蛋白酶体抑制剂MG132诱导骨肉瘤细胞凋亡及其对p27Kip1蛋白表达的影响

目的探讨蛋白酶体抑制剂Z-LLL-CHO(MG132)对人骨肉瘤MG-63细胞诱导凋亡的作用及其对p27Kip1蛋白表达的影响。方法分别以不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG132培养p53突变型人骨肉瘤MG-63细胞、正常二倍体成纤维细胞WI-38和p53野生型人骨肉瘤U2OS细胞。通过MTT法检测不同培养时间的细胞增殖活力、琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡、流式细胞仪定量检测不同时间的细胞凋亡发生率、Westernblot检测p27Kip1表达情况。结果MG132能选择性抑制人骨肉瘤MG-63和U2OS细胞生长,IC50分别为(0.92±0.06)μmol/L及(0.33±0.05)μmol/L,均低于二倍体成纤维WI-38细胞(9.13±0.12)μmol/L。1μmol/LMG132处理MG-63细胞24h后,DNA琼脂糖凝胶电泳可检测到典型的“阶梯状”DNA条带,而WI-38细胞则为基因组DNA。流式细胞仪于1μmol/LMG132作用12h后检测到明显的亚G1峰(凋亡细胞峰),且存在时效关系。Westernblot发现,处理后p27Kip1蛋白表达明显上调。结论蛋白酶体抑制剂MG132在体外可选择性诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡。p27Kip1蛋白在诱导MG-63细胞凋亡中可能起重要作用。     

靶向Survivin的小分子干扰RNA对骨肉瘤细胞的体内外抑制作用

目的 观察靶向Survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体对人骨肉瘤细胞MG-63的体内外抑制作用.方法 体外构建Survivin siRNA表达载体pSilence2.1-neo-Survivin,转染骨肉瘤细胞株MG-63、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学(SP)法检测转染前后Survivin mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡,建立裸鼠移植瘤模型,记录瘤体形成时间及肿瘤生长.结果 转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降,转染后mRAN表达抑制率为85.08%,增殖指数为空白组的28.20%;细胞周期分析显示:shRNA组G0/G1期细胞明显增多,而G2/M期、S期细胞数目减少;吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变,转染组凋亡率为24.54%;稳定转染组细胞裸鼠体内致瘤能力降低,转染组成瘤时间为(13.2±2.0)d,空白组为(6.5±1.6)d,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).4周时同空白组相比转染组瘤体体积小62.89%(P＜0.01),重量轻59.07%(P＜0.01).结论 靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖,促进细胞凋亡;明显抑制人骨肉瘤细胞的致瘤活性及裸鼠移植瘤的生长.     

Notch1 siRNA对乏氧环境骨肉瘤细胞MG-63增殖及周期的影响

[目的]探讨Notch1 siRNA对乏氧环境人骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖和周期的影响。[方法]将骨肉瘤细胞株MG-63细胞置于乏氧(37℃、1%O2、5%CO2)环境下培养作为实验组,以正常氧环境(37℃、21%O2、5%CO2)下培养作为对照组,培养72 h,应用MTT方法检测不同时间乏氧培养对MG-63细胞增殖的影响;采用Notch siRNA转染乏氧环境中的MG-63细胞,MTT方法检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞周期的变化;Western blot检测细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达变化。[结果]乏氧培养可促进MG-63细胞增殖,48 h常氧及乏氧对细胞增殖的作用可见明显差异(2.164±0.075 vs 1.421±0.086)(P<0.01)。流式细胞分析显示实验组、对照组MG-63细胞培养48 h G1/G2期细胞比例分别为(41.79±3.25)%和(53.87±2.31)%(P<0.05),乏氧可以促进细胞周期进展,Notch1 siRNA有效下调乏氧MG-63细胞Notch1蛋白表达,Notchl siRNA作用48 h后乏氧环境MG-63细胞周期阻滞于G1/G2期。Western-blot结果显示乏氧环境下MG-63细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达增高。[结论]乏氧环境能通过促进MG-63细胞周期进展,从而明显促进细胞增殖,阻断Notch可逆转乏氧对MG-63细胞促增殖作用,提示Notchl是治疗骨肉瘤的有效分子靶点。     

凋亡素重组腺相关病毒的构建及体外抑制膀胱癌效应

目的 探讨携带凋亡素基因的重组腺相关病毒构建方法,观察其体外抑制膀胱癌的效应.方法 构建重组质粒pAAV-VP3,经EcoRI/Sal Ⅰ双酶切鉴定和基因测序无误后,采用三质粒共转染法包装重组腺相关病毒rAAV-VP3.收获病毒后聚合酶链反应(PCR)扩增病毒液中的目的基因鉴定重组病毒,对其进行纯化后透射电镜观察病毒颗粒,并检测病毒滴度.按每个细胞5×105个载体基因组的剂量感染EJ细胞后,逆转录(RT) -PCR检测VP3基因在EJ细胞中的转录,Western blot法检测凋亡素蛋白的表达.透射电镜扫描观察感染重组病毒后肿瘤细胞的超微结构变化,流式细胞术(FCM)检测重组病毒对EJ细胞的影响.结果 转染72 h后重组腺相关病毒rAAV-VP3包装成功,滴度为5.1×1011个载体基因组/ml,电镜下可见病毒颗粒.感染EJ细胞后,可检测到VP3基因的转录和凋亡素蛋白表达,电镜观察到凋亡形态学改变,FCM检测S期细胞比例降低和G2/M期细胞比例增高,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 重组腺相关病毒rAAV-VP3在体外能够发挥生物学活性,其介导的凋亡素表达抑制膀胱癌的体外效应为体内实验奠定了基础.     

单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

目的 构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53，并研究其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。方法 利用基因工程技术，将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA（0．5kb）亚克隆至pIRES载体中，通过聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中，并筛选出阳性克隆，流式细胞仪测定瘤细胞DNA含量和细胞周期；逆转录（RT）-PCR和Western bolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。噻唑蓝（MTT）比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果 成功构建出双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53。转染后瘤细胞形态由转染前密集排列的多角形、星形转变为排列稀疏的长梭形细胞，瘤细胞生长速度较前缓慢，群体倍增时间比转染前增加了2．3倍，且易出现脱壁并见散在瘤细胞凋亡；流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G1期；RT-PCR与Western blot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达，转染MG-63后24、48、72、96h瘤细胞生长抑制率分别为：33．43％、69．37％、66，19％、75．26％，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 野生型p53和p14ARF协同抑制骨肉瘤细胞的增殖促进瘤细胞的凋亡，为进一步研究p14ARF与p53在骨肉瘤基因治疗的体内实验奠定了基础。     

反义c-myc寡核苷酸对骨肉瘤细胞(MG-63)凋亡的影响

[目的]研究反义c-myc寡核苷酸(c-mycASODN)对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响。[方法]设计c-mycASODN片段,将其转入人骨肉瘤MG-63细胞,通过HE染色光镜观察、透射电镜超微结构及流式细胞仪(FCM)分析,观察和分析其对瘤细胞凋亡、细胞周期及c-myc基因蛋白表达的影响。[结果]形态学观察到典型瘤细胞凋亡特征;流式细胞仪分析证实反义c-myc寡核苷酸主要阻止瘤细胞从G1期进入S期,即产生G1/S期阻滞,出现明显的凋亡峰,凋亡率达36.82%,并可抑制c-myc基因蛋白的表达。[结论]反义c-myc寡核苷酸可明显诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡。     

腺病毒介导野生型PTEN基因对乳腺癌MDA MB 468细胞周期的影响

摘要：目的 探讨腺病毒介导野生型PTEN基因对乳腺癌MDA MB 468细胞周期时相的影响。方法 构建含PTEN目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV PTEN与骨架质粒pAdEasy 1，将重组腺病毒pAd PTEN制备成纯化高效的含绿色荧光蛋白（GFP）的PTEN腺病毒，体外转染人乳腺癌MDA MB 468后，检测PTEN表达后对乳腺癌MDA MB 468细胞周期的影响。结果 携带PTEN基因重组腺病毒载体成功构建，检测病毒滴度为2.5×1010pfu/mL。表明重组腺病毒已含有PTEN蛋白。流式细胞术显示对照组处于G1期的细胞占41.18%，PTEN蛋白表达后处于G1期的细胞占56.47%。结论 利用腺病毒载体系统AdEasy 1可快速构建表达PTEN基因的腺病毒载体，可高效制备均一的高滴度重组病毒；野生型PTEN基因转染使乳腺癌细胞周期停滞于G1期。     

转化生长因子β1基因转染兔颞下颌关节滑膜间充质干细胞及其表达

目的 构建TGF-β1基因的重组腺相关病毒载体并将其转入兔颞下颌关节滑膜间充质干细胞(SMSCs)中,对转染后外源性TGF-β1 mRNA和蛋白的表达进行检测.方法 含TGF-β1全长cDNA的质粒pCMV6-XL4和质粒pAAV-MCS用EcoR Ⅰ+Xba Ⅰ进行双酶切后连接,转化大肠杆菌DHSα感受态细胞,获得重组质粒pAAV-MCS-TGF-β1.通过酶切和DNA测序鉴定重组质粒的正确性.采用磷酸钙共沉淀法,以重组质粒pAAV-MCS-TGF-β1和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞,产生具有传染性的病毒颗粒;斑点杂交方法检测重组病毒的滴度,并转染体外培养的SMSCs.以逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测目的 基因及蛋白的表达.结果 成功地构建TGF-β1基因腺相关病毒重组质粒,病毒滴度约为3.6×1013vp/ml,感染的SMSCs能稳定、高效地表达外源性目的 基因及蛋白.结论 重组腺相关病毒载体rAAV-TGF-β1能有效感染SMSCs并表达目的基因.     

PTEN和p27Kip1共表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的　通过腺病毒介导转染前列腺癌PC 3细胞 ,探讨人 10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白类似物 (PTEN)和p2 7Kip1对肿瘤细胞增殖和凋亡等方面的影响及二者的协同作用。方法　构建携带人PTEN和p2 7Kip1基因的腺病毒载体 ,体外转染PC 3细胞 ,通过RT PCR、Westernblot检测目的基因不同水平的表达。采用细胞生长试验、流式细胞仪检测PC 3转染前后细胞增殖、细胞周期和早期凋亡率的变化。结果　病毒滴度Ad PTEN为 1 8× 10 7pfu ml、Ad p2 7Kip1为 1 2× 10 9pfu ml,RT PCR检测有PTEN mRNA(46 2bp)和p2 7Kip1 mRNA (32 0bp) ,Westernblot检测有PTEN蛋白 (6 0KD)和P2 7蛋白 (2 7KD)特异表达 ,可明显抑制PC 3细胞的增殖 ,诱导细胞凋亡 ,联合基因治疗组与单基因组相比差异有显著意义。结论　成功构建携带人PTEN和p2 7Kip1的重组腺病毒载体 ,在前列腺癌细胞株PC 3得到了稳定、特异的高表达 ,联合基因疗法有望成为治疗前列腺癌的有效方法。     

重组腺相关病毒介导的MDA-7基因对人肝癌细胞的选择性凋亡诱导效应

目的 探讨PEG启动子调控腺相关病人毒介导的黑色素瘤分化相关基因MDA-7对肝癌细胞的选择性凋亡诱导效应.方法 以重组腺相关病人毒rAAV-PEG-MDA-7表达系统感染人肝癌细胞株HepG2细胞和正常人肝细胞株LO2细胞,Westerm Blot检测转染细胞内MDA-7蛋白,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术分析细胞周期、Annexin-Ⅴ、线粒体跨膜电位(△Ψm),RT-PCR检测bcl-2基因mRNA.结果 重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA7可特异性转染HepG2细胞,MDA7蛋白在HepG2细胞中高效表达,并呈时间依赖性;重组腺相关病毒rAAV-PEC-MDA-7可抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,细胞周期分析处于G0/G1期细胞百分比明显增多,处于G2/M期的细胞减少,并且可见到较明显的凋亡峰的形成,从24 h开始Annexin-Ⅴ阳性细胞比例增多,△Ψm降低,抗凋亡基因bcl-2 mRNA表达降低.而重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA-7对LO2细胞无类似效应.结论 构建出的重组腺相关病毒rAAV-PEG-MDA-7表达系统可选择性抑制肝癌细胞增殖和诱导其凋亡,其诱导凋亡机制受到bcl-2家族经线粒体途径的调节.     

A recombinant adenovirus expressing p7(Kip1) induces cell cycle arrest and apoptosis in human 786-0 renal carcinoma cells

PURPOSE: We evaluated the effects of the over expression of p27Kip1, a cyclin dependent kinase inhibitor and tumor suppressor protein, on the 786-0 human renal carcinoma cell line. MATERIALS AND METHODS: The recombinant adenovirus Adp27Kip1 was evaluated for the induction of p27 protein expression in 786-0 renal carcinoma cells. Expression time and optimal vector concentration were determined. Growth curve studies, cell cycle analysis and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end-labeling were done to determine the effects of p27Kip1 on the cell cycle. Cyclin dependent protein kinase (Cdk) inhibitor (CDKI) activity assays were done to determine the expression/activities of Cdks and Western blot analysis was performed to determine the presence of CDKIs and other cell cycle regulator proteins. Nude mouse xenografts were established to demonstrate the in vivo efficacy of Adp27Kip1. RESULTS: p27Kip1 protein expression was detected within 12 hours after Adp27Kip1 infection and it remained stable for at least 48 hours. Growth studies demonstrated that Adp27Kip1 infection resulted in the inhibition of proliferation by 3 days after infection and cell death was detected by day 5. Cell cycle analysis of DNA content indicated an accumulation of cells in the G1 phase of Adp27Kip1 infected cells and a corresponding decrease in S phase cells within 48 hours after infection. Cdk activity was determined, and Cdk2, Cdk4 and Cdc2 kinase activities were inhibited, consistent with p27Kip1 over expression. The levels of the CDKIs p16 and p18 were elevated 24 hours after Adp27Kip1 infection, while p21 levels remained unchanged. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end-labeling revealed that Adp27Kip1 infection but not infection by control virus induced detectable apoptosis within 24 hours. Adp27Kip1 significantly caused the reduction in the size of tumors of the renal cell carcinoma xenografts. CONCLUSIONS: This study demonstrates the potential effectiveness of Adp27Kip1 as a vector for gene therapy studies of renal cell carcinoma.     

Induction of cell cycle arrest and apoptosis in human prostate carcinoma cells by a recombinant adenovirus expressing p27(Kip1)

BACKGROUND: Adp27(Kip1), a recombinant adenovirus, was evaluated for expression of p27, a cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKI) and tumor suppressor protein, in human prostate carcinoma cells. Effects of p27(Kip1) on cell cycle and apoptosis were analyzed. METHODS: We evaluated the effects of overexpression of p27(Kip1) in the human prostate carcinoma cell lines LNCaP, DU-145, and PC-3 in vitro and in vivo. Growth curve studies, cell cycle analysis, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end-labeling (TUNEL), and annexin V-fluorescein isothiocyanate apoptosis analyses were conducted to determine effects of p27(Kip1) on cell cycle. CDKI activity assays and Western blots were conducted to determine presence/activities of CDKIs. RESULTS: Adp27(Kip1)-induced protein levels increased in a dose-dependent manner; p27(Kip1) protein was detected within 6 hr of infection with Adp27(Kip1) and remained stable for at least 48 hr. The activities of Cdk2, Cdk4, and Cdc2 kinases were inhibited 24 hr after infection with Adp27(Kip1). Bromodeoxyuridine incorporation demonstrated a dose-dependent decrease in S-phase cells 24 hr postinfection. TUNEL analysis revealed an induction of apoptosis (10 pfu/cell) within 48 hr of infection in all cell lines. Growth curve analyses demonstrated that Adp27(Kip1) infection inhibited proliferation of all cell lines tested and decreased cell numbers for Adp27(Kip1)-infected LNCaP and PC-3 cells by 96 hr. Cell cycle analysis of DNA content demonstrated an accumulation of cells in G0/G1-phase 24-120 hr after Adp27(Kip1)-infection. In vivo studies demonstrated a reduction in LNCaP xenograft tumor growth rates in mice injected with Adp27(Kip1). CONCLUSION: Exogenous p27(Kip1) overexpression results in cell cycle regulation in the human prostate carcinoma cell lines tested, representing the first use of this vector on prostate cancer cell lines in vitro and in vivo. Moreover, p27(Kip1) expression is associated with an increase in early apoptosis, which represents a recently discovered function for this protein. It also represents the first time this association has been observed in prostate carcinoma cell lines. This study provides support for the further development of Adp27(Kip1) as a potential therapeutic vector in the treatment of adenocarcinoma of the prostate.     

热疗联合特异性沉默趋化因子受体4对骨肉瘤增殖和侵袭的影响

目的观察热疗联合特异性siRNA沉默趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)对骨肉瘤增殖和侵袭的影响。方法培养人骨肉瘤细胞株MG 63至对数生长期,接种于6孔板中,分为三组,空白组细胞不进行任何处理常规培养,control siRNA组以control siRNA转染细胞,CXCR4 siRNA组以CXCR4 siRNA转染细胞,采用Western blot检测各组CXCR4的表达变化,评估CXCR4 siRNA转染效能。细胞及体内实验设置control siRNA组(对照组)、热疗联合CXCR4 siRNA组(联合组)、CXCR4 siRNA组(沉默组)和热疗组,以CXCR4 siRNA转染沉默组和联合组的细胞,control siRNA转染对照组细胞,热疗组和联合组进行热疗处理。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT qPCR)和Western blot检测各组细胞CXCR4的表达变化。CCK 8法和Transwell侵袭实验检测转染后MG 63细胞的增殖能力和侵袭能力变化。流式细胞技术检测转染后MG 63细胞的周期变化。体外裸鼠成瘤实验和肿瘤生长曲线观察转染后MG 63细胞增殖和裸鼠骨肉瘤生长情况。结果CXCR4 siRNA可以有效沉默MG 63细胞中CXCR4蛋白的表达。热疗联合CXCR4 siRNA有效沉默MG 63细胞中CXCR4的表达并能抑制MG 63细胞增殖和侵袭,阻滞细胞周期于G0/G1期(P均<0.05)。体内实验结果显示,从第14天起,联合组裸鼠骨肉瘤体积逐渐小于对照组、沉默组和热疗组,差异有统计学意义(P均<0.05)。联合组的瘤重也低于对照组、沉默组和热疗组,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论热疗联合特异性沉默CXCR4抑制骨肉瘤的增殖和侵袭,可作为一个有效的骨肉瘤基因治疗新方法。     

Angiotensin II-induced hypertrophy of proximal tubular cells requires p27Kip1

BACKGROUND: Angiotensin II (Ang II), as a single factor, induces hypertrophy of cultured proximal tubular cells of various species. Cells undergoing hypertrophy are arrested in the G1 phase of the cell cycle. Ang II also stimulated the expression of p27Kip1, an inhibitor of cyclin-dependent kinases (CDK). Although previous studies inhibiting p27Kip1 expression with antisense oligonucleotides suggested that this CDK inhibitor is important for Ang II-induced hypertrophy of proximal tubular cells, nonspecific effects of antisense technology, and the inability to transfect 100% of cells raised concerns about the true role of p27Kip1 in tubular hypertrophy. METHODS: Proximal tubular cells were isolated and cultured from wild-type (p27Kip1+/+) and knockout (p27Kip1-/-) mice. p27Kip1 genomic and protein expression was evaluated. Proximal tubular cell origin was confirmed by expression of various markers [3M-1 antigen, gamma-glutamyltransferase, angiotensin-converting enzyme (ACE)]. Cell proliferation (cell number, 3[H]thymidine incorporation) and hypertrophy (de novo protein synthesis as measured by 3[H]leucine incorporation, hypertrophy index, cell size) were evaluated. CDK2 and CDK4 activities were determined by an in vitro kinase assay. In addition, cell cycle analysis was performed by flow cytometry. p27Kip1 expression was reconstituted in two different clones of p27Kip1-/- proximal tubular cells using an inducible vector system based on ecdysone response elements. RESULTS: In accordance with previous studies, 10-7 mol/L Ang II induces hypertrophy and cell cycle arrest of p27Kip1+/+ proximal tubular cells. In contrast, Ang II facilitated cell cycle progression of two p27Kip1-/- proximal tubular cell lines without inducing hypertrophy. Ang II activates CDK4/cyclin D kinase activity in p27Kip1+/+ and -/- tubular cells, but stimulates CDK2/cyclin E activity only in wild-type cells. However, in the presence of Ang II, reconstituting p27Kip1 expression in p27Kip1-/- tubular cells using an inducible expression system, restored G1 phase arrest and the hypertrophic phenotype. Ang II did not induce apoptosis of either p27Kip1+/+ or -/- tubular cells. CONCLUSION: Our findings are the first clear evidence that p27Kip1 is required for Ang II-induced hypertrophy of proximal tubular cells. However, although p27Kip1 expression is an absolute requirement for this hypertrophy, reconstitution experiments revealed that other factors induced by Ang II contribute to this hypertrophy.     

蛋白酶体抑制剂MG-132对胃癌细胞株作用的实验研究

目的:探讨蛋白酶体抑制剂MG-132阻断泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)对体外胃癌细胞增殖的抑制作用及其相关机制。方法:将不同浓度的MG-132加入胃癌细胞株SGC-7901中,观察细胞形态变化,并应用MTT法测定细胞抑制效应,流式细胞仪检测细胞凋亡,免疫组化法检测P27kip1的表达。结果:MG-132对胃癌细胞增殖具有显著的抑制作用,瑞氏染色显微镜观察MG-132作用于胃癌细胞后,可见细胞出现细胞质、核仁消失,染色质固缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割及大量凋亡小体。5.0μmol/L的MG-132作用24、48h后的凋亡率分别为(16.7±5.1)%和(72.8±16.4)%。免疫组化显示,胃癌细胞在5.0μmol/L的MG-132作用48h后明显表达P27kip-1。结论:MG-132能显著抑制胃癌细胞的增殖,诱导其凋亡。其机制可能为通过上调抑癌蛋白P27kip-1水平而起到抗肿瘤作用。     

反义pEGFP-C1-Survivin对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的 观察Survivin反义核酸载体对人骨肉瘤细胞株MG-63生物学行为的抑制效应,并探讨其机制.方法 MTY检测转染前后MG-63细胞增殖抑制率的变化,Boyden小室体外侵袭实验测定转染前后侵袭能力变化.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后Ang-2基因mRNA表达的变化.结果 噻唑蓝(MTT)检测显示转染后骨肉瘤细胞增殖明显受抑制,转染组抑制率达到23.4%,与各对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),脂质体组、空质粒组和空白组之间差异无统计学意义(P>0.05).RT-PCR分析显示转染组MG-63中Ang-2基因mRNA的表达较转染前明显下降,与其他组之间差异有统计学意义(P<0.01),而另3组之间差异无统计学意义(P>0.05).Boyden小室体外侵袭实验测定显示转染组侵袭百分数为17.9%,与其他各组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 Survivin反义核酸可以显著抑制人骨肉瘤细胞株MG-63的增殖、侵袭能力,部分逆转其恶性表型,这可能与其下调Ang-2的表达有关.     

Survivin基因干扰RNA对骨肉瘤MG-63细胞系增殖和凋亡的影响

[目的]观察Survivin基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法]体外构建Survivin shRNA表达载体pSilence2．1-neo-Survivin，转染骨肉瘤细胞系MG-63，筛选稳定表达的克隆，倒置显微镜观察各组细胞形态学变化，RT-PCR、Weston-blot方法检测转染后Survivin mRNA及蛋白的表达，噻唑蓝（MTT）法、克隆形成实验检测细胞的增殖情况，吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡情况。[结果]转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降，其抑制率分别为85．08％和81．14％；细胞增殖受到显著抑制，培养48h后与空白组比较，抑制率达63．4l％；吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变，转染组凋亡率为24．54％。[结论]靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。     

EGCG对高糖环境下小鼠足细胞增殖和P21^Cip1、P27^Kip1表达的影响

目的：研究作为绿茶主要活性成分的EGCG对高糖环境下足细胞增殖和周期素激酶抑制剂P21^Cip1和P27^Kip1表达的影响,从而探讨其作用机制。方法：以高糖（25mmol/L）培养的小鼠足细胞为研究对象,维生素E为对照,以不同浓度EGCG（0.2,10,100μmol/L）培养24h、48h、72h,首先以相差显微镜观察足细胞形态改变;其次,以BrduELISA法检测细胞增殖;流式细胞仪分析足细胞G1/G0、S期、G2/M期百分比;RT-PCR检测细胞周期依赖型蛋白激酶抑制剂P21^Cip1mRNA和P27^Kip1mRNA表达。结果：（1）相差显微镜下观察,高糖刺激后24h,部分足细胞脱落,呈不规则形态。（2）BrduELISA法以正常糖为对照,高糖刺激24h后,足细胞增殖无统计学差异,48h和72h后足细胞增殖减少,有统计学差异（P〈0.05）;以高糖组为对照,高糖刺激24h,维生素E组和维生素E＋EGCG协同作用组促进足细胞增殖有统计学差异（P〈0.05）,EGCG（0.2,10,100μmol/L）作用组无统计学意义;48h实验结果和24h相同;72hEGCG（100μmol/L）维生素E组和维生素E＋EGCG协同作用组促进足细胞增殖作用有统计学差异（P〈0.01）。（3）不同浓度EGCG对高糖刺激后足细胞周期G1/G0期、S期、G2/M期百分比无统计学差异（P〉0.05）。（4）RT-PCR高糖刺激后24h,足细胞P21^Cip1mRNA表达有上升,但无统计学意义（P〉0.05）;随EGCG浓度增加,以维生素E为对照,P21^Cip1mRNA表达无统计学差异（P〉0.05）。正常糖组为对照,高糖刺激后24h足细胞P27^Kip1mRNA表达上调,有统计学差异（P〈0.01）,随EGCG浓度增加,P27^Kip1mRNA表达无统计学差异（P〉0.05）。结论：EGCG（100μmol/L）作用72h促进高糖环境下足细胞增殖,对细胞周期作用不明显,高糖刺激后24h足细胞P27^Kip1mRNA表达上调,EGCG对足细胞细胞周期依赖型蛋白激酶抑制P21^Cip1mRNA和P27^Kip1表达无明显影响,提示EGCG促高糖环境下足细胞增殖作用可能还存在其他机制。     

活性氧与高糖对人腹膜间皮细胞增殖的影响

目的 研究不同浓度葡萄糖、活性氧(过氧化氢)、抗氧化剂对人腹膜间皮细胞(HPMC)细胞增殖的影响及其机制。方法用^3H-胸腺嘧啶(TdR)掺人法测定细胞增殖；用流式细胞仪检测细胞周期的改变；用半定量RT-PCR检测细胞周期调控蛋白p27^kip1mRNA水平；用细胞免疫组化方法和蛋白印迹(Western blotting)的方法检测p27^kip1蛋白水平。结果 高糖及较大剂量的过氧化氢(0．5mmol／L)均可以抑制HPMC增殖，而细胞周期分析提示细胞停滞于G1期。高糖加过氧化氢，则增加了后者的毒性作用。高糖及外源性过氧化氢均可以增加p27^Kip1蛋白表达。高糖加抗氧化剂，可以改善细胞周期停滞、增殖抑制作用，但p27^kip1的表达未见明显改变。结论 高糖及外源性过氧化氢均可通过增加p27^KiP1的表达使细胞周期发生停滞，从而抑制增殖。而高糖的增殖抑制作用还与内源性的活性氧有关，提示临床上抗氧化治疗可能有益。