胚胎中脑神经干细胞的培养及分化条件探讨

目的:探讨神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的培养方法以及各种条件对NSCs生长状况的影响。方法:取SD大鼠胚胎中脑,在含细胞因子碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)和内皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)的无血清培养基中培养扩增,得到的神经球用神经巢蛋白nestin抗体鉴定和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxy uridine,Brdu)掺入检测增殖能力。血清诱导分化后用免疫荧光做星形胶质细胞酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神经元特异性Ⅲ型微管蛋白(neuron-specific classⅢβ-tubulin,β-Ⅲ-tublin)的双标检测。研究进一步观察了细胞因子b FGF和EGF单用及合用对克隆形成数量的影响及不同接种密度和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)对细胞生长的影响。结果:神经球nestin免疫荧光表达显示强阳性;Brdu掺入实验显示神经球细胞具有很好的增殖能力;分化后免疫双标结果得到了GFAP(68.32±5.70)%和β-Ⅲ-tublin(21.65±3.40)%的阳性表达;当2种因子同时存在时细胞克隆数量优于单因子作用组(P﹤0.05,与EGF组比较;P<0.01,与b FGF组比较);与对照组比较LIF作用组细胞数量明显增多(F=2 630.114,P=0.000);细胞接种密度对神经球的数量有明显影响(F=155.100,P=0.001),在(0.5~16.0)×105个/ml密度范围内,神经球数量随着接种密度增加而增加。结论:b FGF和EGF 2种细胞因子对NSCs的生长是必须的;长期传代过程中LIF能促进NSCs的生长;NSCs生长有密度依赖性,但接种密度应该控制在适宜范围内。     

小鼠牙髓干细胞培养及诱导分化

目的 :分离、培养小鼠牙髓干细胞并诱导分化 .方法 :采用酶消化培养法获得小鼠的单个牙髓细胞悬液 ,细胞密度调整为 1× 10 4/孔细胞 ,用 2 0 0mL·L -1胎牛血清的α MEM培养液培养 14d ,挑出细胞克隆消化传代 ,TGF β、BMP2 、bFGF细胞因子诱导 ,PCR检测DSPP的mRNA的表达 .结果 :小鼠牙髓细胞呈集落状生长 ,克隆形成率为 1.6 -2 .5个 / 10 4细胞 ,所形成的集落细胞结合紧密 ,细胞体积小、胞核大 ,经细胞因子刺激后的细胞表达DSPP的mRNA .结论 :培养的小鼠牙髓集落状生长的细胞具有干细胞增殖快等特性 ,细胞因子可诱导小鼠牙髓干细胞定向分化     

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点。方法采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原（Nestin）;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原。结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究。     

神经干细胞的诱导分化

受传统的影响,以前人们一般不认为中枢神经系统有干细胞,这是因为人们长期形成的中枢神经系统不可再生的观念。1992年,Reynolds和Weiss从成年小鼠纹状体分离了能在体外不断分裂增殖,具有多种分化潜能的细胞群,并明确地提出了神经干细胞的概念。目前已经证实,这种具有自我更新、自我维持、多潜能的神经干细胞确实存在于发育中的神经系统,并     

抗坏血酸诱导体外培养小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞

目的探讨采用抗坏血酸诱导体外培养小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell,mESC）分化为心肌细胞的可行性。方法未分化ES细胞在滋养层上长至汇合,胰酶消化成单个细胞经旋转生物反应器（RCCS）制备拟胚体（em-bryoid bodies,EBs）,EBs贴壁后用抗坏血酸诱导分化为心肌细胞。通过光镜观察跳动的心肌细胞,采用免疫组织化学、激光共聚焦显微镜（CLSM）和RT—PCR的方法鉴定心肌细胞。结果抗坏血酸能有效地诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化,诱导效率为90％;分化的心肌细胞自发而有节律地收缩,心肌肌钙蛋白T（cTnT）、α-辅肌动蛋白（α—actinin）、肌动蛋白（actin）表达阳性。此外,分化的心肌细胞还表达调控心肌发育的基因α—MHC、β—MHC。结论抗坏血酸能有效地诱导体外培养小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞。     

BDNF对大鼠胚胎神经干细胞诱导分化的影响

【目的】脑源性神经营养因子（BDNF）对体外培养大鼠神经干细胞（NSCs）诱导分化的影响。【方法】体外克隆化培养获得的NSCs中分别加入不同浓度的BDNF,采用倒置光显微镜观察细胞克隆形成,透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化,免疫组化的方法检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。【结果】在倒置光显微镜下可见细胞接种后5 d形成小细胞球,7 d成为大小不等的细胞克隆。在电镜下可见具有典型的神经干细胞和神经胶质样细胞特征。经BDNF处理7 d后星形胶质样细胞增多,且突起的长度随浓度的增加逐渐延长,尤以40 ng/ml组突起最为显著（P〈0.05）。免疫细胞化学检测GFAP的阳性颗粒位于细胞浆中,经40 ng/mlBDNF诱导后阳性率可达86.1%,与对照组（13.1%）比较有显著性差异。【结论】BDNF可诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞。     

人类中脑神经祖细胞的体外扩增及诱导分化

目的：探讨人类中脑祖细胞体外分离、培养及向多巴胺能神经元诱导分化的方法。方法：利用neurosphere法，在低氧分压的情况下建立中脑祖细胞克隆，并用纹状体培养上清对其进行诱导分化，观察TH阳性神经元的分化比率及成熟度。结果：中脑来源的神经祖细胞克隆，能以neurosphere形式生长，低氧分压对其克隆生长具有促进作用；纹状体培养上清可增加TH阳性神经元的分化比率，并能使TH阳性细胞具有更成熟的多巴胺能神经元的形态特征。结论：低氧分压更适于中脑神经祖细胞的体外扩增，纹状体培养上清对中脑祖细胞向多巴胺能神经元的分化及成熟具有促进作用。     

小鼠中脑神经干细胞体外培养方法的研究

目的改进小鼠中脑神经干细胞(NSCs)分离培养方法。方法分别采用机械法和酶消化法分离出生1～3d的小鼠中脑组织,在含体积分数为2%B27及20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养。采用巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、及神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色方法鉴定NSCs和分化细胞。结果在含bFGF及B27的DMEM/F12培养基中,可形成悬浮生长Nestin呈阳性的神经球。诱导分化的细胞可见GFAP或NSE免疫反应阳性细胞。机械法较酶消化法可获得较多的NSCs。结论在DMEM/F12培养基中添加2%B27及20ng/mL的bFGF可成功获得中脑NSCs,机械法为一种简便而有效的NSCs分离方法。     

PD大鼠纹状体提取液诱导中脑神经干细胞分化为多巴胺能神经元的研究

目的研究PD大鼠纹状体提取液诱对中脑神经干细胞的诱导分化作用.方法①体外分离、培养大鼠胚胎的中脑神经干细胞,并诱导其分化,巢素(Nestin)、神经丝-200(NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色鉴定.②加入纹状体提取液后,分化细胞用抗酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化鉴定,并用流式细胞技术检测分化比例.结果①从大鼠胚胎的腹侧中脑部位分离获得了大量未分化、呈巢状悬浮生长的细胞团,且能分化为神经元和神经胶质细胞.②经纹状体提取液诱导后,能够分化出多巴胺能神经元,分化比例达20%左右.结论纹状体提取液能诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化.     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

培养胚胎神经干细胞向少突胶质细胞诱导分化的实验研究

目的培养大鼠胚胎神经干细胞,诱导分化获得较高纯度的少突胶质细胞。方法取孕11.5 d的胚胎大鼠神经管尾段制备单细胞悬液,无血清条件培养基培养,获得神经干细胞;加入胎牛血清诱导分化,利用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞不同的生长特性进行分离,获取较高纯度的少突胶质细胞。结果本实验得到纯度达90%以上的少突胶质细胞。结论利用培养大鼠胚胎神经干细胞诱导分化可以获取较多较高纯度的少突胶质细胞,以进行进一步研究。     

通心络对大鼠胚胎神经干细胞增殖和分化的影响

目的 探讨不同剂量通心络含药血清对大鼠胚胎神经干细胞增殖和分化的影响及其可能作用机制.方法 自E12～14大鼠胚胎中分离、培养神经干细胞,添加不同剂量通心络含药血清干预,在干预后不同时段通过免疫荧光双标观察含药血清对大鼠胚胎神经干细胞增殖和分化的影响.结果 大鼠胚胎神经干细胞经通心络含药血清干预后,Nestin( )细胞比例先下降后回升,β-tubulin( )细胞比例3 d与7 d时与对照组相比有显著性差异;7 d时大剂量组β-tubulin( )细胞比例与小剂量组相比有显著性差异.结论 通心络可以促进大鼠胚胎神经干细胞的增殖及向神经元分化,大剂量组效应更明显及持久.     

C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定

目的体外分离、培养神经干细胞（NSCs）,并对其进行鉴定。方法采用手动法及胰蛋白酶消化法分离胎鼠脑细胞,用优化的无血清NSCs培养基进行培养。细胞免疫荧光法检测NSCs特异性标记分子的表达。结果分离的脑细胞体外培养48 h已大部分贴壁,3 d左右获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团。第3代时,很少见到贴壁细胞,几乎全是神经球,神经球周围存在较多微刺。细胞表达一种中间丝蛋白,即巢蛋白（nestin）。结论成功分离、鉴定出C57小鼠NSCs,并可在体外条件下进行传代扩增培养。     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法,探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞,并用EGF和血清诱导其分化,采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成,但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞,细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖,并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

脂肪基质干细胞跨胚层分化为神经干细胞的实验研究

目的：探讨脂肪基质干细胞向神经干细胞跨胚层分化的可行性,进而为神经系统损伤修复寻找理想的种子细胞．方法：无菌条件下取大鼠腹股沟脂肪组织,消化离心后低糖含血清培养基培养,待细胞生长至亚融合状态改用神经干细胞培养基诱导,用免疫荧光对诱导的细胞进行鉴定．结果：大鼠脂肪基质干细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的细胞,后者形成细胞球（或称“神经球”）,该细胞球表达特殊的神经干细胞Nestin抗原;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养,单个的细胞又很快形成新的神经球．神经干细胞球进一步分化,可见到有的细胞胞体增大并出芽,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系,表达Nse或Gfap抗原．结论：大鼠脂肪基质干细胞在一定条件下可以向神经干细胞跨胚层分化．该种来源的神经干细胞可能成为中枢神经系统损伤修复的理想种子细胞．     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及分化研究

目的:研究大鼠胚胎神经干细胞体外分离、培养的条件及增殖、分化特性。方法:取胎龄15~17 d的SD大鼠胎脑海马及室周组织,在含碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF),表皮生长因子(EGF),B27、N2添加剂的无血清培养基中培养,用有限稀释法进行克隆、传代,免疫细胞化学法鉴定神经干细胞克隆球及诱导分化后的细胞。结果:大鼠胎脑能在体外培养获得大量神经干细胞,并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:胚胎脑组织有丰富的神经干细胞,可在体外长期培养并保持干细胞特性,能分化为神经元、胶质细胞等终末细胞。     

新生大鼠脊髓源性神经干细胞的分离培养及分化鉴定

目的：探讨分离、培养新生大鼠脊髓源性神经干细胞的方法并对其进行分化鉴定,为临床应用脊髓神经干细胞进行周围神经系统疾病的替代治疗奠定细胞学基础。方法：首次采用注射器灌注法分离新生24 h Wistar大鼠脊髓源性神经干细胞,神经细胞培养液调节细胞终浓度并进行培养,形成克隆后,传代。将传至第1代培养细胞加入含10%胎牛血清的DMEM /F12 培养基诱导其分化。形态学方法观察细胞的生长状态,利用鼠抗Nestin抗体、鼠抗GFAP抗体、鼠抗MAP-2抗体进行分化的神经干细胞免疫组织化学鉴定。 结果：新生大鼠脊髓源性神经干细胞可在体外培养条件下贴壁生长,在血清的作用下可分化为具有典型神经细胞形态、表达特异性组织蛋白Nestin、GFAP、MAP-2的神经细胞。结论： 大鼠脊髓内可分离出脊髓源性神经干细胞,呈贴壁增殖状态,并有分化能力。     

胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展

最近研究表明胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)在体内外均可以发育分化出神经组织细胞，这对于了解神经发育的机制和研究神经组织退化性或者脑组织损伤性疾病的治疗具有重要的意义。本文就胚胎干细胞定向分化为神经组织细胞及其基因表达特点作一综述。     

Development of neural precursor cells from mouse embryonic stem cells

Embryonicstemcells(EScells)arederivedfromtotipotentcellsofearlyembryoandpossessunlimited,undifferentiatedproliferationinvitro[1].EScellshavetheinherentcapacityofdifferentiatingintoallcelltypesofthenervoussystemasdemonstratedbytheex-perimentthatchimericmicewereformedfromem-bryosinwhichEScellsaretransplantedintotheinnercellmass[2].ThesuccessfulestablishmentofhumanEScelllineindicatedprofoundimplicationthatEScellsmayprovideavirtuallyunlimiteddonorsourcefortransplantation[3]. Threepaperspublish…