应用PCR—SSCP银染技术检测HBV基因点突变

目的：为了对乙型肝炎患者HBV基因突变进行大大面积筛检,建立简便 可靠的检测HBV基因突变的方法。方法：采用单链构象多态性（SSCP）银染技术,检测HBV Pre-C基因突变。结果：在10份HBeAg阳性标本中,有8份PCR阳性,SSCP显示有2份标本有HBV Pre-C基因突变,直接测序证实为非终止密码突变。48份抗－HBe阳性标本中,有12份为PCR阳性,有8份SSCP显示PCR产物单链泳运动状态异常,其中4份标本经直接测序证实在1898位发生了G→A变异,出现了TAG终止密码突变。结论：PCR－SSCP银染技术检测HBV Pre-C基因点突变有很高的特异性和敏感性,该方法稳定、简便、快速,能基本满足临床大面积大样本筛检的需要。     

一种简单迅速筛选肿瘤基因组中基因突变的方法

目的 建立一种新的非同位素ＳＳＣＰ分析方法。方法 常规提取人类基因组ＤＮＡ作为模板,ＰＣＲ扩增ｎｍ２３－Ｈ１基因,变性ＰＣＲ产物,６％非变性聚丙烯酰胺凝胶ＳＳＣＰ电泳,银染后分析结果。结果 改进了目前ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析中应用同位素标记的检测方法,采用银染方法,建立起简单迅速的非同位素ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析方法和适宜条件。并将这种方法成功地应用于肿瘤转移抑制基因点突变的检测。结论 非同位素聚合酶链反     

PCR-SSCP法检测胃癌E-cadherin基因突变

肿瘤细胞之间粘附功能破坏是细胞恶性转化的特征 ,也是发生侵袭转移的分子基础。因此 ,研究介导同型细胞粘附的细胞粘附分子 E- cadherin一直是肿瘤领域的热点。越来越多的证据表明 E- cadherin基因为抑癌基因 [1～ 5]。我们采用银染聚合酶链反应 -单链构象多肽性分析法 (PCR-     

PCR—SSCP技术快速检测结核分枝杆菌三种基因突变

聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)是快速检测基因突变的重要方式之一[1].应用此法对辽宁省90例涂阳患者痰标本分离结核分枝杆菌进行rpoB、rpsL、56例katG基因突变检测,与传统耐药结果比较分析,寻找结核分枝杆菌耐药性与基因突变的关系.     

PCR—SSCP方法研究血液系统肿瘤的p53d基因突变

目的：探讨p53基因突变在血液系统肿瘤发病及进展中的作用。方法：采用PCR－SSCP方法对34例血液系统肿瘤患者p53基因第5、8显子进行研究。结果：从1例急性粒细胞白血病（AML）（1／12,8．33％）,1例急性淋巴细胞白血病（ALL）（1／5,20％）,2例非霍奇金淋巴瘤（NHL）（2／5,40％）,2例多发性骨髓瘤（MM）（2／8,25％）中发现了p53基因突变。其中1例AML,1例NHL及1例MM,均在检测后3个月内死亡。结论：p53基因突变在血液系统肿瘤的发病及疾病发展中起着一定的作用。     

建立PCR—ELISA定量检测HBV DNA的技术

目的 建立一种敏感特异和精确的乙型肝炎病毒基因ＰＣＲ及其产物酶联杂交定量分析技术。方法 制备了一种与野生扩增片段等长的ＰＣＲ内参照;设计了一对ＨＢＶ基因组Ｓ区基因扩增引物,上游引物的５′－端用生物素修饰,可同时扩增长为３１９ｂｐ的野生和内参照片段。两套捕获探针可分别与竞争ＰＣＲ产物中的野生片段和突变片段杂交,在同一反应管内,加入已知量内参照及待测ＨＢＶ ＤＮＡ标本。进行ＰＣＲ扩增,然后用酶联杂交法进行产物分析。根据Ｃｌｅｍｅｎｔｉ等介绍的公式计算待测标本中的ＨＢＶＤＮＡ标本。进行ＰＣＲ扩增,然后用酶联杂交法进行产物分析。根据Ｃｌｅｍｅｎｔｉ等介绍的公式计算待测标本中的ＨＢＶＤＮＡ含量。结果 灵敏度达到１０＾－３ｆｍｏｌ／Ｌ。在该法中,由于有ＰＣＲ过程中的特异引物及酶联杂交过程的特异探针两个环节的限制,因此具有很     

HBV基因定量分析技术的原理和方法

一种理想的基因定量技术，除了在技术方法上力求完善外，还应能够检测各种形式的ＨＢＶＤＮＡ，包括各种亚型及ＨＢＶＤＮＡ突变株。事实上，现有任何技术手段均无法完全满足上述要求。目前比较成熟的基因定量分析技术可分为两大类，即分子杂交法和ＰＣＲ法。总体看来，两类技术各有所长，又各有不足，可互相弥补，配合使用。以下选择两类分析技术中具有代表性者，以及目前被公认比较合理和完善者，介绍其基本原理和操作方法。一、分子杂交定量分析技术（一）分支链ＤＮＡ信号放大技术（ｂＤＮＡ）该技术最初由美国Ｃｈｉｒｏｎ公司Ｕｒｄｅ…     

白血病银染核仁形成区蛋白变化与疗效的初步观察

白血病银染核仁形成区蛋白变化与疗效的初步观察杨凌陆桂君黎承平温柏平李惠民杨弘银染核仁形成区蛋白（ＡｇＮＯＲｓ）的方法已被广泛应用于肿瘤疾病的研究，对实体瘤的良、恶性鉴别、分级及估计预后有重要价值［１］。我们观察７２例白血病患者骨髓细胞ＡｇＮＯＲｓ计数...     

胰头部肿块型胰腺炎的临床特征及K—ras基因突变

目的：分析胰头部肿块型胰腺炎临床特征及K-ras基因突变以明确其为胰腺癌关系。方法：回顾性分析临床及随访资料并应用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）方法分别检测胰头部肿块型胰腺炎、胰腺癌、癌旁导管增生、手术切缘正常组织、石蜡包埋组织的K-ras突变。结果：胰头部肿块型胰腺炎和胰头癌血清总胆红素、CA19－9、ERCP检查结果的差异有助于两的鉴别诊断：肿块型胰腺炎增生导管K-ras突变率为40％（6／15），与癌周增生导管31．2％（10／32）的突变率相近，但显低于胰头癌83．3％（15／18）的突变率，且胰腺炎手术后患随访至2000年12月均健在且未发现胰头癌的临床表现。结论：良性胰腺疾病导管增生存在K-ras突变并不一定向恶性发展。     

PCR—SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌ｒｐｏＢ基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照、５０例耐ＲＦＰ（单耐和多耐）结核分枝杆菌临床分离株、１２例ＲＦＰ敏感菌株、３５例耐ＲＦＰ肺结核患者痰标本,采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测痰标本和菌株中结核杆菌ｒｐｏＢ基因突变。结果 ５０例耐ＲＦＰ菌株中有４５例ＰＣＲ－ＳＳＣＰ条带与     

乙型肝炎病毒基因型、BCP及PC区变异与拉米夫定治疗后HBV DNA反弹的关系

目的:探讨HBV基因型、C区基本核心启动子(BcP)及前C(PC)区变异与拉米夫定抗病毒治疗后HBV DNA反弹的关系.方法:应用多引物对巢式PCR法,PCR-序列分析法,检测拉米夫定治疗27例乙型肝炎患者(治疗组),以及19例从未用过抗病毒治疗患者(对照组)的HBV基因型PC区,BCP的突变位点.结果:27例HBV DNA反弹的患者9例检出G1896A变异率高于对照组(33.33% vs 5.26%,P<0.05),4例检出C1856T变异(14.81%).治疗组4份治疗前标本未检出G1896A、C1856T和BCP变异.与对照组比较,治疗组PC(G1896A)及BCP(A1762T G1764A)双变异的患者中B基因型的构成比增高,分别为75%和50%,C基因型的构成比下降,分别为25%和50%.其中在BCP(A1762T G1764A)变异患者中B、C基因型构成比与对照组比较有显著性差异(P<0.05).4例HBV DNA反弹患者治疗前未检出有基因变异,治疗后有2例检出变异,BCP变异1例,BCP PC变异1例.27例HBV DNA反弹患者BCP变异4例,PC变异2例,BCP PC变异8例.结论:BCP(T1762/A1764)变异、PC区(G1896A)变异可能与拉米夫定治疗后HBV DNA反弹有关.病毒变异导致的HBV DNA反弹可以是单基因变异引起,也可以是多个基因联合变异引起,拉米夫定治疗后B基因型患者更易发生A1762T G1764A变异.     

乙型肝炎患者检测肝组织HBV-DNA的意义

为了探讨提高乙型肝炎病毒微量检出率的有效途径。采用PCR分别检测血清及肝穿刺组织HBVD-NA，血清检出总阳性率为41.7%，肝组织检出总阳性率为72.9%。在血清HBsAg阴性的病例中PCR血清检出阳性率为26.7%。肝组织检出阳性率为66.7%。早此可见PCR检测灵敏。准确、特别对血清HBVM难以检测的微量HBVDNA更有价值。两种标本来源相比肝组织较血清为优。     

Mutation at codon 130 in hepatitis B virus (HBV) core region increases markedly during acute exacerbation of hepatitis in chronic HBV carriers

Mutations within T-cell or B-cell epitopes are suggested to have some influence on the clinical course of chronic hepatitis B virus (HBV) infection. To investigate the relationship between liver cell injury and heterogeneity of the HBV core gene, we focused on the sequence of codon 130, which is located on both T- and B-cell epitopes, and serially analyzed the proportion of mutant virus (core130Thr) to wild-type virus (core130Pro) during the exacerbation of chronic hepatitis B. Sera obtained serially from five HBV carriers who had exacerbation of hepatitis, and three asymptomatic HBV carriers (ASCs) with persistently normal serum aminotransferase (ALT) values were studied, using the restriction fragment length polymorphism (RFLP) method. Core130Pro predominated in the sera in the remission state, but core130Thr increased markedly in parallel with ALT elevation and decreased again after the ALT peak, followed by the predominance of core130Pro, in all the five patients. In one patient, the ratio of core130Thr/core130Pro (Thr/Pro) was more than 70% at the ALT peak. On the other hand, in sera from the three ASCs core130Pro always predominated, and no divergence was identified in the ratio of Thr/Pro. Our data suggest that codon 130 is one of the most important immunogenic regions in the HBV core gene and that elevation of Thr/Pro could be the result of immune selection. Received: January 21, 2000 / Accepted: October 6, 2000     

定量聚合酶链反应检测血清中HBV DNA及其临床应用

为探讨乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因含量与干扰素治疗效果的关系，采用信号引物能量转移定量ＰＣＲ方法，检测了２５例慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者干扰素治疗前后的血清ＨＢＶＤＮＡ含量。结量显示，慢乙肝血清ＨＢＶ基因含量范围在１０４至１０１１拷贝／毫升之间；干扰素完全反应组治疗前血清ＨＢＶＤＮＡ含量（１０６．１３±２．４）显著低于（Ｐ＜０．０１）部分反应（１０７．８４±３．３）和无反应组（１０６．６８±４．８），表明血清ＨＢＶＤＮＡ含量与干扰素治疗效果有关，而与ＡＬＴ水平关系不明８显。研究结果提示定量检测ＨＢＶＤＮＡ是预测和评价干扰素治疗效果的重要指标之一。     

HBV S基因亚型与前C基因1896位点变异关系的初步研究

目的:研究HBV S基因亚型与前C基因1896位点变异的关系。方法:对104例病人血清用PCR技术特异性扩增前C基因1896位点突变和用PCR-RFLP技术对HBV S基因分型。结果:①1896位点变异检出率为63.46％;②武汉地区HBVS基因亚型Ⅰ感染率为68.27％,亚型Ⅱ为25.00％,亚型Ⅲ为4.81％,亚型Ⅰ Ⅱ复合感染为1.92％;③在亚型Ⅱ中,单纯野生株感染为80.77％,单纯变异株为7.7％,野生株变异株同时感染为11.54％,而占感染多数的亚型Ⅰ中,野生株和变异株的感染无差异。结论:1896位点是高频率变异位点,其变异不是随机的,而是与HBV不同的S基因亚型有关,基因亚型Ⅱ不易发生1896位点变异,受感染的机体内环境只是起促进变异的作用。     

88例乙型肝炎病毒携带者前C区1 896位变异分析

目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)携带者前C区1 896位变异情况.方法 采用聚合酶链反应(PCR)和酶联定量检测法分析,检测88例HBV携带者(其中HBeAg阳性50例,HBeAg阴性38例,HBV DNA均阳性)前C区1 896位变异.结果 50例HBeAg阳性患者中前C区1 896位变异率为8%,38例HBeAg阴性患者中,其前C区1 896位变异率为31.5%,88例HBV携带者总变异检出率为18.2%.HBV携带者HBeAg阴性组变异率明显高于HBeAg阳性组(P＜0.05).结论 HBV携带者普遍存在前C区1 896变异.     

Detection of Hepatitis B Virus M204V Mutation Quantitatively via Real-time PCR

Background and AimsDrug-resistant DNA mutations of the hepatitis B virus (HBV) affect treatment response in chronic hepatitis B patients. We have established a new, sensitive, specific, accurate and convenient real-time PCR method to detect HBV mutations quantitatively.MethodsBlood samples were collected from patients showing viral breakthrough, primary nonresponse, or poor response during treatment, and mutations were detected via direct sequencing to assess our method. A plasmid containing the M204V mutation was synthesized and standard curves plotted.ResultsThe determination coefficient for linear correlation between Ct and log plasmid copy numbers was 0.996, where Ct value was −3.723log (DNA concentration) +48.647. Coefficients of variation indicated good reproducibility. Correctness was within tolerable bias. Limit of detection was 10³ copies/mL. Specificity, accuracy, positive predictive value and negative predictive value were 92.86%, 100%, 96.88%, 100% and 94.74%, respectively.ConclusionsThese results show that our method can be used to detect HBV M204V mutations with the advantages of sensitivity, specificity and efficiency, providing a new choice for monitoring drug resistance.