干细胞因子及受体c-kit对A375细胞增殖和凋亡影响的体外研究

目的利用基因工程方法建立稳定表达干细胞因子受体(SCF/c-kit)的恶性黑素瘤A375细胞株,再给予外源性SCF/c-kit,观察其对A375细胞增殖、凋亡的影响。方法通过脂质体转染技术构建稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株(hc-kit/A375),给予A375细胞和hc-kit/A375细胞外源性SCF,将所有的细胞分为A375组、A375-SCF组、hc-kit/A375组和hc-kit/A375-SCF组。应用MTT法及流式细胞仪分析细胞的增殖和凋亡,并应用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化方法检测肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF),基质金属蛋白酶(MMP)-9及肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达。结果①通过脂质体介导能将c-kit-pcDNA3.1neo重组质粒成功转染入黑素瘤细胞,建立稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株hc-kit/A375,hc-kit/A375细胞中c-kit表达明显增加。②给予外源性SCF后,细胞的生长受到抑制,以培养后第5天尤为显著;细胞的凋亡率明显增加,S期比例降低,且hc-kit/A375-SCF组尤明显。③转染后细胞及加入SCF干预组VEGF、MMP-9分泌减少,而TNF-α的分泌增加。结论通过脂质体转染和G418筛选成功构建稳定表达c-kit的A375细胞株;通过增加A375细胞中SCF/c-kit的表达能改变肿瘤细胞对VEGF、MMP-9、TNF-α的分泌,抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡。     

PPAR-γ配体罗格列酮对人黑素瘤细胞体外趋化功能的影响及相关机制

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)配体罗格列酮(rosiglitazone,RGZ)对人黑素瘤A375细胞株体外趋化功能的影响及机制.方法:体外培养人黑素瘤A375细胞;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测RGZ对A375细胞的增殖抑制率;RT-PCR、Westem-blot分别检测RGZ对A375细胞的趋化因子受体CXCR4 mRNA及CXCR4蛋白表达的影响;用Boyden小室研究RGZ对A375细胞体外趋化功能的影响.结果:MTT法榆测结果显示在24 h干预点,浓度为10、25 μmol/L时,RGZ的细胞毒性作用不明显(P＞0.05);且RT-PCR、Western-Blot检测结果分别显示,RGZ能下调CXCR4mRNA及CXCR4蛋白的表达(P＜0.01).趋化实验显示,随着RGZ浓度的升高,穿过Boyden小室膜的A375细胞数显著减少(P＜0.01).结论:PPAR-γ配体RGZ能抑制人黑素瘤细胞的趋化功能,其机制可能与下调肿瘤细胞的CXCR4基因表达有关.     

肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 探讨肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。 方法 取对数生长期人单核细胞株U937,采用佛波酯诱导48 h后,分为3组, Mφ组（继续用佛波酯诱导48 h）、M1组（用25 mg/L LPS诱导48 h）、M2组（用15 μg/L IL-4诱导48 h）。酶联免疫吸附试验检测各组巨噬细胞上清中IL-12p70和IL-10表达水平。建立巨噬细胞与恶性黑素瘤A375细胞体外共培养体系,分别设单独培养组、Mφ组（A375细胞和Mφ巨噬细胞共培养）、M1组（A375细胞和M1型巨噬细胞共培养）、M2组（A375细胞和M2型巨噬细胞共培养）,分别运用噻唑蓝法、Transwell小室法观察不同激活途径的巨噬细胞对A375细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响。 结果 增殖实验显示,共培养48、72 h后Mφ巨噬细胞、M2型巨噬细胞显著促进A375细胞的增殖,M1型巨噬细胞抑制A375细胞的增殖,各处理组间两两比较,差异有统计学意义（均P < 0.05）,共培养24 h后各组间两两比较A375细胞增殖率差异无统计学意义（P > 0.05）。侵袭实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（147.00 ± 7.92、113.22 ± 8.15）较单独培养组（84.11 ± 6.07）明显增加（P < 0.05）,M1组穿膜细胞（56.44 ± 7.55）明显减少（P < 0.05）。迁移实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（198.33 ± 8.22、156.00 ± 8.83）较单独培养组（123.89 ± 7.01）明显增加（均P < 0.05）,M1组穿膜细胞（97.11 ± 6.75）明显减少（P < 0.05）。 结论 IL-4激活的M2型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起促进作用;脂多糖激活的M1型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起抑制作用。佛波酯诱导的巨噬细胞更倾向于M2型巨噬细胞表型。     

CD147 siRNA对恶性黑素瘤细胞株A375增殖及CD147表达的影响

目的 研究CD147siRNA转染对恶性黑素瘤细胞株A375中CD147表达及细胞增殖的影响。方法 将前期构建的重组质粒pSUPER/CD147 siRNA稳定转染至恶性黑素瘤细胞株A375中,采用半定量RT-PCR法检测转染细胞中CD147 mRNA的表达。采用MTT法检测转染pSUPER/CD147 siRNA对肿瘤细胞增殖的影响。结果 转染了pSUPER/CD147 siRNA的恶性黑素瘤细胞株A375中CD147 mRNA表达水平显著下调,其在转染后24h、48h和72h的增殖水平均显著下降。结论 siRNA转染能有效抑制恶性黑素瘤细胞株A375中CD147的表达,且能抑制肿瘤细胞的增殖能力。     

罗格列酮对人黑素瘤细胞株A375体外侵袭能力的抑制及相关机制

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）配体罗格列酮对人黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响及机制。方法 体外培养人黑素瘤细胞株A375;噻唑蓝法（MTT）检测罗格列酮对A375细胞的增殖抑制率;RT-PCR、Western印迹检测罗格列酮对黑素瘤侵袭相关基因基质金属蛋白酶2（MMP2）、组织金属蛋白酶抑制剂2（TIMP2）表达的影响。Matrigel侵袭实验检测罗格列酮对黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响。结果 MTT结果显示,在24 h干预点,罗格列酮浓度为10、25 μmol/L 时,对A375细胞增殖抑制率分别为（4.86 ± 0.31）%、（5.15 ± 0.52）%,细胞毒性作用不明显。罗格列酮能在mRNA和蛋白水平下调MMP2的表达（P < 0.01）,并上调TIMP2 mRNA的表达（P < 0.01）。侵袭实验显示,对照组、10 μmol/L罗格列酮组、25 μmol/L罗格列酮组穿过Transwell小室膜的A375细胞数依次为210.7 ± 14.9,154.1 ± 7.7,87.3 ± 8.1,差异有统计学意义（P < 0.01）。结论 罗格列酮能抑制人黑素瘤细胞株A375的转移,可能与其下调MMP2的表达有关。     

姜黄素对人黑素瘤A375细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究姜黄素抑制人黑素瘤A375细胞增殖及诱导凋亡的作用.方法 体外培养人黑素瘤A375细胞,倒置显微镜观察细胞形态;采用MTT法检测细胞增殖抑制作用;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡.结果 姜黄素可使A375细胞体积缩小,细胞变圆;姜黄素对人A375细胞的生长增殖有明显的抑制作用,并且这种作用呈时间和剂量依赖性;Annexin V/PI双染法证实姜黄素可以诱导A375细胞发生凋亡.结论 姜黄素对人黑素瘤A375细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用.     

白藜芦醇对黑素瘤细胞周期的影响

目的:研究白藜芦醇对黑素瘤细胞周期的影响并探讨其作用的分子机制.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测白藜芦醇对人黑素瘤A375细胞株增殖的影响;碘化丙啶(PI)单标流式细胞术测定白藜芦醇对A375细胞周期的影响:免疫印迹法(Western-blot)检测白藜芦醇对A375细胞周期素(cyclin)D1及p21蛋白表达的影响.结果:白藜芦醇对A375细胞具有明显抑制作用,其抑制增殖作用呈量效及时效关系;白藜芦醇处理组A375细胞周期明显发生改变,细胞周期被阻滞于G1期;白藜芦醇明显下调A375细胞周期素D1的表达,同时上调p21蛋白的表达水平.结论:白藜芦醇可通过调控细胞周期进程抑制黑素瘤细胞增殖,其调控细胞周期的机制与调节细胞周期素D1/p21的表达有关.     

维A酸CD437和阿维A抑制人黑素瘤A375细胞的比较

目的探讨合成的维A酸CD437与阿维A对体外培养的人黑素瘤A375细胞的增殖抑制、凋亡诱导、周期阻滞作用及对Bax/bcl-2蛋白表达的影响。方法MTT法测定CD437及阿维A对人黑素瘤A375细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测两种药物诱导细胞凋亡及周期阻滞;细胞爬片SABC免疫细胞化学分析两种药物对细胞Bax/bcl-2蛋白表达的影响。结果干预24h后,10-5mol/L维A酸CD437和阿维A对人黑素瘤A375细胞的增殖抑制率(PIR)和凋亡率分别为58.6%和43.25%,28.03%和17.13%(P<0.05),CD437促A375细胞G0/G1期阻滞,而阿维A无此作用;两药均上调A375细胞Bax蛋白表达和下调bcl-2蛋白表达,但CD437组与阿维A组差异无显著性。结论与阿维A相比较,CD437更有效抑制人黑素瘤A375细胞的增殖及更明显的凋亡诱导和G0/G1期阻滞作用;在辅助治疗黑素瘤方面,CD437比阿维A可能更具潜力。     

溶瘤腺病毒介导的IL-18在黑素瘤A375细胞中的表达

目的构建携带人IL-18基因的溶瘤腺病毒,观察在A375细胞中IL-18基因的表达情况。方法将pZD55-IL-18与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染293细胞获得重组腺病毒。PCR鉴定条件增殖腺病毒ZD55- IL-18。以ZD55-IL-18感染人黑素瘤A375细胞系,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-18基因mRNA的表达;Western blot法检测腺病毒E1A的表达情况;结晶紫染色法检测细胞杀伤作用;MTY法检测细胞存活情况。结果PCR鉴定表明ZD55-IL-18构建成功;RT-PCR和Western blot结果表明,ZD55-IL-18能高效介导IL-18基因在A375细胞中的表达,并在肿瘤细胞内表达E1A;结晶紫染色和MTT结果表明,ZD55-IL-18对A375细胞有明显的杀伤作用。结论构建成功的溶瘤腺病毒ZD55-IL-18,可在A375细胞中高效表达IL-18基因,并能抑制黑素瘤细胞生长。     

皮肤黑素瘤细胞与血管内皮细胞间VEGF-IL-6-STAT3信号交互作用机制

【摘要】 目的 研究皮肤黑素瘤细胞与血管内皮细胞间VEGF-IL-6-STAT3信号交互作用机制。 方法 将血管内皮细胞EC-304分成3组：对照组,常规培养;血管内皮生长因子（VEGF）组,在含VEGF165（50 μg/L）的内皮细胞培养基中培养;A375共培养组,与黑素瘤细胞A375共培养。24 h、48 h、72 h后收集培养液,酶联免疫吸附实验检测白细胞介素6（IL-6）的分泌量。将A375细胞分为4组：对照组,常规培养;A375 + EC-304组,与EC-304共培养;A375 + EC-304 + IL-6组：与EC-304细胞在含STAT3通路激动剂IL-6（50 μg/L）的DMEM中共培养;A375 + EC-304 + JSI-124组：与EC-304在含STAT3通路抑制剂JSI-124（1 μmol/L）的DMEM中共培养。分别在24 h、48 h、72 h后收集细胞,用Western印迹、CCK-8、Transwell侵袭实验分别检测STAT3、p-STAT3蛋白表达、细胞增殖活性及侵袭活性。采用双因素方差分析及t检验统计分析数据。结果 与对照组比较,VEGF组、A375共培养组EC-304培养基中IL-6分泌量均升高（FVEGF = 29.63,P < 0.001;FA375 = 11.09,P = 0.020）。与对照组比较,A375 + EC-304组A375细胞p-STAT3蛋白表达升高（P < 0.001）,细胞活性增强（P < 0.001）,侵袭细胞数从（86.13 ± 7.24）个增加到（152.66 ± 16.04）个（t = 4.43,P < 0.001）;与A375 + EC-304组比较,A375 + EC-304 + IL-6组细胞p-STAT3蛋白表达升高（P < 0.001）,细胞活性增强（P < 0.001）,侵袭细胞数量增加至（187.34 ± 14.38）个（t = 2.17,P < 0.001）;与A375 + EC-304组比较,A375 + EC-304 + JSI-124组细胞的p-STAT3蛋白表达降低（P < 0.001）,细胞活性减弱（P < 0.001）,侵袭细胞数减少至（124.92 ± 8.72）个（t = -1.86,P < 0.001）。结论 皮肤黑素瘤A375细胞与血管内皮细胞之间存在VEGF-IL-6-STAT3信号交互作用机制,这种机制可促进A375细胞的增殖和侵袭。     

丹参酮ⅡA对黑素瘤细胞侵袭迁移能力的抑制作用及机制

目的 探讨丹参酮ⅡA对黑素瘤A375细胞侵袭转移的作用及趋化因子受体7(CXCR7)基因与蛋白表达的影响.方法 体外培养黑素瘤A375细胞,经1、2、4mg/L丹参酮ⅡA处理48 h后,细胞划痕实验和Transwell细胞体外侵袭实验分别测定细胞迁移和侵袭能力,实时荧光定量PCR和Western印迹分别检测A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平.结果 1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA处理A375细胞48 h后,Transwell细胞体外侵袭实验显示,每高倍(×200)视野下迁移穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为71.00±4.00、51.00±2.00、37.00±3.61,而细胞划痕实验显示,细胞迁移数分别为301±3.00、253.00±3.61、126.00±7.00,均显著低于对照组(105.33±6.51、332.00±6.24,均P＜0.05),且丹参酮ⅡA对A375细胞侵袭、迁移能力的抑制作用随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强(均P＜0.05).实时荧光定量PCR及Western印迹显示,1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA组CXCR7 mRNA的相对表达量分别为0.63±0.04、0.44±0.02、0.31±0.01,蛋白表达水平分别为0.573±0.015、0.416±0.011、0.260±0.055,均显著低于对照组(1.00±0.02、0.9000±0.010,均P＜0.05),且丹参酮ⅡA对A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白表达的抑制能力随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强(均P＜0.05).结论 丹参酮ⅡA可通过下调CXCR7表达抑制黑素瘤A375细胞的侵袭迁移能力.     

CCR5 usage by CCL5 induces a selective leukocyte recruitment in human skin xenografts in vivo

CCR5 is one of the major inflammatory chemokine receptors with potential therapeutical applications in humans. However, the redundancy of chemokines and their receptors, and the species specificity of chemokine receptor antagonists pose challenges to understanding of the role they play in pharmacological situations. To address this question, we used a humanized severe combined immunodeficient mouse model grafted with human skin and autologous leukocytes, and evaluated the effect of a blocking antibody against human CCR5, on CCL5-induced cutaneous leukocyte recruitment in vivo. At baseline, CCL5 induced a significant recruitment of T cells mainly of the memory phenotype, of monocytes/macrophages, eosinophils, and IFN-gamma(+) but not IL-4(+) and IL-5(+) cells. In vivo, anti-CCR5 antibody was able to almost completely inhibit the recruitment of monocytes/macrophages and T-helper (Th)1-type cells to inhibit partially the attraction of memory T cells, but had no effect on eosinophil infiltration, although all these cell types express other CCL5 binding chemokine receptors than CCR5. These results indicate that the in vivo environment regulates target cell specificity of CCL5 leading to differential cell recruitment, suggesting that antagonizing CCR5 receptor may be of therapeutic value in diseases such as acquired immuno deficiency syndrome, where CCL5/CCR5, monocytes, and Th1-type cells play a predominant role.     

Effect of an antiallergic drug (Olopatadine hydrochloride) on TARC/CCL17 and MDC/CCL22 production by PBMCs from patients with atopic dermatitis

BACKGROUND: Atopic dermatitis (AD) is a chronic inflammatory skin disease characterized by the predominant infiltration of Th2-type cells in lesional skin. Thymus and activation-regulated chemokine (TARC/CCL17) and monocyte-derived chemokine (MDC/CCL22) are Th2-type cytokines, and it has been reported that serum CCL17 and CCL22 levels are associated with AD disease activity. Olopatadine hydrochloride (Olopatadine) is an antiallergic drug with selective histamine H(1) receptor antagonist activity. The effect of Olopatadine on chemokine production by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in AD patients has not been completely elucidated. OBJECTIVES: This study was undertaken to clarify the effects of Olopatadine on CCL17 and CCL22 production by PBMCs from patients with AD during the treatment. METHODS: We measured plasma levels of CCL17, CCL22, IFNgamma, IL-12 and IL-18 in 15 patients with AD before and after treatment with oral Olopatadine (10 mg/day) for 4 weeks. We also examined disease activity using SCORAD index, eosinophil numbers in peripheral blood and serum levels of LDH. PBMCs from the patients were taken before and after the treatment and cultured with or without dust mite allergen extract (DME) for 3 or 5 days. CCL17, CCL22, IFNgamma, IL-12 and IL-18 levels in the supernatants of cultured PBMCs were measured. RESULTS: SCORAD index and eosinophil numbers in peripheral blood significantly decreased during treatment of AD patients with oral Olopatadine and topical corticosteroids for 4 weeks. The plasma levels of CCL17 and CCL22 significantly decreased after the treatment compared with before the treatment (p<0.05) and were significantly correlated with SCORAD index. PBMCs from AD patients taken after the treatment and cultured with DME for 5 days, showed significantly lower levels of CCL17 production than those taken before the treatment (p=0.018). PBMCs from AD patients taken after the treatment and cultured with DME for 5 days, also showed significantly lower levels of IFNgamma production than those taken before the treatment (p=0.012). CONCLUSION: Our data demonstrate that Olopatadine inhibits CCL17 and CCL22 production by PBMCs from AD patients, which are important regulators of Th2 recruitment in the skin.     

血管内皮生长因子-阿柔比星脂质体靶向杀伤恶性黑素瘤细胞的实验观察

目的 应用包裹阿柔比星的血管内皮生长因子（VEGF）的长循环脂质体（阿柔比星-VEGF-SSL）于体外靶向杀伤恶性黑素瘤细胞。方法 通过体外结合试验，验证阿柔比星-VEGF-SSL对恶性黑素瘤A375细胞的特异结合能力。通过体外细胞毒试验（MTT），检测阿柔比星-VEGF-SSL对A375细胞增殖活性的影响。结果 阿柔比星-VEGF-SSL可与A375细胞特异结合，结合率可达非特异性脂质体的2.15倍。阿柔比星-VEGF-SSL可特异抑制A375细胞的增殖活性。48 h细胞毒试验阿柔比星-VEGF-SSL抑制A375细胞增殖活性的作用与游离阿柔比星相似（P ＞ 0.05），优于无VEGF的阿柔比星脂质体（阿柔比星-SSL）（P ＜ 0.05），而对非靶细胞（黑素细胞）增殖活性的抑制作用弱于两者。0.5 h预处理试验表明：缩短药物与细胞接触时间后，阿柔比星-VEGF-SSL仍保持较强抑制A375细胞增殖活性的作用。结论 阿柔比星-VEGF-SSL可特异性识别恶性黑素瘤A375细胞，并作为良好载体将阿柔比星带入瘤细胞，显著抑制A375细胞的增殖活性，实现其靶向杀伤作用。     

表没食子儿茶素没食子酸酯抑制白细胞介素17诱导的角质形成细胞增殖和凋亡

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对白细胞介素17(IL-17)诱导的角质形成细胞损伤的保护作用及其机制.方法 实验分空白对照组、IL-17组、IL-17+ EGCG组、IL-17+ SP600125组和IL-17+EGCG+茴香霉素组.CCK-8试剂盒检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;ELISA试剂盒检测IL-6、IL-23和IL-8的表达;Western印迹检测JNK和P-JNK的表达.结果 IL-17促进HaCaT细胞增殖,且增殖率与IL-17浓度有关,90 μg/L IL-17组的细胞增殖率最高(P＜0.05).60 μmol/L EGCG显著抑制90 μg/L IL-17诱导的细胞增殖(P＜0.05),促进细胞凋亡(P＜0.05),降低IL-6、IL-23和IL-8的表达(P＜0.05).与IL-17组相比,IL-17+ EGCG组、IL-17+ SP600125组的P-JNK表达显著下调(P＜ 0.05),细胞增殖率降低(P＜0.05),IL-6、IL-23和IL-8的表达减少(P＜0.05);与IL-17+ EGCG组相比,IL-17+ EGCG+茴香霉素组的P-JNK表达显著上调(P＜0.05),细胞增殖率和IL-6、IL-23、IL-8的表达均明显上升(P＜0.05).结论 EGCG对IL-17诱导的HaCaT细胞增殖凋亡、炎症反应等损伤具有保护作用,其保护作用可能与抑制JNK信号通路有关.     

携带IL-24基因的溶瘤腺病毒诱导黑素瘤细胞凋亡

目的 探讨携带IL-24基因的溶瘤腺病毒（ZD55-IL-24）诱导人黑素瘤A375细胞凋亡的作用。方法 用PCR方法鉴定ZD55-IL-24,并大量扩增、纯化和病毒滴度测定。将ZD55-IL-24感染人黑素瘤A375细胞。结晶紫染色观察细胞毒性,MTT法测定细胞存活率,Western印迹检测溶瘤腺病毒E1A、IL-24基因蛋白表达。结果 PCR鉴定表明ZD55-IL-24包含IL-24基因且没有野生型腺病毒污染;结晶紫染色结果表明ZD55-IL-24对A375细胞有明显的细胞毒性效应。MTT法结果显示,ZD55-IL-24对A375细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性效应。Western印迹结果表明ZD55-IL-24能在A375细胞内高效表达E1A、IL-24基因。结论 溶瘤腺病毒ZD55-IL-24能携带IL-24基因在黑素瘤A375细胞中高效表达,抑制细胞增殖并诱导其凋亡。