拉米夫定耐药HBV毒株伴随变异与YMDD变异的关系

目的研究拉米夫定耐药（LAMr）HBV毒株伴随变异及其与YMDD变异的关系。方法PCR方法扩增LAMr病人血清的HBVRT区基因，直接测序PCR产物。对测序发现含有LAMr变异的105例病人血清检测变异时HBVDNA载量，分为第1组含rtV173L／M或rtV207M／L／I变异、第2组含rtS213T变异、第3组不含此3种变异，共3组进行分析。结果①拉米夫定（LAM）治疗B、C基因型乙型肝炎病毒（HBV）感染的慢性乙型肝炎（CHB）病人耐药主要变异位点为YMDD变异，可以伴随rtL180M、rtV173L／M、rtV207M／L／I、rtS213T等变异，LAMr变异形式构成与基因型无关（P=0．2620）。②rtM204I、rtM204V、rtM204V／I变异分别有38．8％、89．2％、73.3％伴随其它位点变异（P〈0．0001）。③3组测序发现变异时HBVDNA载量分别为（7．43±0．16）log10拷贝／mL、（5．01±0．90）log10拷贝／mL、（5.75±0．34）log10拷贝／mL（F=4．48，P=0．0240）。结论LAM治疗B、C基因型HBV感染的CHB病人耐药变异形式构成无显著差异，rtM204V变异较rtM204I变异更易伴随其它位点变异，伴随变异rtV173L／M、rtV207M／L／I可以增强YMDD变异HBV毒株的复制能力。     

拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者HBV P基因区突变序列分析

目的 探讨拉米夫定耐药慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV P基因逆转录酶区(RT区)序列突变特点.方法 收集115例接受拉米夫定治疗的CHB患者的临床资料,采用PCR产物直接测序法检测HBV P基因RT区序列耐药变异.结果 人选的115例患者中103例检测到拉米夫定基因型耐药变异,最主要的耐药变异模式为rtL180M rtM204V和rtM204I,分别占58.3％和22.3％,其他耐药位点包括rtL80V/I、rtT184S和rtA200V,并在5例患者中检测到RT区3个位点的联合变异.结论 对拉米夫定治疗患者的耐药检测除了HBV P基因区常见的rtL180和rtM204位点变异外,还应考虑其他位点的联合耐药变异.     

替比夫定抗病毒治疗不同时间慢性乙型肝炎患者HBV P基因RT区序列突变模式及耐药率的改变

目的：通过研究替比夫定治疗不同时间慢性乙型肝炎患者HBV P基因RT区序列突变模式及耐药率的改变,探讨替比夫定的主要耐药变异模式及耐药率。方法：应用重组克隆测序检测法检测47例接受替比夫定治疗1、2、5年的慢性乙型肝炎患者HBV P基因区序列。结果：应用替比夫定治疗1年者有2例（4.26%）出现常见变异位点,P基因区突变模式均为rtM204I;治疗2年者有10例（21.28%）出现变异位点,9例突变模式为rtM204I,1例突变模式为rtL180M+rtM204I;治疗5年者有24例（51.06%）检测到替比夫定常见变异位点,16例（66.7%）变异模式为rtM204I、4例（16.7%）为rtL180M+rtM204I,另外还有rtL181V+rtM204I、rtM204V、rtM204I+rtN238H、rtL180M +rtM204I+rtD263E各1例。结论:替比夫定的主要耐药变异模式为rtM204I和rtL180M+rtM204I。替比夫定治疗1、2、5年的耐药率分别为4.26%、21.28%和51.06%。提示替比夫定的5年耐药率明显低于拉米夫定的4年耐药率,但替比夫定的耐药率高于阿德福韦酯。     

核苷（酸）类似物相关HBV P基因区耐药变异的焦磷酸测序

目的  分析HBV P基因区核苷(酸)类似物相关10个位点的变异情况。方法  采用焦磷酸测序法对NA治疗并发生病毒学突破或不充分病毒学应答的慢性乙型肝炎患者HBV P基因区10个位点(rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、rtM204V/I、rtN236T、M205V)进行检测。结果  拉米夫定(LAM)耐药48例,4个耐药位点呈8种模式,以rtM204为主;阿德福韦酯(ADV)10例,2个耐药位点呈4种模式,以rtA181为主;替比夫定(LdT)4例,2个耐药位点呈2种模式,均存在rtM204I;恩替卡韦(ETV)6例,7个耐药位点呈4种模式,以rtT184多见。结论  应用NA可筛选出HBV P基因区的相关耐药变异,建议病毒突破患者检测耐药并行个体化治疗。     

慢性乙型肝炎拉米夫定治疗后病毒基因变异的分析

目的 探讨拉米夫定治疗慢性乙型肝炎发生病毒变异的情况,从而有效地指导临床治疗和预后判断.方法 采用基因测序技术检测74例经拉米夫定治疗后发生病毒变异的血清进行乙肝病毒P区全序列测定,按不同变异位点分为4组(rtV173L、rtL180M、rtM204V/I、rtL180M与rtM204V/I联合组),比较4个位点变异患者用药前及发生变异后的ALT、HBV DNA含量的变化情况.结果 74例拉米夫定变异患者rtV173L发生变异4例.rtL180M发生变异13例,rtM204V/I发生变异22例,rtL180M与rtM204V/I联合组发生变异35例.服药前各组ALT、HBV DNA含量差异无显著性(P＞0.05),rtL180M与rtM204V/I联合组发生变异的患者ALT和HBV DNA含量较单一变异组高,差异有显著性(P＜0,05).结论 乙型肝炎拉米夫定治疗发生变异位点为rtV173L、rtL180M、rtM204V/I、rtL180M与rtM204V/I联合组.联合变异组各项生化指标以及HBV DNA含量变化明显,提示临床预后较差.     

慢性乙型肝炎替比夫定相关耐药突变15例回顾性分析

目的研究慢性乙型肝炎(CHB)患者替比夫定(LdT)相关耐药的HBV聚合酶基因突变模式及临床特点。方法对LdT治疗中病毒学突破的HBeAg阳性CHB,经焦磷酸测序法证实为LdT耐药突变的15例患者进行回顾性分析。结果共检出4个耐药突变位点呈5种模式,分别为rtM204I 9例,rtM204I+rtL180M 3例,rtM204I+rtV173L、rtM204I+rtV173L+rtL180M和rtM204I+rtV173L+rtA181V各1例。治疗24周时患者血清HBV-DNA均<104拷贝/mL,其中60%(9/15)的患者<103拷贝/mL;耐药突变发生于用药后40～111周,均未出现HBeAg血清学转换。结论 rtM204I是LdT耐药的主要突变模式,对未出现HBeAg血清学转换的患者,即使在24周HBV-DNA<103拷贝/mL,仍需关注其耐药突变。     

拉米夫定治疗53例HBV基因型对乙型肝炎患者P基因突变的影响

目的 探讨HBV基因型与拉米夫定耐药者P基因突变的关系.方法 53例慢性乙型肝炎(CHB)患者经拉米夫定治疗每天100 mg,并于治疗前及治疗后3、6、12、15、18、24个月监测肝功能、HBV M、HBV DNA、HBV基因型及YMDD变异.结果 (1)B基因型占56.60%(30/53),C基因型占41.51%(22/53);(2)在CHB重度及肝硬化病例中C基因型的检出率高于B基因型(P＜0.05);(3)拉米夫定治疗后C基因型较B基因型更易发生YMDD变异(P＞0.05);(4)B基因型主要发生rtM204I位点突变(62.5%,5/8),而C基因型则主要发生rtL180M/M204V突变(77.78%,7/9).结论 (1)遵义地区的HBV基因型主要由B、C基因型构成;(2)拉米夫定治疗后C基因型更易发生YMDD变异.     

核苷(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎患者的HBV耐药位点分析

目的:采用核苷类似物对乙型肝炎患者进行治疗,分析HBV基因耐药位点情况,为慢性乙型肝炎患者的临床治疗提供参考。方法:选取2018年12月-2019年12月在贵州航天医院接受核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎患者105例为研究对象,先给予患者PCR反向点杂交检测,随后对患者的HBV基因分型进行明确,并检测患者的耐药变异位点,此过程分别采用HBV基因分型和耐药相关检测实现,分析检测结果。结果:105例慢性乙型肝炎患者中,检出HBV-B型基因耐药变异23例(21.90%),HBV-C型基因耐药变异81例(75.24%),HBV-其他型基因耐药变异3例(2.86%)。共检测出HBV基因耐药变异位点9个,分别为rtL80M、rtA181V、rtA181T、rtT194L、rtS204I、rtM204V、rtN236T、rt180M+rt204V/I、rtA181T+rtN236T;其中HBV-B型基因耐药变异位点检出率为91.30%,HBV-C型基因耐药变异位点检出率为94.94%,HBV-其他型基因耐药变异位点检出率为100.00%。结论:慢性乙型肝炎患者的HBV基因耐药变异位点多且复杂,不同...     

拉米夫定耐药者乙肝病毒P基因区的突变分析

目的 研究拉米夫定耐药者乙肝病毒P基因区的突变情况.方法 应用基因芯片技术对78例拉米夫定临床耐药者和12例未经拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者进行P基因区180位点和204位点变异的检测.结果 78例拉米夫定临床耐药者中发生P基因区变异者共有57例,rtL180M 单独变异占12.3%(7/57);204位点变异(YMDD变异)率为64.1%(50/78),其中rtM204Ⅰ占28.1%(16/57), rtL180M/M204Ⅰ占15.6%(9/57),rtL180M/M204Ⅴ占35.1%(20/57),rtM204Ⅰ/Ⅴ占5.3%(3/57),rtL180M/M204Ⅰ/Ⅴ占3.5%(2/57).12例未经拉米夫定治疗的患者,其中1例发生P基因区变异.结论 拉米夫定临床耐药者体内存在P基因区180位点和204位点的变异,且联合变异率较高.     

Analysis of the reverse transcripatase domain mutation of HBV in transient virological breakthrough patients with chronic hepatitis B receiving nucleos(t)ide analogues in clinical practice

目的 探讨慢性乙型肝炎患者经核苷(酸)类似物抗病毒治疗后出现短暂性病毒学突破与逆转录酶区基因变异的关系.方法 在随访门诊中抽取16例接受核苷(酸)类似物抗病毒治疗出现短暂性病毒学突破者的预留血清,并提取HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV 逆转录酶区基因,PCR产物回收纯化后直接测序,将直接测序结果用DNASTAR进行分析,找出HBV逆转录酶区基因的变异位点和相应的氨基酸.结果 16例短暂性病毒学突破患者HBV 逆转录酶区均出现不同程度的点突变,其中主要的变异位点rtI/F122L、rtQ130P、rtS135Y、rtK149Q、rtW275替换为终止密码子(TAG)、rtV266I、rtH/Q271E的发生频率分别为56.3%、37.5%、43.8%、56.3%、50.0%、37.5%和37.5%,但无一例出现既往报道的常见耐药位点(rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtT184G、rtA194T、rtS202I/G、rtM204I/V、rtI233V、rtN236T、rtM250V/L)变异.结论 短暂性病毒学突破者逆转录酶区可出现不同程度的核苷酸位点变异及氨基酸替换,但均未检测到核苷(酸)类似物相关的常见耐药位点的变异.     

自然发生和拉米夫定诱导的乙型肝炎病毒逆转录酶区序列变异的特征

目的 研究慢性乙型肝炎（CHB）患者在自然状态或在拉米夫定（LVD）长期治疗过程中乙型肝炎病毒（HBV）逆转录酶区（RT）序列变异出现的时机和特点。方法 120例CHB患者按测序时机分3组：Ⅰ组初治患者25例，Ⅱ组病毒学突破患者74例，Ⅲ组病毒学部分应答患者21例。所有患者留血清标本，提取血清HBV—DNA，应用PCR扩增，直接测序HBV RT区，Chromas2．0软件分析HBVP基因RT区变异，同时使用Clustalxl．81．msw进行基因型分析。结果 120例CHB患者中，B型34例（28.3％），C型85例（70．8％），B／C型1例（0．8％）。Ⅰ组患者中，2例（8．0％）出现rt变异原发性LVD耐药（LVDr），其中1例为rtM204V＋rtL180M变异，另1例为rtL180M变异与野毒株并存；Ⅱ组患者中，67例（90．5％）出现继发性LVDr变异，rt变异位点为rtM204V／I、rtL180M、rtV173L／M、rtV207M/L/I、rtA181T,rtM250L；Ⅲ组患者中，出现rtV1911、rtF221Y变异各1例，没有出现LVDr相关的变异。结论 CHB患者在自然状态下和病毒学突破时HBV可出现LVDr变异，治疗前后对HBV逆转录酶区（RT）序列分析可指导临床抗HBV药物的选择。     

核苷(酸)类似物抗HBV过程中出现短暂性病毒学突破与逆转录酶区基因变异的关系

目的探讨慢性乙型肝炎患者经核苷(酸)类似物抗病毒治疗后出现短暂性病毒学突破与逆转录酶区基因变异的关系。方法在随访门诊中抽取16例接受核苷(酸)类似物抗病毒治疗出现短暂性病毒学突破者的预留血清,并提取HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV逆转录酶区基因,PCR产物回收纯化后直接测序,将直接测序结果用DNASTAR进行分析,找出HBV逆转录酶区基因的变异位点和相应的氨基酸。结果 16例短暂性病毒学突破患者HBV逆转录酶区均出现不同程度的点突变,其中主要的变异位点rtI/F122L、rtQ130P、rtS135Y、rtK149Q、rtW275替换为终止密码子(TAG)、rtV266I、rtH/Q271E的发生频率分别为56.3%、37.5%、43.8%、56.3%、50.0%、37.5%和37.5%,但无一例出现既往报道的常见耐药位点(rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtT184G、rtA194T、rtS202I/G、rtM204I/V、rtI233V、rtN236T、rtM250V/L)变异。结论短暂性病毒学突破者逆转录酶区可出现不同程度的核苷酸位点变异及氨基酸替换,但均未检测到核苷(酸)类似物相关的常见耐药位点的变异。     

测序法分析乙肝病毒P区耐药突变

目的调查乙型肝炎患者血清HBV P区基因序列的突变情况。方法选取聊城市人民医院2011年5月-2012年7月期间120例接受核苷类药物治疗后的乙型肝炎患者作为研究对象,采用荧光定量PCR产物直接测序法,对扩增产物进行测序,分析各个耐药位点。结果在120例乙型肝炎患者中存在位点突变者67例（55.8%）,以rtM204I/V,rtL180M和rtA181V/T突变居多,分别占38.5%、26.0%和20.5%。rtV173L、rtN236T和rtI233V有少量突变,大多以联合突变形式出现。结论乙型肝炎患者在接受核苷类药物治疗后,HBV P区可检出突变,突变形式多样,应用测序法分析HBV P区基因突变,获得信息全面,对评估病情和实施抗病毒治疗有重要价值。     

LDR法检测HBV P基因区野生型和突变型片段

目的 探讨连接酶检测反应(LDR)方法同时检测HBV P基因区野生型和突变型片段的可行性.方法 针对拉米夫定、替比夫定、阿德福韦和恩替卡韦8个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计15对特异性引物,采用多重PCR扩增HBV P基因区野生型和突变型目的 片段,然后进行多重LDR,最后在ABI3130测序仪上电泳,根据内参标记、LDR产物的长度进行结果判读.应用此方法对12例慢性HBV感染患者血清进行检测,焦磷酸测序技术对其验证,判断其特异性和准确性.结果 LDR法能有效区分包括rtL180M、YMDD、YIDD、YVDD、rtA181V/T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtM250V野生株和部分突变株;4例HBVDNA大于106copies/ml患者检测出野生株和突变株,结果与焦磷酸测序一致.结论 血清HBVDNA大于106copies/ml时结合多重PCR的复合LDR可通过一次扩增检测产物中的多个单突变或野生型位点,有助于核苷(酸)类似物耐药的诊断和治疗.     

阿德福韦酯耐药株感染者乙型肝炎病毒基因型和多聚酶区基因变异分析

目的了解阿德福韦酯耐药株感染者HBV基因型、多聚酶区基因变异位点和变异类型,并分析HBV基因型和多聚酶区基因变异的关系。方法应用PCR扩增和直接测序法检测73例阿德福韦酯耐药患者HBV基因型、多聚酶基因区变异位点、病毒载量。结果 73例阿德福韦酯耐药株感染者中,HBV B基因型占35.6%,C型占64.4%;HBV多聚酶基因区基因突变位点主要以rtA181V/T(39.8%)、rtN236T(31.5%)为多见,rtA181V/T+rtN236T(20.5%),其他(8.2%);其中rtA181V/T位点变异中B型占10.3%,C型占89.7%;rtN236T位点变异中B型占78.3%,C型占21.7%。rtA181V/T+rtN236T位点变异B型占26.7%,C型占73.3%;基因型B和C的病毒载量分别为(6.38±1.24)lg和(6.27±1.10)lg拷贝/毫升。结论阿德福韦酯耐药株感染者HBV基因型主要为B型和C型;HBV多聚酶区基因突变位点主要为rtA181V/T和rtN236T,基因型与多聚酶区基因突变位点之间有一定相关性。C基因型易发生rtA181V/T变异,B基因型多出现rtN236T变异。C基因型比B基因型更易出现rtA181V/T+rtN236T双突变,可能与C基因型容易导致的严重的肝脏疾病有关,基因型与病毒载量之间无相关性。     

恩替卡韦抗病毒患者乙型肝炎病毒逆转录区准种动态演变及其临床意义分析

目的探讨恩替卡韦(ETV)初治应答不佳的慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者体内乙型肝炎病毒逆转录区(HBV RT)准种动态变化规律及其临床意义。方法收集5例2014年11月～2017年12月期间在我院住院及门诊应用ETV初始治疗(0.5 mg/d)应答不佳的患者资料,留取各患者治疗过程中基线、4周、12周、24周、36周和48周血清标本冻存于-70℃备用,并检查生化指标、血清学指标、HBV DNA水平等。提取HBV DNA,PCR法扩增HBV RT区,HBV-DNA≥1E+04 IU/mL的模板直接扩增,HBV DNA1E+04 IU/mL的模板,应用巢式PCR扩增。回收目的片段并进行T-A克隆,每个标本挑取20～30个克隆,取鉴定为阳性的克隆测序,采用ClustalX 1.81软件和NCBI BLAST工具,将HBV序列进行比对,分析其氨基酸替换形式及准种分布情况。结果本实验5例ETV应答不佳患者治疗过程中共检出7种病毒株变异形式,分别是rtM204I、rtM204IV、rtT184L、rtM204V+rtL180、rtM204I+rtL180M、rtM204I+rtL180M+rtT184L、rtM204V+rtL180M+rtT184L。各种病毒株所占比例在不断发生变化,抗病毒之前野生株是绝对优势株,出现病毒学突破时,耐药突变株成为种群中优势株。结论在ETV抗病毒药物压力下,CHB患者HBV RT区准种分布处于动态变化中,准种变化与ETV抗病毒药物敏感性以及耐药性密切相关。rtM204I/V+rtL180M+rtT184L是与ETV耐药相关的主要变异模式。     

慢性乙型肝炎患者拉米夫定和恩替卡韦基因型耐药突变特征分析

目的 分析慢性乙型肝炎患者拉米夫定和恩替卡韦基因型耐药突变特征.方法 对我院180例拉米夫定（LAM）和120例恩替卡韦（ETV）治疗的慢性乙型肝炎患者进行耐药基因分析,并将检测耐药基因突变的结果进行统计分析.结果 LAM耐药突变率为60.6%（109/180）,常见耐药位点主要有rt 180Ml＋rt 204V、rt 204I＋rt 207I,变异频率分别为32.1%（35/109）和22.9%（25/109）.ETV耐药突变率为58.3%（70/120）,常见耐药位点主要有rt 184L＋ rt 180M＋ rt 204V,变异频率为80.0%（56/70）.结论 LAM和ETV存在rt 204V共同耐药位点,但是不会在临床过程中同时显现HBV-DNA阳性,当LAM耐药后,可用ETV继续治疗.     

大理地区乙肝患者基因分型及耐药突变相关分析

目的分析大理地区乙型肝炎患者对六种抗病毒核苷(酸)药物基因耐药突变情况及基因分型特点。方法收集2017年1月至2018年7月到我院就诊的HBV感染且用六种核苷(酸)抗病毒药物治疗的患者血清样本共212例进行研究分析,用PCR+Sanger测序法检测HBV耐药突变情况及基因分型,并进行统计分析。结果 212例患者中,共检出2种基因分型,其中B型68例(32%)、C型144例(68%)。36例发生耐药突变,耐药突变率17%,包括B型48例(70.6%),C型68例(30.1%);两类基因型中拉米夫定和恩曲他滨耐药基因突变病例最多,均为36人(17%),其次是恩替卡韦。耐药基因位点主要是rtM204I/v±rtL180M(77%),突变频率高于其他药物,B、C基因型的总体突变率(70.6%,30.1%)差异有统计学意义(P0.05)。结论本研究显示大理地区HBV基因分型主要以B和C型为主,且对拉米夫定和恩曲他滨耐药基因突变最常见,突变模式复杂,对于本地区抗HBV治疗有一定的指导意义,对于疗效不佳的乙肝患者,做耐药基因检测是必要的。     

慢性乙型肝炎患者在核苷(酸)类药物规范化治疗前耐药突变研究简

目的研究慢性乙型肝炎患者在核苷（酸）类药物（NAs）规范化治疗前耐药突变情况。方法在我国北方地区4家医院收集148例慢性乙型肝炎患者在NAs规范化治疗前的血清,提取血清中HBVDNA,用巢式聚合酶链反应一直接测序法获得HBV全长RT区序列,用生物信息学技术筛查该区内11个经典耐药突变位点（rt169、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250、rt80、rt173和rt180）并鉴定患者HBV基因型。采用SPSS13．0软件进行统计分析。计量资料采用x-±s表示,计量资料的比较采用t检验,计数资料的比较采用x2检验。P〈0．05为差异有统计学意义。结果148例慢性乙型肝炎患者中,有142例血清HBVRT区在11个经典耐药突变位点上均为野生型氨基酸;6例患者检出经典耐药突变,分别为rtM204I2例,rtA181V、rtA181T、rtL180M＋rtM204I、rtL80V＋rtL180M＋rtM204I各1例,其在半年以前均有不规范NAs治疗史。148例患者基因型分布为：B基因型占4．1％（6／148）,C基因型占95．3％（141／148）,D基因型占0．6％（1／148）。结论依据PCR产物直接测序结果,本研究中慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗基线时体内HBV以野生株为优势株,检出NAs耐药突变株的患者均有既往不规律抗病毒治疗史。基线耐药检测有助于NAs个体化治疗方案的优化。