脂质体介导的IGF-1R反义寡核苷酸对胰腺癌细胞生长的抑制作用

目的　研究照射后脂质体 (lipofectin)介导的IGF 1R反义寡核苷酸 (ASON)体外抑制人胰腺癌细胞PC 3的生长情况。方法　体外6 0 Coγ射线照射后 ,观察PC 3细胞的集落形成情况 ,以了解其辐射敏感性及确定合适的辐射剂量。用MTT法比较脂质体介导的ASON直接转染与联合辐射转染对PC 3细胞的抑制效果 ,用流式细胞仪和RT PCR方法检测两种不同方法对PC 3细胞凋亡及IGF 1RmRNA表达的调控情况。结果　联合照射的脂质体介导的ASON组明显优于未照射组 (P <0 0 5 )。PC 3细胞的凋亡率及IGF 1R的mRNA水平亦均明显高于和低于未照射组 (P <0 0 5 )。结论电离辐射可促进脂质体介导的IGF 1R反义寡核苷酸转染 ,显著地降低IGF 1R的mRNA水平 ,诱导PC 3细胞的凋亡。     

辐射促进多药耐药反义寡核苷酸逆转耐药的实验研究

目的探讨辐射促转染的多药耐药基因（mdr1）反义寡核苷酸（ASON）逆转肿瘤细胞KBv200的耐药效果。方法应用MTT法比较脂质体介导的ASON直接转染与联合辐射转染的情况下KBv200细胞对长春新碱（VCR）的半数抑制量（IC50），再利用RT-PCR方法和流式细胞仪检测两种不同的转染方法对KBv200细胞的mdr1-mRNA及其表达产物P-糖蛋白（P-gp）的调控情况。采用耐药细胞株KBv200移植于裸鼠皮下，肿瘤局部2Gy^60Coγ射线照射后1h，瘤内注射脂质体介导的mdr1ASON，经VCR联合化疗。结果联合照射的ASON组明显优于未照射组（P〈0．05）。KBv200细胞的IC50、mdr1-mRNA的表达水平及P-gp的阳性率，均明显低于未照射组（P〈0．05）。联合照射组与未照射组肿瘤体积和肿瘤重量差异有统计学意义（P〈0．01）。结论辐射促转染的mdr1 ASON对肿瘤细胞具有较强的耐药逆转作用。     

重组腺病毒mIκBα基因联合γ射线治疗肝细胞癌的实验观察

目的 探讨重组腺病毒mIkBα基因（AdmIkBα）联合γ射线对人高转移性肝细胞癌HCC9204细胞和裸鼠HCC9204移植瘤生长的影响。方法利用有限稀释法测定病毒滴度，以不同感染复数（MOI）的AdIxBαm（10、20、30、50）转染HCC9204细胞，Westemblotting法检测转染前后细胞1：）65表达和mIxBa表达。采用4Gyγ射线对各组细胞进行治疗。MTT法检测转染组、转染组＋放射组、对照组细胞生长抑制率。建立裸鼠HCC9204肝癌动物模型，肿瘤局部注射AdmIkBα30MOI并联合6Gyy射线治疗，在不同时间测量肿瘤体积。结果病毒滴度1．252×10^9pfu／ml。mIkBa蛋白随AdmlteBa剂量增加而进行性增加，P65蛋白随AdmIkBα剂量的增加呈进行性递减。转染组体外细胞生长随AdmIkBα剂量的增加逐渐受抑制，经7射线照射后生长抑制更加明显。AdmIkBα转染和放射联合治疗后7～28d，裸鼠肿瘤生长速率明显低于单纯照射组、单纯转染治疗组。结论AdmIkBα转染联合Y射线治疗可增强对肝痛细胞杀灭作用．联合治疗明品优于单纯放疗组和单纯基因治疗组。     

188Re—k—ras—AGPNA诱导胰腺癌细胞凋亡及在荷瘤裸鼠体内的生物分布

目的研究胰腺癌k-ras点突变基因的反基因肽核酸（AGPNA）生物活性和”。Re—k—ras—AGPNA诱导人胰腺癌细胞凋亡及在荷瘤裸鼠体内的生物分布。方法（1）用RT—PCR检测转染k—ras．AGPNA后胰腺癌细胞k-ras癌基因的mRNA表达水平。（2）用流式细胞仪检测转染后胰腺癌细胞的k-ras蛋白表达水平。（3）给予188Re-k-ras-AGPNA和188ReO4-3～5d后,用流式细胞仪检测胰腺癌细胞凋亡率。（4）58只荷人胰腺癌裸鼠分为188Re—k—ras—AGPNA和188ReO4-2组,采取瘤内注射给药方式,在不同时间点（2组分别为15min,1h,4h,1d,3d,5d,7d与15min,1h,2h,4h,24h）显像后处死裸鼠,计算各组织的％ID／g,并计算各组织的吸收剂量（mGy／MBq）。对数据行单因素方差分析。结果（1）转染1nmol／mlk-ras—AGPNA组细胞的k-ras突变基因mRNA的灰度比和k-ras蛋白表达率分别为1．00±0．39和（15．05±5．07）％,比未给药的肿瘤细胞对照组[分别为1．86±0．07和（24．38±5．40）％]低（F=2．545,5．329,P均〈0．05）。（2）给药后4,5d,188Re-k-ras-AGPNA组漂浮细胞的凋亡率分别为（26．30±7．45）％和（27．90±10．38）％,比188ReO4组[分别为（8．75±3．11）％和（16．87±5．85）％]高（F=9．376,P均〈0．05）。（3）瘤内注射188Re—k—ra8-AGPNA后1h和1,7d肿瘤内放射性摄取分别为（37．47＋21．31）、（35．96±7．80）和（15．46±4．93）％ID／g。肿瘤内吸收剂量为15569mGy／MBq。结论k-ras．AGPNA能抑制k-ras基因在mRNA和蛋白水平的表达。188Re—k—ra,s—AGPNA能诱导胰腺癌细胞凋亡且瘤内注射后肿瘤部位摄取高、滞留时间长。     

^18F-FLT评价食管癌照射后早期生物学响应的实验研究

目的探讨^18F—FLT在评价食管癌细胞及其动物模型经X线照射后早期生物学响应中的应用价值。方法在体外以5、10和15Gyx线分别照射人食管癌细胞Eca-109,照射前及照射后2、4和8h检测细胞对^18F—FLT摄取率的变化、细胞相对存活率和ATP的表达情况。将24只荷食管癌裸鼠按随机数字表法分成4组：对照（未照射）组;10Gy照射后1、7及15d各1组,分别行^18F—FLT PET显像并测量肿瘤对^18F—FLT的摄取值（T／NT）的变化。显像后处死各组荷瘤裸鼠,取肿瘤组织,用免疫组织化学检测照射前、后瘤组织内细胞增殖核抗原（PCNA）及Ki67抗原的表达。组间差异比较用单因素方差分析及两独立样本t检验,数据间相关性分析用Pearson直线相关分析。结果照射前细胞对^18F-FLT摄取率为（4．00±0．42）％;经5、10、15Gy照射后2h分别下降至（3．65±0．41）％、（3．17±0．45）％和（2．53±0．28）％;照射后4h分别下降至（2．84±0．35）％、（2．58±0．39）％和（1．80±0．22）％;照射后8h分别下降至（2．71±0．23）％、（1．89±0．31）％和（1．44±0．20）％。与对照组比较,5、10、15q照射后2、4、8h,细胞相对存活率差异无统计学意义（F=4．02,P〉0．05）;ATP浓度下降明显,呈剂量依赖性。细胞受照后的^18F—FLT摄取率与ATP浓度呈正相关（r=0．89,P〈0．01）。^18F—FLTPET显像示裸鼠肿瘤呈高摄取,照射前T／NT为2．24±0．06,照射后1、7和15d分别下降至1．99±0．09、1．85±0．04和1．15±0．10。瘤组织对^18F-FLT的摄取值与PCNA、Ki67表达均呈正相关（r=0．83和0．88,均P〈0．01）。结论^18F—FLT在食管癌细胞及肿瘤内摄取的变化能较好地评价其照射后早期生物学响应,^18F—FLTPET有望用于监测食管癌照射后早期疗效。     

干扰血管内皮生长因子表达联合γ射线对食管癌细胞移植瘤的影响

目的 研究反义cDNA干扰血管内皮生长因子(VEGF)表达联合γ射线对裸鼠移植瘤的影响,并观察各组裸鼠肿瘤病理组织学和细胞生物学特征的变化,为VEGF基因治疗联合放射治疗食管癌提供理论依据。方法 将32只Balb/c/nu裸鼠随机分为4组:对照组、单纯照射组、反义组和反义+照射组,使用已转染和未转染反义VEGFcDNA TE-1食管癌细胞株,分别建立裸鼠爪垫移植瘤模型, 瘤体直径0.8~1.0 cm,⁶⁰Co γ射线18 Gy单次照射单纯照射组与反义+照射组裸鼠移植瘤,对比观察各组移植瘤生长情况,检测移植瘤组织中VEGF mRNA和蛋白的表达,并分析肿瘤组织中细胞凋亡情况。结果 与未转染两组比较,转染两组瘤体生长速度慢,成瘤潜伏期延长(t=13.898, P<0.01)。反义组肿瘤体积为(1207.50±97.07)mm³,反义+照射组为(1057.5±91.50)mm³,两者差异无统计学意义(t=1.124,P>0.05),而此2组与对照组(5442.50±185.08)mm³ 和单纯照射组(2922.50±152.773)mm³ 体积间差异有统计学意义(t=9.475~21.238,P<0.01)。反义组与反义+照射组VEGF mRNA和蛋白表达较对照组和单纯照射组差异有统计学意义(F=387.394、13.519, P<0.01)。结论 抗VEGF治疗可有效地抑制裸鼠移植瘤的生长,但单纯抑制VEGF表达对增加裸鼠移植瘤放射治疗增敏效果有限,需进一步研究。     

重组腺病毒介导PUMA基因对胰腺癌细胞的放射增敏作用

目的 探讨重组腺病毒(Ad)介导PUMA基因联合γ线对人胰腺癌的作用。方法 以不同感染复数(MOI)的Ad-PUMA(10、50、100)转染胰腺癌PANC-1细胞,RT-PCR和Western blot检测转染前后细胞内PUMA表达。PANC-1细胞分为4组:对照组、转染组、照射组、转染联合照射组。MTT比色法和流式细胞术检测各组细胞存活率和凋亡率。人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型分为4组:对照组、转染组、照射组、转染联合照射组,在不同时间测量肿瘤生长速率和凋亡指数。结果 PUMA表达随病毒MOI增加而进行性增加(MOI=10、mRNA=0.46±0.02、蛋白=0.75±0.09;MOI=50、mRNA=1.12±0.09、蛋白=1.01±0.18;MOI=100、mRNA=1.50±0.08、蛋白=1.80±0.15;P<0.05),细胞增殖随病毒MOI增加逐渐受抑制(r=-0.986?55),经γ线照射后增殖抑制更加明显(r=-0.971?26,P<0.05),而凋亡率上升(照射前=45.4%±5.26%,照射后=73.2%±6.62%,P<0.05)。Ad-PUMA转染和γ线联合照射后7~35d,裸鼠肿瘤生长速率明显低于单纯照射组、单纯转染组和对照组[第35天肿瘤体积分别为(19.82±6.45)、(39.5±9.23)、(33.6±10.3)、(52.0±11.43)mm³,P<0.05],凋亡指数升高(AI分别为0.43±0.05、0.29±0.10、0.24±0.05、0.00±0.00,P<0.05)。结论 PUMA基因转染联合γ线照射可增强对胰腺癌细胞杀灭作用,联合治疗明显优于单纯照射和单纯基因治疗。     

pEgr-hPTEN稳定转染联合辐射诱导人胶质瘤SHG-44细胞凋亡及Bcl-2表达下调

目的 探讨辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN体外稳定转染人胶质瘤SHG-44细胞后联合X射线照射，诱导细胞凋亡的作用及凋亡相关蛋白Bcl-2表达的变化。方法 以脂质体介导携有外源野生型PTEN基因的辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN，体外转染SHG-44细胞，筛选稳定转染的细胞克隆并扩增培养；应用电子显微镜、流式细胞仪等方法，检测稳定转染联合X射线照射对胶质瘤细胞超微结构、细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达等特性的影响。结果 稳定转染细胞超微结构有明显的退行性改变，可见核内染色质趋边的类似早期凋亡的改变；稳定转染联合X射线照射可诱导肿瘤细胞凋亡，5Gy以内随吸收剂量的增加，早期凋亡细胞百分数明显增加，稳定转染不同剂量照射组早期凋亡细胞百分数分别为稳定转染0Gy假照组的1．5—2．3倍、为未转染照射组的1．9—4．4倍、为未转染0Gy假照组的3．4—5．1倍；同时稳定转染细胞Bcl-2蛋白表达则呈剂量依赖性下降。结论 体外PTEN基因转染联合X射线照射可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多，Bcl-2蛋白表达下调，具有显著的肿瘤抑制作用。     

p53腺病毒重组体转染对p53缺失肿瘤细胞辐射敏感性的影响

目的观察p53腺病毒重组体（AdCMV-p53）转染对p53缺失肿瘤细胞辐射敏感性的影响。方法用腺病毒重组体（AdCMV—p53／GFP）转染经0、0．25、0．5、1．0、1．5、2．0Gyγ射线辐射的H1299（nullp53）和PC-3（nullp53）细胞，用流式细胞分析法检测外源性p53表达，用克隆形成法检测肿瘤细胞增殖能力。结果辐射联合AdCMV-p53转染组p53阳性细胞所占比例均明显高于单纯辐射组、单纯AdCMV—p53转染组和辐射联合AdCMV—GFP转染组同种细胞p53阳性率（P〈0．05）；AdCMV—p53转染不仅明显提高肿瘤细胞辐射敏感性，而且与肿瘤细胞组织来源有关。结论p53腺病毒重组体转染对p53基因缺失肿瘤细胞低剂量辐射敏感性的增强作用与肿瘤细胞来源的组织器官和细胞类型有关。     

胰岛素样生长因子1受体抑制剂对人食管癌移植瘤放射增敏研究

目的 观察胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)抑制剂AG1024对裸鼠EC9706食管癌模型的放射增敏作用及机制。方法 裸鼠皮下接种人食管癌EC9706细胞建立模型,待肿瘤长至100 mm³时按随机表将小鼠分成4组,对照组、单纯照射组、AG1024组、联合组。对照组:不处理;单纯照射组:第1、8天分别给予6 MV X射线,照射剂量单次8 Gy;AG1024组:AG1024腹腔注射30 μｇ/(kg·d),每周5次,共2周;联合组:给予AG1024腹腔注射和照射。每隔2天测肿瘤直径,第15天断颈处死小鼠计算抑瘤率。流式细胞仪检测各组肿瘤组织细胞周期改变;免疫组织化学法检测肿瘤组织细胞周期蛋白CyclinD1表达;TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡。结果 各组瘤重较对照组减小,抑瘤率分别为39.16%、18.73%和57.04%(F=13.566,P<0.05)。流式细胞仪检测联合组肿瘤细胞G₀/G₁及G₂/M期增多,S期减少,较单纯照射组差异有统计学意义(t=-6.654、-16.738、12.871, P<0.05)。免疫组织化学法检测联合组肿瘤组织细胞周期蛋白CyclinD1表达下降;TUNEL法检测联合组肿瘤组织出现凋亡细胞。结论 IGF-1R抑制剂AG1024能增加食管癌移植瘤的放射敏感性,改变细胞周期、诱导凋亡可能是其机制之一。