β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅱ、Ⅴ表达的亚细胞结构定位研究

目的 :研究 β1,4-半乳糖基转移酶II和V(β1,4-galactosyltransferaseⅡandⅤ ,β -1,4-GalT -ⅡandⅤ )蛋白表达的亚细胞结构定位。方法 :构建 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ融合绿色荧光蛋白 (greenfluorescenceprotein ,GFP)表达质粒 ,分别将构建的质粒转染到PC12细胞和肝癌 772 1细胞中 ,荧光显微镜下观察 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ在其中表达的亚细胞结构定位。 结果 :β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ主要表达在这两种细胞细胞核旁的高尔基复合体。结论 :β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ主要分布在高尔基复合体上 ,提示它们可能是在高尔基复合体参与蛋白质的糖链修饰     

正、反义β1,4半乳糖基转移酶-V表达质粒的构建

目的 :探讨不同 β1,4半乳糖基转移酶 -V (β -1,4-GalTV)表达水平的生物学意义 ,构建正、反义 β -1,4-GalTV表达质粒。方法 :设计 β -1,4-GalTV全长引物 ;提取小鼠脑总RNA ,通过RT -PCR方法 ,得到全长 β -1,4-GalTV基因片段 ,将其克隆到 pGEM -T载体。再通过多克隆酶切位点 ,将 β -1,4-GalTV全长序列克隆到 pcD NA 3 .1表达载体中。设计反义引物 ,以pGEM -β -1,4-GalTV质粒为模板 ,将PCR产物克隆到 pcDNA 3 .1表达载体中。通过酶切和测序鉴定构建的质粒。结果 :通过酶切和测序证实 ,得到了正、反义 β -1,4-GalTV表达质粒。 结论 :正、反义 β -1,4-GalTV表达质粒的构建 ,为进一步研究不同 β -1,4-GalTV表达水平的生物学意义奠定基础。     

β-1,4半乳糖基转移酶-Ⅰ在大鼠坐骨神经髓鞘中的表达

目的 :分析β -1,4半乳糖基转移酶 -Ⅰ(β -1,4-galactosyltransferaseⅠ ,β -1,4-GalT -Ⅰ)mRNA在正常和损伤坐骨神经髓鞘上的定位及其表达变化。方法 :首先采用RT -PCR方法 ,分析 β -1,4-GalT -Ⅰ在小鼠坐骨神经中的表达存在。以RT -PCR扩增的DNA片断 ,将其克隆到pGEM -T载体中。采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义 β -1,4-GalT -ⅠRNA探针。最后通过原位杂交及图像分析的方法 ,分析 β -1,4-GalT -ⅠmRNA在正常和损伤大鼠坐骨神经的定位及其表达变化。 结果 :首先通过RT -PCR方法 ,检测到 β -1,4-GalT -Ⅰ在小鼠坐骨神经中的表达存在。应用地高辛标记的正、反义β -1,4-GalT -ⅠRNA探针 ,通过原位杂交发现 β -1,4-GalT -Ⅰ在大鼠坐骨神经的髓鞘中表达 ,并发现其在坐骨神经损伤后 2～ 3天内表达最高 ,随后表达下降。结论 :本实验发现 β -1,4-GalT -Ⅰ在坐骨神经主要表达在髓鞘中 ,并在坐骨神经损伤后发生表达变化。这样把 β -1,4-GalT -Ⅰ的修饰调控功能和雪旺氏细胞的功能相联系在一起 ,为进一步分析β -1,4-GalT -Ⅰ在周围神经再生中的调控机制奠定基础     

正、反义β-1,4半乳糖基转移酶Ⅱ和Ⅴ地高辛标记RNA探针的制备和应用

目的 :为了探讨 β1,4半乳糖基转移酶 -Ⅱ和V(β1,4-galactosyltransferaseⅠ ,β -1,4-GalT -ⅡandⅤ )表达定位 ,本实验通过分子生物学手段 ,制备了正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的RNA原位杂交探针。 方法 :设计引物 ,提取小鼠脑总RNA ,通过RT -PCR方法 ,得到 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ基因序列 ,将其克隆到 pGEM -T载体。根据其多克隆酶切位点和Sp6及T7位置 ,分别酶切后作为转录模板 ,通过Sp6及T7RNA聚合酶 ,得到正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和V地高辛标记的RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后 ,最后通过原位杂交分析标记探针的特异性和杂交效果。结果 :本实验得到了高效价的正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的RNA原位杂交探针 ,并表现出很好的杂交效果。结论 :正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和VRNA原位杂交探针的制备 ,为进一步研究 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ在组织中的表达 ,尤其在神经组织的定位奠定基础     

β-1,4半乳糖基转移酶-I对雪旺氏细胞增殖的影响

目的 :探讨周围神经雪旺氏细胞表达 β -1,4-半乳糖基转移酶 -Ⅰ (β -1,4-galactosyltransferaseⅠ ,β -1,4-GalT -Ⅰ )对其增殖的影响。方法 :构建正、反义 β -1,4-GalT -Ⅰ表达质粒 ,将其转染到分离培养的雪旺氏细胞中 ;运用细胞计数分析转染细胞倍增时间、培养细胞 3H -TdR掺入检测转染细胞增殖程度 ;应用流式细胞仪分析转染细胞的细胞周期变化。结果 :转染正义 β -1,4-GalT -Ⅰ后雪旺氏细胞的增殖受到抑制 ,且这种抑制作用随转染浓度增大而增强。而转染反义 β -1,4-GalT -Ⅰ有相反的作用。转染正义 β -1,4-GalT -Ⅰ后 ,雪旺氏细胞周期主要被阻滞在G1/G0期。 结论 :β -1,4-GalT -Ⅰ对雪旺氏细胞的增殖有抑制作用 ,可能在周围神经雪旺氏细胞的有序增殖过程中发挥重要作用     

雪旺氏细胞表达β-1,4半乳糖基转移酶-I对神经元轴突生长的影响

为了探讨周围神经雪旺氏细胞中不同 β -1,4半乳糖基转移酶 -I(β -1,4-galactosyltransferaseI ,β -1,4-GalT -I)表达水平对神经元轴突生长的影响 ,本实验首先构建了正、反义 β -1,4-GalT -I表达质粒 ;然后将构建的不同浓度的正、反义表达质粒超表达于分离、纯化的大鼠雪旺氏细胞 ;最后将转染的雪旺氏细胞与分离的大鼠背根神经节共培养 ,根据共培养神经元轴突延伸的数目和面积 ,分析雪旺氏细胞中不同 β -1,4-GalT -I表达水平对神经元轴突生长的影响。结果发现 :转染正义 β -1,4-GalT -I的雪旺氏细胞能促进共培养神经节轴突的长出和延伸。在一定的转染浓度内 ,这种促神经生长作用随转染浓度增大而增强 ,而转染反义 β-1,4-GalT -I却有相反的作用。提示周围神经雪旺氏细胞中表达 β -1,4-GalT -I可能在维持正常神经的功能和促进损伤神经的修复发挥重要作用     

正、反义β1,4半乳糖基转移酶-Ⅴ表达质粒的构建

目的探讨不同β1,4半乳糖基转移酶-Ⅴ(β-1,4-GalTV)表达水平的生物学意义,构建正、反义β-1,4-GalTV表达质粒.方法设计β-1,4-GalTV全长引物;提取小鼠脑总RNA,通过RT-PCR方法,得到全长β-1,4-GalTV基因片段,将其克隆到pGEM-T载体.再通过多克隆酶切位点,将β-1,4-GalTV全长序列克隆到pcD-NA 3.1表达载体中.设计反义引物,以pGEM-β-1,4-GalTV质粒为模板,将PCR产物克隆到pcDA3.1表达载体中.通过酶切和测序鉴定构建的质粒.结果通过酶切和测序证实,得到了正、反义β-1,4-GalTV表达质粒.结论正、反义β-1,4-GalTV表达质粒的构建,为进一步研究不同β-1,4-GalTV表达水平的生物学意义奠定基础.     

β-1,4-半乳糖基转移酶I影响雪旺细胞衰老的研究

目的:探讨β-1,4-半乳糖基转移酶I与雪旺细胞衰老的相关性。方法:以不同浓度的β-1,4-GalT-I表达质粒转染雪旺细胞,观察衰老相关半乳糖苷酶染色情况。以Ha-Ras转染雪旺细胞诱导衰老,采用Northern blot方法检测转染后不同时间β-1,4-GalT-I表达变化。结果:随着转染β-1,4-GalT-I表达质粒浓度的提高,细胞衰老相关半乳糖苷酶染色阳性率增高;随着Ha-Ras转染时间的延长,β-1,4-GalT-I表达逐渐增高。结论:β-1,4-GalT-I与雪旺细胞的衰老相关,并可能在周围神经雪旺细胞的增殖调节中发挥重要作用。     

β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ影响雪旺细胞衰老的研究

目的:探讨β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ与雪旺细胞衰老的相关性.方法:以不同浓度的β-1,4-GalT-Ⅰ表达质粒转染雪旺细胞,观察衰老相关半乳糖苷酶染色情况.以Ha-Ras转染雪旺细胞诱导衰老,采用Northern blot 方法检测转染后不同时间β-1,4-GalT-Ⅰ表达变化.结果:随着转染β-1,4-GalT-Ⅰ表达质粒浓度的提高,细胞衰老相关半乳糖苷酶染色阳性率增高;随着Ha-Ras转染时间的延长,β-1,4-GalT-Ⅰ表达逐渐增高.结论:β-1,4-GalT-Ⅰ与雪旺细胞的衰老相关,并可能在周围神经雪旺细胞的增殖调节中发挥重要作用.     

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及测序

目的克隆α1,3-半乳糖基转移酶的序列,为进一步利用其构建真核表达载体,对肿瘤进行基因治疗奠定基础.方法从BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA,行RT-PCR扩增出编码α1,3-半乳糖基转移酶的全长cDNA,并克隆入pUCm-T测序载体.经DNA测序证实序列.结果经RT-PCR扩增出大小约为1.2kb的基因片段,成功克隆入pUCm-T载体.结论成功地克隆α1,3-半乳糖基转移酶基因序列,为进一步肿瘤基因治疗奠定了基础.     

细胞外信号调节激酶在脂多糖诱导内皮细胞β-1，4-半乳糖基转移酶-Ⅰ表达中的作用

目的:研究细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)对脂多糖(LPS)诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ,β-1,4-GalT-Ⅰ)表达的调节作用。方法:应用ERK通路抑制剂U0126预处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)2 h,再用LPS刺激HUVECs 4 h,分别用RT-PCR和Western-blot方法检测β-1,4-GalT-ⅠmRNA及蛋白水平表达变化,并通过内皮-单核细胞黏附试验观察HUVECs黏附能力的改变。结果:U0126显著抑制LPS引起的HUVECsβ-1,4-GalT-Ⅰ表达的上调及其黏附能力的上词。结论:ERK信号转导通路可能参与调节LPS诱导的内皮细胞β-1,4-GalT-Ⅰ的表达,并影响内皮细胞的黏附能力。     

IgA肾病患者核心1β3-半乳糖基转移酶基因编码区序列分析

目的:测定核心1β3-半乳糖基转移酶基因的DNA序列,试图在IgA肾病(IgAN)患者中发现该基因编码区DNA序列的异常.方法:应用双脱氧末端终止DNA测序技术,对核心1β3-半乳糖基转移酶基因外显子的PCR扩增产物进行直接测序,通过病例-对照研究方法,比较IgA肾病患者(50例)和正常对照(50例)之间核心1β3-半乳糖基转移酶基因组序列之间的差异. 结果:两者的核心1β3-半乳糖基转移酶基因编码区序列无差异.结论:未发现IgA肾病患者有核心1β3-半乳糖基转移酶基因序列的异常,提示该基因编码区与IgA肾病患者IgA1的O-糖基化异常可能无关.     

IgA肾病患者核心1β-半乳糖基转移酶基因编码区序列分析

目的：测定核心1β3-半乳糖基转移酶基因的DNA序列，试图在IgA肾病（IgAN）患者中发现该基因编码区DNA序列的异常。方法：应用双脱氧末端终止DNA测序技术，对核心1β3-半乳糖基转移酶基因外显子的PCR扩增产物进行直接测序，通过病例-对照研究方法，比较IgA肾病患者（50例）和正常对照（50例）之间核心1β3-半乳糖基转移酶基因组序列之间的差异。结果：两者的核心1β3-半乳糖基转移酶基因编码区序列无差异。结论：未发现IgA肾病患者有核心1β3-半乳糖基转移酶基因序列的异常，提示该基因编码区与IgA肾病患者IgAl的O-糖基化异常可能无关。     

β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ在大鼠脑损伤后的表达分析

目的：探讨脑损伤后β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ（β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ,β-1,4-GalT-Ⅰ）及其催化合成的β-1,4-半乳糖苷键（β-1,4-galactosylated carbohydrate,Galβ1-4GlcNAc）糖链与炎症的相关性.方法：运用免疫印迹法检测β-1,4-GalT-Ⅰ及Galβ1-4GlcNAc糖链在大鼠术后大脑皮质中的表达情况;采用免疫荧光双标,观察β-1,4-GalT-Ⅰ及Galβ1-4GlcNAc糖链在大脑皮质中的细胞定位.结果：大鼠脑损伤后,大脑皮质中β-1,4-GalT-Ⅰ及Galβ1-4GlcNAc糖链的表达水平呈现时间依赖关系,脑损伤后β-1,4-GalT-Ⅰ表达逐渐增加并持续在较高的水平,Galβ1-4GlcNAc糖链表达呈动态变化过程,在炎症早期上调达到高峰后有所降低.β-1,4-GalT-Ⅰ及其催化合成的Galβ1-4GlcNAc糖链主要定位于大脑皮质的活化的小胶质细胞中.结论：β-1,4-GalT-Ⅰ及其催化合成的Galβ1-4GlcNAc糖链在正常大脑皮质中仅有少量表达,脑损伤后两者表达均明显增高;术后高表达的β-1,4-GalT-Ⅰ主要定位于小胶质细胞,这提示该分子可能参与炎症介导的小胶质细胞的生物学行为的改变.     

β-1,4-半乳糖基转移酶-I在大鼠骨性关节炎模型中滑膜组织表达的意义

背景：观察β-1,4-半乳糖基转移酶-I（β-1,4-GalT-I）在手术诱导的大鼠骨性关节炎模型中的表达情况及细胞定位,并探讨其在OA病理过程中可能的生物学作用。 方法：健康成年SD大鼠90只随机分为三组：OA模型组（40只）、假手术组（40只）和正常组（10只）。采取前交叉韧带切断加内侧半月板前1/3切除法破坏SD大鼠右膝关节稳定性以建立大鼠OA模型。于术后1、2、4、6、10周取实验动物右膝关节的滑膜与软骨组织,并分离获取成纤维样滑膜细胞进行培养,利用real-time PCR检测软骨、滑膜组织及TNF-α刺激成纤维样滑膜细胞后β-1,4-GalT-I在mRNA水平的表达变化;运用Western-blotting和免疫组化检测β-1,4-GalT-I在蛋白水平的表达情况;利用免疫荧光双标法检测β-1,4-GalT-I与巨嗜细胞样滑膜细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、中性粒细胞及TNF-α的定位情况;运用ELISA检测成纤维样滑膜细胞在脂多糖及脂多糖联合β-1,4-GalT-I抗体等刺激下TNF-α的表达情况。 结果：β-1,4-GalT-I mRNA在OA组大鼠的滑膜组织中表现出上调趋势,于术后2w、4w达到高峰;在蛋白水平,β-1,4-GalT-I在OA术后4w组的滑膜组织中达到高峰。但是,β-1,4-GalT-I在软骨组织中的表达未检测到明显差异。在OA滑膜炎症过程中,β-1,4-GalT-I主要表达于巨嗜细胞样滑膜细胞、成纤维细胞样滑膜细胞和中性粒细胞,并且β-1,4-GalT-I与TNF-α共定位。在体外细胞培养中,成纤维样滑膜细胞中β-1,4-GalT-I的表达与TNF-α刺激呈浓度和时间依赖性。此外,β-1,4-GalT-I抗体可减弱脂多糖刺激成纤维样滑膜细胞产生TNF-α的能力。 结论：β-1,4-GalT-I可能参与了OA的滑膜炎症反应,并在这一过程中发挥重要作用。 [关键词] β-1,4-半乳糖基转移酶-I;骨性关节炎;滑膜炎症;肿瘤坏死因子α;大鼠     

β—l，4—半乳糖基转移酶的研究进展

β-1，4-半乳糖基转移酶在高尔基体上通过合成β-1，4糖苷键进行重要的蛋白质糖链修饰作用。同时β-1，4-半乳糖基转移酶I在细胞膜上，参与多种细胞的增殖、迁移、粘附等信号识别。随着许多编码蛋白具有β-1，4-GalT活性的新基因被克隆出来，有关它们的结构、底物、功能等成为研究热点。     

正、反义β1,4半乳糖基转移酶-Ⅰ表达质粒的构建

目的:为了探讨不同β1,4半乳糖基转移酶-I(β1,4-galactosyltransferase I,β-1,4-GalT-1)表达水平的生物学意义.方法:通过分子生物学手段,构建正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒.:设计β-1,4-GalT-I全长引物;提取小鼠脑总RNA,通过RT-PCR方法,得到全长β-1,4-GalT-I基因片段,将其克隆到pGEM-T载体.再通过多克隆酶切位点,将β-1,4-GalT-I全长序列克隆到pcDNA3.1表达载体中.设计反义引物,以pGEM-β-1,4-GalT-I质粒为模板,将PCR产物克隆到pcDNA3.1表达载体中.通过酶切和测序鉴定构建的质粒.结果:通过酶切和测序证实,实验得到了正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒.结论:正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒的构建,为进一步研究不同β-1,4-GalT-I表达水平的生物学意义奠定基础.     

β1,4-半乳糖基转移酶I影响雪旺氏细胞增殖的机制

目的:探讨β1,4-半乳糖基转移酶I影响雪旺氏细胞增殖的机制。方法:将不同浓度的β-1,4-GalT-I表达质粒转染雪旺氏细胞,采用Westernblot方法检测增殖相关信号分子cyclinD1、p16INK4以及p27Kip1的表达水平,North-ernblot方法检测p19ARF的表达变化。结果:随着β-1,4-GalT-I在雪旺氏细胞中的表达增加,cyclinD1表达降低,而p16INK4a和p19ARF呈现相反的变化;p27Kip1变化不明显。结论:β-1,4-GalT-I影响雪旺氏细胞增殖可能与cyclinD1、p16INK4a和p19ARF介导的信号传导途径有关。     

β1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ影响雪旺氏细胞增殖的机制

目的探讨β1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ影响雪旺氏细胞增殖的机制.方法将不同浓度的β-1,4-GalT-Ⅰ表达质粒转染雪旺氏细胞,采用Westem blot方法检测增殖相关信号分子cyclin D1、p16INK4以及p27Kipl的表达水平,Northem blot方法检测p19ARF的表达变化.结果随着β-1,4-GalT-Ⅰ在雪旺氏细胞中的表达增加,cyclin D1表达降低,而p16INK4a和p19ARF呈现相反的变化;p27Kipl变化不明显.结论β-1,4-GalT-Ⅰ影响雪旺氏细胞增殖可能与cyclin D1、p16INK4a和p19ARF介导的信号传导途径有关.     

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的：构建α1,3-半乳糖基转移酶的重组真核表达质粒pcDNA3.1/V5-HisAα1,3GT,为进一步利用其进行胃癌的基因治疗奠定基础。方法：从BALB／c小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA，行RT－PCR扩增出编码α1,3-半乳糖基转移酶的全长cDNA，并克隆入pUCm-T测序载体。经DNA测序证实序列无误后，将α1,3-半乳糖基转移酶基因片段亚克隆入pcDNA3.1/V5-HisA真核表达载体。结果：经RT－PCR扩增出大小约为1．2kb的基因片段，成功克隆入pUCm-T载体。经DNA测序证实为α1,3-半乳糖基转移酶（α1,3-galactosyltransferase,3GT），大小为1221bp，编码序列及读框均正确。经亚克隆酶切鉴定，获得携有α1,3GT基因的重组质粒pcNDA3.1/V5-HisAα1,3GT。结论：成功地构建α1,3GT真核表达载体，为进行肿瘤基因治疗奠定了基础。