瘤小鼠及其标准化四诊及辨证方法,应用GeneChip Mouse Exon1.0STArray等技术,检测H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证共3阶段4个证候甲状腺基因表达的差异,重点关注早期气虚证上下调且表达量高的基因。结果：气虚证荷瘤小鼠甲状腺独特上调基因有33个,其中表达较高的基因6个,分别为Mta2d1、Comd3、Ucp1、Psmc6、LOC665964、Cyp2j11;独特下调的基因有31个,其中正常组表达较高的基因有5个,分别为Lcn2、Arntl、Mansc1、Hk1、Rpl29。结论：肿瘤发生后,H22荷瘤小鼠甲状腺存在大量的基因表达改变,其中早期气虚证独特上调或下调基因,可能与气虚证本质有关。     

邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织基因的表达特征研究

目的揭示H22荷瘤小鼠邪毒壅盛证肿瘤组织基因表达的特征。方法采用GeneChipMouseExon1．0STArray等技术及芯片分析方法,观察H22荷瘤小鼠邪毒壅盛、早期气虚、中期阳气虚及中晚期气阴阳虚证肿瘤组织基因表达的差异。结果筛选到邪毒壅盛证独特性高表达的基因32个,其中包括Tete3、Phf7、Ldhc等参与睾丸发育、精子或卵子发生的基因22个,Adipoq、Nream、Tnfaip6等与肿瘤有关的基因4个,以及Atp8b3、Pnpla3、Retn等其他功能的基因6个。筛选到邪毒壅盛证独特性低表达的基因2个,有Cort和LOC668417。结论邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织中存在大量独特性表达的基因,可能是该证候与其他证候区别的内在特征。     

H22荷瘤小鼠不同阶段及证候的甲状腺上下调高表达基因

目的:揭示荷瘤小鼠甲状腺不同阶段上下调高表达基因特征.方法:采用荷瘤小鼠及其标准化四诊及辨证方法,以及GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术,检测H22荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证4个证候甲状腺上下调基因,重点关注那些高表达量的基因.结果:早期邪毒壅盛证和气虚证同时上调高表达基因1个即Ifi27,下调高表达基因2个即AY036118和Dub2a;中期阳虚证上调高表达基因25个,如Clec2g和Probe号6809296的基因等,下调高表达基因5个即Klklb27,Crispl,Fas,H2-Ea和GOs2;中晚期气阴阳虚证上调高表达基因1个即Miff,下调高表达基因3个即Spare,Col4al和Col3al.结论:部分基因表达量改变及功能特征呈现一定的趋势,如中期阳气虚证上调高表达基因数量明显多于早期及中晚期,且与细胞构造、运动、增殖、凋亡相关基因较多,推测可能与肿瘤发生相关,以上绝大部分基因,以往在甲状腺生理与病理研究中较少涉及.这些基因具体功能如何,及甲状腺在肿瘤发生中所起的作用,有待进一步研究.     

阳气虚证H22荷瘤小鼠垂体差异表达的基因

目的:筛选荷瘤小鼠阳气虚证垂体差异表达的基因,并简要分析其功能特征.方法:采用荷瘤小鼠及其标准化四诊及辨证方法,及GeneChip Mouse Exon1.0 ST Array等技术,检测H122荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证共3阶段4个证候垂体基因表达的差异,重点关注那些表达量大、差异显著的基因,筛选阳气虚证差异表达的基因.结果:筛选到阳气虚证独特上调的基因14个:LOC669166、Cd8b1、Cd3d、Ly6d、Lat、Orm2、Dntt、1700021K02Rik、A130072A22Rik、IDC669782、Ptpre、Igk-V21-9、Cxcll3、LDC668417,其中多数基因在正常小鼠及其他证候小鼠的垂体表达很低或几乎关闭;独特下调的基因3个:Wfdc1、Spook3、Mfan4.结论:H22荷瘤小鼠阳气虚证垂体基因表达与其他证候存在较大差异,其中部分可能是阳气虚证的标志基因.     

邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠胸腺独特上调的高表达基因

目的 观察邪毒壅盛证荷瘤小鼠胸腺基因表达的特征.方法 综合采用荷瘤小鼠及其标准化辨证方法,采用GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array检测不同证候H22荷瘤小鼠胸腺组织基因的表达,并分别筛选2006年及2009年两批数据中邪毒壅盛证独特高表达的基因,进行理论研究.结果 2006年、2009年早期邪毒壅盛证荷瘤小鼠胸腺组织一致独特上调的基因108个,取各自最高表达的15个基因,有8个重叠:Trim30、Sept6、Mcm3、Supt16h、Vps35、Smc3、Rsl1d1、Pa2g4,另分别有Smc1a、Eif3s10、Phf6、Sesn1、Iws1、Lin7c、Itch,以及Tax1bp1、Ifi204、Pnn、Ptbp2、Ascc3、Ddx10、Luc7l2等非重叠基因,这些基因主要涉及细胞的增殖、基因的表达与调控.结论 邪毒壅盛证荷瘤小鼠胸腺高表达的基因多涉及促进基因的表达与复制,这与该证候肿瘤增长迅速相关,提示胸腺尚处于被动且积极的免疫代偿状态;鉴于与邪毒壅盛证同期的气虚证,以及与其它对照比较,这些基因独特上调,提示荷瘤小鼠同病异证在胸腺层面是有其物质基础的.     

白花蛇舌草对肝癌H_(22)荷瘤小鼠抑瘤作用的研究

目的:探讨不同剂量白花蛇舌草对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用.方法:观察不同剂量白花蛇舌草对H22荷瘤小鼠肿瘤的抑瘤率、生命延长率、肝/体比、肺/体比、胸腺指数、脾脏指数以及用药前后体重变化等指标的影响.结果:不同剂量白花蛇舌草的抑瘤作用与模型组比较具有显著性差异(P<0.05);白花蛇舌草与DDP合用组与单用DDP组比较有显著性差异(P<0.05).结论:白花蛇舌草能有效地抑制H22肿瘤生长,并能显著加强化疗药DDP的抑瘤效果.     

气虚证H22肝癌小鼠神经内分泌免疫组织差异表达基因特征

目的:探讨气虚证肝癌小鼠神经内分泌免疫组织的基因表达特征。方法:采用实验小鼠及其标准化四诊及辨证方法以及GeneChip Mouse Exon1.0ST Array等技术,检测气虚证H22肝癌小鼠下丘脑、垂体、肾上腺、睾丸、颌下腺、胸腺、脾脏等基因芯片表达谱,采用倍数法筛选与正常组差异表达2倍以上的基因。结果:筛选到7个组织共同差异表达基因Rtp4和Irf7,6个组织中差异表达的基因分别是Car6、2310057J18Rik、Klk1b22、Gsg1、Mmp8、Ifi44,5个组织中差异表达的基因26个,包括Egf、Klk1b、Tnp2、Tsga2、Alb1、Mx2、S100a、Oas2、Oas1a、Slfn4、Cacna1g、Odf1、Pgk2、Oaz3、Adam3、Iqcf3、Ccl8、Saa3、Pip、Abpg、Crisp1、Siglec1、Gbp4等;4个组织中差异表达基因82个,包括Adam32、Akap4、Crisp2、Cxcl10、Gh、Irgm、Nr1d1、Tesp1、Tnp1等。以上基因参与的生物学过程主要集中于免疫应答、代谢、运输、精子发生与运动等功能。结论:气虚证H22肝癌小鼠在神经内分泌免疫组织存在共同差异表达的基因,可能是气虚证形成的生物学基础。     

不同证候H22荷瘤小鼠肿瘤ABC转运蛋白家族基因转录特征

目的:观察不同证候H22荷瘤小鼠肿瘤组织ABC转运蛋白家族基因表达的特征。方法:对来源于早期邪毒壅盛和单纯气虚、中期阳气虚和中晚期气阴阳虚四种证候小鼠H22肿瘤组织4张Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 STArray数据标准化处理后,筛选其中的ABC转运蛋白基因进行差异分析。结果:从芯片中共筛选出与ABC转运蛋白有关的基因47个,以邪毒壅盛小鼠肿瘤基因转录最活跃,气虚次之,阳气虚最低;四种常见证候间共有25个基因转录具有明显差异;Abce1和Abcf1等7个基因中在四种常见证候肿瘤中转录水平最高。结论:Tap1(Abcb2)和Abcd2等6个高表达基因可能是邪毒壅盛型小鼠肿瘤增长快的重要因素;不同证候荷瘤小鼠肿瘤组织中的ABC转运蛋白基因转录既存在一定共性又存在很大差异,进一步证明了H22荷瘤小鼠证候客观存在的物质基础,为中医辨证论治提供分子依据。     

H22荷瘤小鼠肿瘤发生后睾丸表达改变显著的基因

目的:探讨H22荷瘤小鼠肿瘤发生后睾丸基因表达谱改变的特征。方法:采用荷瘤小鼠标准化四诊及辨证方法,以及Gene Chip Mouse Exon1.0 STArray等技术,检测H22荷瘤小鼠睾丸组织早期邪毒壅盛证和气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证3个阶段4个证候睾丸基因表达谱的差异,重点关注肿瘤发生后一致上调或下调明显且表达量大的基因。结果:肿瘤发生后三个阶段一致上调的基因5个;一致下调的基因12个,其中7个与性激素和生殖有关;早期上调、中期和中晚期下调的基因1个;早期和中期上调、中晚期下调的基因3个。在这些基因中,Saa3在晚期气阴阳虚证表达上调了近60倍,Abpg、Pip、Car6在早期邪毒壅盛证表达上调了40~80倍,值得关注。结论:肿瘤发生后荷瘤小鼠睾丸基因表达的改变以下调为主,性激素合成与生殖受到影响;一些表达显著改变的基因值得进一步研究。     

正常与不同证候H22荷瘤小鼠肾上腺高表达的基因

目的:揭示正常与不同证候昆明种荷瘤小鼠肾上腺高表达的基因.方法:采用昆明种正常小鼠与腋下接种H22腹水瘤细胞的小鼠,取接种肿瘤后第8天(早期)邪毒壅盛证与气虚证、第21天(中期)阳气虚证、第29天(中晚期)气阴阳虚证荷瘤小鼠与正常对照组小鼠肾上腺,抽提RNA、纯化及Gene Chip Mouse Exon 1.0 ST Array检测.结果:筛选到402条高表达的基因,其中有1个及以上组别芯片读数计算值大于5 000的有88条.这些基因主要参与代谢和基因表达的调控,部分参与化学合成、化学加工修饰、运输和信号转导,以及部分参与免疫、细胞周期和细胞凋亡、发育:另有许多基因功能未知.结论:这些在正常与疾病小鼠肾上腺内持续且稳定表达的基因,可能对于维持肾上腺的正常生理功能具有重要的生物学意义;鉴于气虚证荷瘤小鼠这些基因大多表达量低于正常小鼠和同期的邪毒壅盛证小鼠,反映出气虚证候的本质及特征;再次,4个不同证候荷瘤小鼠肾上腺这些基因表达差异分别有集中的趋势,印证了中医学“同病异证“的理论及其本质,要求辨证论治.     

不同证候荷瘤小鼠睾丸差异表达基因的特征

目的：观察荷瘤小鼠肿瘤发生后不同阶段4个常见证候睾丸独特上、下调的基因。方法：采用荷瘤小鼠及其标准化四诊与辨证方法,及GeneChip Mouse Exon ST 1.0 Array等技术,检测早期邪毒壅盛证及气虚证、中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证睾丸基因的差异表达,重点关注那些表达较高的基因。结果：共捡出独特上调和下调的基因28个,其中有5个基因在不同证候中上下调不一致。肿瘤发生后早期邪毒壅盛证上调的基因8个：Abpg、Pip、Muc10、Car6、2310057J18Rik、K1k1b3、K1k1、Wfdc12,下调的基因5个：Spcs1、Dtx3、Rasa3、Sec1113、F5;早期气虚证上调的基因4个：Gpx5、Wbp5、Lcn5、Ap1s2,下调的基因1个：K1k1b26;中期阳气虚证无上调基因,下调基因3个,分别为K1k1b27、Spag5、Gpx5（在早期气虚证上调）;中晚期气阴阳虚证上调基因2个,分别为Saa3、S100a8,下调基因5个;Abpg、Pip、Muc10、Car6、Cuzd1（前4个在邪毒壅盛证上调）。结论：荷瘤小鼠在早期阶段,邪毒壅盛证与睾丸基因表达的紊乱关系较为密切;中期阳气虚证、中晚期气阴阳虚证睾丸基因以下调为主,提示中、晚期虚实夹杂证的荷瘤小鼠其睾丸功能下降。     

浅谈气虚证的辨治思路

气是构成人体生命活动的基本物质,能够推动人体新陈代谢,温煦机体,促进其正常的生理活动,气还能防卫固表,帮助机体抵御外邪。因此,气对于人体来说至关重要。如果人体出现气虚的表现,就会严重影响人体的生命活动。     

灵芪胶囊对H_(22)荷瘤小鼠bFGF蛋白表达的影响

目的:研究灵芪胶囊对肿瘤的抑制作用。方法:以S-P免疫组化方法检测荷瘤小鼠肿瘤组织内血管生成因子bFGF的表达情况的变化,研究灵芪胶囊对肿瘤血管生成的影响。结果:灵芪胶囊能够下调血管生长因子bFGF的表达从而达到抑制肿瘤血管生成的作用。结论:灵芪胶囊能够通过影响血管生成相关因子的表达,抑制肿瘤血管生成,并推断为抗肿瘤作用的基础之一。     

阳气虚证H22荷瘤小鼠胸腺独特上、下调的高表达基因

目的:观察荷瘤小鼠中期阶段阳气虚证胸腺独特上调和下调的高表达基因。方法:综合采用荷瘤小鼠及其标准化四诊及辨证方法,以及GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术,检测在肿瘤中期阳气虚证H22荷瘤小鼠胸腺组织基因的表达,筛选独特上调或下调者,并重点关注表达量高的基因。结果:肿瘤中期阳虚证荷瘤小鼠胸腺独特上调的基因达260个,下调仅15个。结论:(1)荷瘤小鼠发展到中期的阳气虚证,其胸腺虽然已出现萎缩的现象,但仍处于代偿阶段;(2)Hey2、Hivep2、Stat6、Prdm1、Avpr1a、Ralb、Trdn、Mcmdc1、Olfr1351、Avil、Gns、Ros1等高表达上调的基因,可能与促进T细胞的分化成熟有关;(3)St8sia4、Nxph4、Spred2、Bcas3、Tbcd、Ctns等独特下调基因标志着胸腺内基因表达调节在整体上出现了紊乱,可能预示着胸腺衰竭阶段的到来。这些构成了肿瘤中期阶段阳气虚证荷瘤小鼠胸腺基因表达层面的特征。     

反应停对小鼠荷瘤H_(22)的影响

目的研究不同剂量反应停及反应停协同环磷酰胺对小鼠荷瘤H22(肝癌)实体型肿瘤的影响。方法建立小鼠肝癌移植实体型肿瘤模型,比较不同剂量反应停对小鼠肝癌的影响,同时观察反应停协同环磷酰胺对小鼠肝癌的影响。通过研究反应停对小鼠迟发型变态反应的影响探究其免疫作用。结果反应停对小鼠荷瘤H22呈现明显剂量依赖性抑制作用,反应停与环磷酰胺具有协同抗小鼠肝癌作用。反应停对小鼠迟发型变态反应呈剂量依赖性促进作用。结论反应停具有抗肝癌作用,而且与环磷酰胺具有协同抗肿瘤作用,此作用与反应停抗免疫作用有关。     

扶正抗癌方对H_(22)荷瘤小鼠的抑瘤作用及其对IL-12和Survivin表达的影响

目的:通过实验研究扶正抗癌方对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及其对IL-12和Survivin表达的影响。方法:85只小鼠,随机抽取15只作为正常对照组(A),将剩余70只小鼠共同造模:在右腋皮下种植相同量的H22瘤株悬液,将造膜成功的小鼠随机纳入60只,采用每只右腋皮下接肝癌细胞悬液0.2mL再随机分成4组,于接种瘤细胞悬液24小时候开始给药。空白对照组(A):用生理盐水0.2mL/只/d;荷瘤对照组(B):用生理盐水0.2mL/只/d;连续给药14d,替加氟组(C):给予替加氟配置的液体灌胃0.2mL/只/d;扶正抗癌方组(D):浓度为1.89g/mL的中药煎剂灌胃,0.2mL/20g,1次/d,连续共14d;(扶正抗癌方组+替加氟组)联合用药组(E)组:扶正抗癌方浓缩浓度为3.78g/mL,0.1mL/20g,1次/d,替加氟浓缩浓度为30mg/mL的水溶液灌胃,0.1mL/20g,1次/d,联合灌胃。经口灌胃14d后,取瘤体称重,用免疫组化法检测各组IL-12和Survivin的表达。结果:联合用药组及、扶正抗癌方组、替加氟组各治疗组瘤组织Survivin表达显著下降,与荷瘤对照组比较具有非常显著性差异(P0.01);IL-12检测结果示:联合用药组与扶正抗癌方组及替加氟组比较具有显著性差异(P0.05),扶正抗癌方组与替加氟组比较无显著性差异(P0.05);结论:扶正抗癌方具有抑制肝癌侵袭转移的作用,联合西药治疗可减毒增效,提高免疫功能,改善生存质量;其机制与抗肿瘤下调抑制细胞凋亡的Survivin同时促进IL-12的表达及抗肿瘤侵袭与转移有关。     

灵芪胶囊对H_（22）荷瘤小鼠bcl-2蛋白表达的影响

目的：通过实验探讨灵芪胶囊对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及其作用机理。方法：采用体内实验法,制做肿瘤模型,经口灌胃灵芪胶囊11天后,用免疫组化法检测各组凋亡相关基因bcl-2的表达。结果：灵芪胶囊明显抑制肿瘤生长,三个剂量组bcl-2基因表达均小于模型组。结论：灵芪胶囊对H22荷瘤小鼠有明显抑瘤作用,其机制可能与抑制bcl-2基因表达有关。     

甲状腺激素释放相关水解酶基因在H22肝癌小鼠早期不同证候中的表达特征

目的：研究甲状腺激素释放相关主要水解酶基因在H22肝癌小鼠早期不同证候中的表达特征。方法采用标准化诊法技术筛选出早期邪毒证、气虚证H22肿瘤小鼠,先采用Affeymetrix基因芯片技术,初步获得甲状腺球蛋白（Tg）,即甲状腺激素前体蛋白,及其相关的水解酶基因表达特征,并筛选主要差异表达基因;进而重复实验,RT-PCR检测主要差异表达基因的变化,同时ELISA检测血清甲状腺激素T3和T4水平。结果①初次实验芯片结果,Tg及其释放相关重要的水解酶：组织蛋白酶B（Ctsb）、组织蛋白酶D（Ctsd）、组织蛋白酶l（Ctsl）、天冬氨酸肽酶（Napsa）、三肽酶I （Tpp1）在肝癌小鼠早期邪毒证、气虚证呈下调趋势[Tg（邪毒0.77、气虚0.84）、Ctsb（邪毒0.83、气虚0.91）、Ctsd（邪毒0.79、气虚0.95）、Ctsl（邪毒0.95、气虚0.65）、Napsa（邪毒0.78、1.05）、Tpp1（邪毒0.75、0.94）],以邪毒证下降尤甚。②酶联免疫吸附试验（ELISA）表明,在邪毒证[T3为（1.519±0.162）ng/ml、T4为（2.194±0.305）μg/dl]和气虚证[T4为（4.366±0.727）μg/dl]均出现下调,且邪毒证尤甚（P＜0.01）,与两批次Tg转录水平的变化相一致;③对Ctsb等基因的RT-PCR检测结果表明,Tg（邪毒0.22、气虚0.38）、Ctsb（邪毒0.31、气虚0.55）、Ctsd（邪毒0.36、气虚0.78）、Napsa（邪毒0.24、气虚0.59）基本一致,Ctsl（邪毒1.24、气虚2.11）和Tpp1（邪毒2.85、气虚0.85）虽趋势相同,但在气虚证表达量大于同期邪毒证上则始终一致。结论综合不同批次实验结果,H22肝癌小鼠早期甲状腺功能受到抑制,且邪毒证抑制程度更重。     

五味子多糖对H_(22)荷瘤小鼠肿瘤组织病理结构及总蛋白质组的影响

目的:探讨五味子多糖对H22荷瘤小鼠肿瘤组织病理结构及总蛋白质组的影响。方法:采用光学显微镜与电镜观察的方法,观察五味子多糖对H22实体瘤组织的病理学影响;采用双向电泳及银染法,观察五味子多糖对H22实体瘤组织蛋白质表达差异的影响。结果:五味子多糖给药组细胞异型性降低,癌组织中浸润大量的免疫细胞(白细胞和淋巴细胞),同时,肿瘤组织细胞及胞浆内细胞器都伴有坏死的现象;与正常组比较,五味子多糖高剂量组可使在模型组表达上调的9个蛋白质斑点表达量下降,接近正常组。结论:五味子多糖能抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生长,其作用机制可能与下调肿瘤组织中蛋白质表达有关。     

扶正抑瘤颗粒对荷瘤(H22)小鼠T淋巴细胞Fas/FasL蛋白表达的影响

目的:观察复方中药制剂扶正抑瘤颗粒(FYK)对荷瘤(H22)小鼠T淋巴细胞凋亡相关基因Fas/FasL蛋白表达的影响。方法:将48只小鼠分为中药大、小剂量组、天仙胶囊阳性对照组和模型组,造模形成实体瘤后,分别灌胃FYK和天仙胶囊、生理盐水,18天后取血应用流式细胞仪测定Fas和FasL的蛋白表达。结果:各治疗组Fas蛋白表达较模型组下降,与模型组相比较有显著性差异(P<0.001)。各治疗组FasL蛋白表达较模型组升高,与模型组相比较有显著性差异(P<0.001)。结论:FYK可显著减轻荷瘤(H22)动物T淋巴细胞凋亡,在肿瘤的免疫逃逸中有重要意义。