Endostatin基因转染人脐带血CD34+ 造血干细胞的实验研究

目的检测人endostatin(血管内皮抑制素)基因转染人脐带血CD34+造血干细胞后的表达和分泌情况.方法电穿孔法将Plncx/endo转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆后用NIH3T3细胞测定病毒的滴度,RT-PCR法测定耐药的包装细胞中是否存在endostatin基因.取新鲜人脐带血40～80 ml,用Ficoll分离出单个核细胞,再用免疫磁珠(MiniMACS)进一步分离出CD34+造血干细胞,流式细胞仪(FCM)检测CD34+造血干细胞的浓度和纯度.将病毒上清与人脐带血CD34+造血干细胞共同培养72 h,应用RT-PCR及Western blot检测人endostatin的表达和分泌.结果 Plncx/endo质粒克隆扩增后,经酶切鉴定有endostatin基因存在.RT-PCR证实,转染人endostatin基因的PA317/endo、NIH3T3/endo细胞中存在人endostatin特异性片段,病毒滴度为1.3×105 cfu·ml-1.FCM检测,CD34+干细胞在脐血中的初始含量＜5%,经Mini-MACS分离纯化后纯度超过90%.从1×108的界面细胞平均可以分离获得(5～20)×105CD34+个干细胞.RT-PCR证实,脐带血CD34+/endo造血干细胞基因组中含有人550 bp endostatin特异性片段, Western blot分析显示人endostatin在转染细胞中获得稳定表达和分泌.结论逆转录病毒可以介导endostatin基因转导人脐带血CD34+造血干细胞并表达endostatin蛋白.     

转化生长因子β1基因促进人平滑肌细胞与内皮细胞黏附

目的探讨TGF-β1基因作用于平滑肌细胞从而促进内皮细胞黏附的作用。方法用单价阳离子脂质体转染试剂DOTAP转染pMAMneo TGF-β1于原代培养的平滑肌细胞,经G418筛选。检测转染pMAMneo TGF-β1和转染pMAMneo的平滑肌细胞黏附内皮细胞的情况。结果经G418筛选,转染pMAMneo TGF-β1组转化生长因子TGF-β1基因在平滑肌细胞得到有效表达,内皮黏附实验表明转染pMAMneo TGF-β1组平滑肌细胞表面有大量内皮细胞黏附[(32±2)/高倍视野],而对照组平滑肌细胞仅有少量内皮细胞黏附[(11±1)/高倍视野],其与转染pMAMneo组相比,差异显著(P<0.01)。结论 TGF-β1基因能有效作用于血管平滑肌细胞从而促进内皮细胞黏附,在血管再生中具有重要作用。     

人骨髓间充质干细胞分离培养鉴定及VEGF基因的转染

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSC）分离培养、鉴定方法及人血管内皮生长因子（hVEGF）165基因转染hMSC后表达情况,拟构建血管化组织工程皮肤.方法：用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,筛选贴壁细胞培养并传代.观察细胞形态,生长情况.检验细胞CD44、CD29、CD14、CI45等表面标记.利用基因重组技术,构建pCDN3.1＋VEGF表达质粒,并将其转染第3代hMSC.经G418抗性筛选后扩大培养并用Western blot实验检测其蛋白产物.结果：骨髓密度梯度离心法分离hMSC,接种培养瓶后26 h呈对数生长,6d后达到高峰.hMSC表达CD29,CD44,不表达造血细胞标记物CD14和CD45.通过酶切鉴定验证成功构建pCDN3.1＋ VEGF表达质粒.Western blotting实验证实转染后hMSCs表达VEGF增加.结论：成功建立hMSC分离培养鉴定体系.利用基因重组技术可成功将hVEGF基因导入hMSC并产生预期效应.     

负载转化生长因子β1的大鼠脂肪干细胞成软骨细胞分化

目的转化生长因子β1基因转染大鼠的脂肪基质干细胞（AOSCs），诱导其向软骨细胞分化，为软骨组织工程学种子细胞提供新方法。方法分离、培养大鼠的ADSCs；采用免疫荧光法进行鉴定；TGF-β1基因转染ADSCs，对转染后细胞进行筛选；MTT法测定筛选后细胞的增殖活性；KT-PCK、Western blot对筛选后细胞的表达进行检测。结果成功分离、培养大鼠的ADSCs；细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，CD106和CD34表达阴性；基因转染后细胞的增殖力变强；转染转化生长因子β1的ADSCs在目的基因的表达和软骨特异性基质的分泌上明显高于转染空载体组和对照组；结论转化生长因子β1基因转染后ADSCs具有了软骨细胞的表型特征，可以用作组织工程学的种子细胞。     

融合型自杀基因Fcy::Fur/5-FC对人卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的研究融合型自杀基因Fcy∶∶Fur联合5-氟胞嘧啶（5-FC）对人卵巢癌细胞株（SKOV3）的杀伤作用。方法构建含有融合型自杀基因Fcy∶∶Fur的荧光真核表达质粒,转染SKOV3细胞,筛选稳定表达的细胞株,RT-PCR和Western blot检测Fcy∶∶Fur表达。以MTT法和FCM法检测5-FC对Fcy∶∶Fur转基因细胞的杀伤效应。结果测序鉴定证实插入片段正确。细胞转染24h后,60%转染细胞发出绿色荧光。经G418筛选,RT-PCR和Westernblot法检测到Fcy∶∶Fur表达。加入5-FC后,MTT法检测到明显杀伤效应,FCM法检测到显著凋亡峰。结论融合型自杀基因Fcy∶∶Fur联合5-FC对人卵巢癌细胞SKOV3有明显的杀伤作用。     

TGF-β1 promotes endothelial cells adhesion to smooth muscle cells

目的 探讨TGF-β1基因作用于平滑肌细胞从而促进内皮细胞黏附的作用.方法 用单价阳离子脂质体转染试剂DOTAP转染pMAMneo TGF-β1于原代培养的平滑肌细胞,经G418筛选.检测转染pMAMneo TGF-β1和转染pMAMneo的平滑肌细胞黏附内皮细胞的情况.结果 经G418筛选,转染pMAMneo TGF-β1组转化生长因子TGF-β1基因在平滑肌细胞得到有效表达,内皮黏附实验表明转染pMAMneo TGF-β1组平滑肌细胞表面有大量内皮细胞黏附[(32±2)/高倍视野],而对照组平滑肌细胞仅有少量内皮细胞黏附[(11±1)/高倍视野],其与转染pMAMneo组相比,差异显著(P＜0.01).结论 TGF-β1基因能有效作用于血管平滑肌细胞从而促进内皮细胞黏附,在血管再生中具有重要作用.     

转染人转化生长因子-β3基因对瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响

目的 观察转染人转化生长因子-β3(hTGF-β3)基因对瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响。方法 通过脂质体介导的方法，将人表皮细胞生长因子基因真核表达质粒(pBK-CMV)-TGF-β3质粒转染体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞，采用RT—PCR法检测TGF-β3mRNA的表达，放射免疫(RIA)法测定细胞培养上清液中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原的浓度。结果 构建的TGF-β3质粒可成功转染成纤维细胞，并增强Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达，下调Ⅰ／Ⅲ型胶原比值。结论 转染hTGF-β3基因可调节瘢痕成纤维细胞的生物学活性。     

人内皮抑素基因转染原代成人黑色素瘤细胞

目的:研究人内皮抑素（human endostatin,hEndo）基因转染的原代黑色素瘤细胞的体外和体内生物学特性。方法:先构建重组人内皮抑素的真核表达载体pcDNA3.1-hEndo,将人内皮抑素基因导入原代成人黑色素瘤细胞,检测转基因细胞hEndo蛋白的表达、分泌和抑制细胞增殖活性,并验证转基因细胞在体外和裸鼠体内的生长特性。结果:载体pcDNA3.1-hEndo经酶切后获得5.4kb和624bp条带,电转后G418筛选获得克隆;RT-PCR检测到转染细胞表达hEndo mRNA,Western blot检测到转染细胞分泌hEndo蛋白,MTT表明转基因细胞上清可抑制细胞增殖;裸鼠体内生长实验显示转基因黑色素瘤生长速度明显低于对照组（P<0.05）,肿瘤组织RT-PCR示hEndo基因稳定表达。结论:转hEndo基因原代黑色素瘤细胞可有效、稳定地表达有生物学活性的hEndo,hEndo能抑制瘤细胞在动物体内的生长速度。     

重组人突变CD59真核表达质粒的构建和转染

目的获取人突变CD59基因（HM3）并构建HM3真核表达体系,转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,以获得稳定转染的细胞克隆.方法应用重组PCR定点诱变技术获得突变的CD59 DNA,进一步构建重组质粒pALTER-HM3;与pcDNA3共转染CHO细胞,转染细胞按一定比例稀释后加入G418压力筛选稳定转染细胞克隆,传代扩增培养并及时冻存备用.结果酶切及序列测定均证实成功构建了突变的pALTER-HM3重组质粒;转染细胞培养约2周后套取出G418抗性细胞克隆,获得生长较好的细胞.结论重组PCR定点诱变技术成功获得突变DNA,合适的细胞稀释有利于转染细胞克隆的筛选纯化.     

融合型自杀基因Fcy::Fur/5-FC对人卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的 研究融合型自杀基因Fcy::Fur联合5-氟胞嘧啶(5-FC)对人卵巢癌细胞株(SKOV3)的杀伤作用.方法 构建含有融合型自杀基因Fcy∶∶Fur的荧光真核表达质粒,转染SKOV3细胞,筛选稳定表达的细胞株,RT-PCR和Western blot检测Fcy∶∶Fur表达.以MTT法和FCM法检测5-FC对Fcy∶∶Fur转基因细胞的杀伤效应.结果 测序鉴定证实插入片段正确.细胞转染24 h后,60%转染细胞发出绿色荧光.经G418筛选,RT-PCR和Western blot法检测到Fey::Fur 表达.加入5-FC后,MTT法检测到明显杀伤效应,FCM法检测到显著凋亡峰.结论 融合型自杀基因Fey::Fur联合5-FC驿人卵巢癌细胞SKOV3有明显的刹伤作用.     

人胶质瘤U251细胞异柠檬酸脱氢酶1基因转染条件的建立和验证

目的 建立适用于U251细胞异柠檬酸脱氢酶1基因（IDH1）过表达的最佳转染方案,并通过筛选获得稳定转染的IDH1过表达人胶质瘤U251细胞系。方法 利用jetPRIME试剂将IDH1 Human Mutant ORF Clone和pCMV6-Entry Tagged Cloning Vector转染至U251细胞内。通过增殖实验获得筛选所用抗生素G418浓度,用该浓度筛选稳定的IDH1过表达和空白质粒转染成功的U251细胞。采用RT-PCR和Western blot实验验证转染实验和IDH1基因和蛋白的表达情况。结果 IDH1转染U251细胞株成功表达IDH1基因及IDH1蛋白,筛选及培养所需G418浓度为300 mg/L。IDH1转染组细胞表达IDH1基因及蛋白均高于空白质粒组（VCT组）,差异有统计学意义（P<0.05）,转染实验成功。结论 成功建立适用于U251细胞IDH1过表达的最佳转染方案,可通过筛选获得稳定转染的IDH1过表达和空白质粒对照的人胶质瘤U251细胞系。     

重组hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性。方法重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs。转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性。结果转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P<0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用。结论重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白。为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。     

重组hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的 探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性.方法 重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs.转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性.结果 转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P＜0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用.结论 重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白.为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础.     

βig-h3 mRNA在人肝癌细胞系中的差异表达及其意义

目的：测定转化生长因子β（TGF-β）诱导分子βig-h3 mRNA在人肝癌细胞系中的表达情况。方法：培养人肝癌细胞T7721（转染并稳定高表达HAb18G／CD147）、7721（未转染HAb18G／CD147）、人肝细胞癌细胞系（HHCC）和正常人张氏肝细胞QZG，提取总RNA，设计合成特异性引物，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照，检测βig-h3 mRNA的差异表达情况。结果：逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）结果显示，TGF-β诱导分子βjg-h3的mRNA在人肝癌细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞（P〈0．01），其在人肝癌细胞系中的表达水平依次为HHCC〉T7721〉7721，在正常肝细胞QZG中表达水平最低。结论：证明了βig-h3 mRNA在人肝癌细胞系中高表达，为进一步探讨βjg-h3在肝癌细胞黏附和转移过程中的作用机制奠定了基础。     

携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础.方法 应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞.结果 重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段.与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功.以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中.重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6 介导转染293 包装细胞出现细胞病变效应(CPE).采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断.结论 携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础.     

携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础。方法应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞。结果重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段。与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功。以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中。重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6介导转染293包装细胞出现细胞病变效应(CPE)。采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断。结论携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。     

TGF-β1基因转染修饰人退变腰椎间盘髓核细胞

目的　探讨对人退变腰椎间盘细胞以外源性生长因子TGF-β1进行基因修饰的可能性,同时检测相应编码蛋白的表达情况.方法　髓核细胞取自8例因腰椎间盘退变手术病人,在体外进行原代培养,并分作3组.将构建好的分别携带增荧光绿色蛋白EGFP基因（报告基因）和TGF-β1基因的腺病毒载体Ad/CMV-EGFP、Ad/CMV- TGF-β1直接转染细胞,对转染情况进行观察.结果　第一组（Ad/CMV-EGFP转染组）经荧光显微镜下观察有特异性绿色荧光表达,并持续4周,表示外源基因转入成功；第二组（Ad/CMV-TGF-β1转染组）经组化染色证明产生TGF-β1,转染率约30%,而作为对照的第三组则染色基本阴性.结论　采用腺病毒载体可以将TGF-β1基因转染修饰腰椎退变椎间盘细胞,并能表达相应的生长因子TGF-β1,为今后腰椎间盘退变疾病的基因治疗提供了实验基础.     

转化生长因子β1基因转染对结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染对结肠癌细胞SW480体外增殖的抑制作用.方法:以腺病毒为载体将人TGF-β1基因导入体外培养的人结肠癌细胞株SW480, 应用免疫组织化学及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SW480细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白及mRNA的表达情况.通过MTT法检测转染后细胞增殖的抑制情况.结果:转染hTGF-β1基因后,与对照组相比,TGF-β1蛋白和mRNA在细胞中的表达均增强.SW480的增殖受到明显抑制(P<0.05),抑制率为60%～80%.结论:转染hTGF-β1基因对体外培养的结肠癌细胞SW480的增殖有明显抑制作用.     

人EPO基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达

目的: 构建人EPO基因真核表达载体并转染人脐血间充质干细胞,获得稳定表达人EPO的人脐血间充质干细胞.方法: 从人胎肝细胞中提取总RNA,经过RTPCR方法扩增人EPO全长cDNA,应用基因重组技术将EPO cDNA基因亚克隆至pcDNA3真核表达载体内,以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3-EPO构建的正确性,再将pcDNA3-EPO经脂质体介导转染人脐血间充质干细胞,经G418筛选后获得稳定转染EPO基因的人脐血间充质干细胞,用RT-PCR,Western Blot和细胞免疫化学方法鉴定外源人EPO基因在人脐血间充质干细胞中的表达.结果: 酶切和测序结果均证实pcDNA3-EPO构建正确,RT-PCR,Western blot和细胞免疫化学结果显示转染人EPO基因的人脐血间充质干细胞体外能表达EPO.结论: 构建成功人EPO基因真核表达载体,转染人脐血间充质干细胞后在体外可获得稳定表达.     

重组人转化生长因子-β1荧光质粒的构建及转染软骨细胞的基因表达

目的：探讨重组人转化生长因子（TGF）-β1荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况.方法：体外酶消化分离法培养兔关节软骨细胞并采用特异性细胞外基质Ⅱ型胶原免疫细胞染色进行鉴定.双酶切法切取TGF-β1的cDNA片段,通过T4 DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上构建pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒.用构建的pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒经脂质体转染软骨细胞,在12、24 h、2、4、6 d通过荧光显微镜观察细胞内TGF-β1基因的表达,应用荧光定量PCR检测表达水平.结果：成功分离培养软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞染色显示细胞胞质染成棕黄色,胞核基本不着色.pEGFP-C1-TGF-β1真核表达载体质粒成功构建,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确.荧光显微镜观察转染后的软骨细胞有绿色荧光蛋白表达,软骨细胞的转染率分别为12 h：（8.22±2.02）%,24 h：（16.54 4±2.91）%,2 d：（14.06±3.67）%,4 d：（14.24±2.62）%,6 d：（12.36±2.28）%.荧光定量PCR检测转染软骨细胞TGF-β1基因拷贝数为16 277±1779,高于未转染软骨细胞的3095±205（P〈0.05）.结论：构建的TGF-β1荧光质粒可以转染软骨细胞并获得表达,为基因治疗骨性关节炎的研究提供基础.