小鼠TLR-2N末端基因的克隆表达和抗体制备

目的 克隆mTLR-2基因氨基端序列,并表达和纯化N端融合蛋白,制备抗mTLR-2 N末端的多克隆抗体.方法 采用PCR技术扩增编码mTLR-2N端1～153氨基酸的基因,并将其克隆到pET32A载体中,测序验证;用大肠杆菌表达融合蛋白,并以Probond树脂柱纯化;免疫家兔制备多克隆抗体,采用免疫组化、流式细胞术及间接ELISA检测抗体特异性及效价.结果 成功构建了融合表达载体pET-N,表达和纯化了相应的融合蛋白,所制备多克隆抗体可与pGEX-N表达的融合蛋白反应,并可结合表达TLR-2的RAW264.7及转染mTLR-2全长基因的CHO细胞.结论 获得了mTLR-2 N末端重组融合蛋白及其可与天然mTLR-2结合的多克隆抗体.     

生精相关基因mTSARG3的原核表达和抗体制备

目的 构建小鼠生精相关基因pGEX-KG/mTSARG3重组载体,进行原核表达和多克隆抗体制备.方法 应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框,T-A克隆后将mTSARG3插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/mTSARG3融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting对融合蛋白进行分析和鉴定.以融合蛋白为免疫原免疫家兔,制备抗mTSARG3多克隆抗体并进行Westernblotting鉴定.结果 成功构建了pGEX-KG/mTSARG3重组质粒,测序结果与预期一致;转化重组质粒的E-coliBL21经IPTG37℃诱导4h后高效表达GST/mTSARG3融合蛋白:Westernblotting实验结果显示制备抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了mTSARG3基因的原核表达和多克隆抗体制备,为下一步的功能研究奠定基础.     

Wilson蛋白N端多克隆抗体的制备和纯化

[目的]制备并纯化Wilson蛋白(ATP7B)的N端多克隆抗体，为进一步研究其基因表达蛋白的结构和功能打下基础。[方法]RT-PCR扩增目的基因，GST基因融合载体表达融合蛋白，亲和层析进行蛋白纯化，Thrombin酶切并收集目的蛋白，免疫家兔，ELISA检测抗体滴度，离子交换层析纯化抗体血清，Western blot检测抗体特异性。[结果]ELISA方法检测抗体滴度达到了1：2500，Western blot表明该抗体有很好的特异性，非变性SDS-PAGE显示纯化后的抗体IgG纯度很高。[结论]应用该方法成功制备了Wilson病蛋白质量的多克隆抗体。     

小鼠DHRS4基因原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备

目的：构建小鼠pDESTTM17/DHRS4重组载体,制备小鼠抗DHRS4多克隆抗体。方法：应用RT-PCR从小鼠肝组织扩增DHRS4的开放阅读框序列,测序确认后将其编码区构建到载体pDONRTM201上,再通过LR置换反应再将其置换到载体pDESTTM17上,测序后转化到E.coliBL21-AI工程菌中,并经阿拉伯糖诱导表达出抗DHRS4融合蛋白。以小鼠融合蛋白作为免疫原免疫大白兔,制备小鼠抗DHRS4多克隆抗体。结果：成功构建小鼠DHRS4重组载体;转化重组质粒的E.coliBL21-AI经阿拉伯糖诱导4 h后高效表达DHRS4融合蛋白;Western bolt实验结果显示制备的多克隆抗体可特异性检测小鼠肝组织DHRS4相应蛋白的表达。结论：成功构建小鼠pDESTTM17/DHRS4原核表达载体和获得小鼠抗DHRS4多克隆抗体。     

小鼠Tnfaipl基因的克隆、表达及抗体制备

目的克隆小鼠Tnfaipl基因，并在大肠杆菌中表达，通过免疫新西兰兔，获得小鼠Tnfaipl多克隆抗体，为进一步研究小鼠Tnfaipl的功能奠定基础。方法用RT-PCR方法从小鼠肝脏组织中扩增获得Tnfaipl基因的蛋白质编码区，将目的片段连接到PMD18-T载体，然后亚克隆至pGEX-4T-2中，进而在大肠杆菌BL21（DE3）中表达融合蛋白质GST-Tnfaipl，并用其免疫新西兰兔，获得小鼠Tnfaipl多克隆抗血清。结果得到了小鼠Tnfaipl多克隆抗体。结论成功得到了特异性好的、效价高的小鼠Tnfaipl多克隆抗体。     

PAK6基因的克隆、抗体制备及在前列腺癌中的表达

目的 在克隆P21相关激酶6(PAK6)全长cDNA的基础上,进一步克隆PAK6-N端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因产物并进行多克隆抗体制备,为研究PAK6与疾病的关系奠定基础.同时研究PAK6在前列腺癌中的表达.方法 根据人全长PAK6 cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA.在此基础上,以PAK6全长cDNA为模板克隆PAK6-N端基因,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DAN序列测定.GST-PAK6-N融合蛋白在硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用G1utothione亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-PAK6-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并用纯化的抗PAK6多克隆抗体在3例前列腺癌病人标本中进行了免疫组化表达的初步研究.结果 成功克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断,在E.coli中表达了PAK6-NT,纯化了GST-PAK6-N融合蛋白,并制备了PAK6特异性抗体.免疫组织化学研究表明:3例前列腺癌患者石蜡包埋病理组织切片免疫组化染色全部表现为间质阳性,PAK6在前列腺癌间质中呈现表达,而前列腺癌细胞则不染色.结论 首次克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断并成功制备了PAK6特异性抗体,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础.初步揭示PAK6在前列腺癌的表达     

Wilson蛋白N端多克隆抗体的制备和纯化

【目的】制备并纯化Wilson蛋白(ATP7B)的N端多克隆抗体,为进一步研究其基因表达蛋白的结构和功能打下基础。【方法】RT-PCR扩增目的基因,GST基因融合载体表达融合蛋白,亲和层析进行蛋白纯化,Thrombin酶切并收集目的蛋白,免疫家兔,ELISA检测抗体滴度,离子交换层析纯化抗体血清,Westernblot检测抗体特异性。【结果】ELISA方法检测抗体滴度达到了1∶2500,Westernblot表明该抗体有很好的特异性,非变性SDS-PAGE显示纯化后的抗体IgG纯度很高。【结论】应用该方法成功制备了Wilson病蛋白质量的多克隆抗体。     

Migfilin基因的克隆和真核表达载体的构建

目的 克隆Migfilin全长cDNA,构建Flag-migfilin真核表达载体并进行序列测定,为研究migfilin与疾病的关系奠定基础.方法 根据人全长migfilin cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板,利用PCR技术克隆migfilin全长cDNA.将扩增出的目的基因克隆至pCR 2.1载体,经Xba I/Hind Ⅲ双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA序列测定.将测序正确的目的基因克隆至Flag载体并鉴定.结果 成功克隆了migfi-lin全长cDNA,序列测定表明与已知migfilin基因序列一致.在此基础上,构建了flag-migfilin真核表达载体并进行了鉴定.结论 Flag-migfilin真核表达载体构建成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础.     

Smarcad1重组蛋白表达及多克隆抗体验证

目的:建立稳定的实验室多克隆抗体制备流程，选择Smarcad1作为目的基因进行重组蛋白表达纯化与多克隆抗体制备，并对其进行特异性验证。方法:以本实验室的pcDNA3.1-Flag-Smarcad1质粒作为模板，构建pET-16b-Smarcad1-F1原核表达质粒。表达Smarcad1-F1蛋白，并纯化。利用蛋白质免疫印迹，蛋白质免疫共沉淀和免疫荧光实验检测抗体特异性。结果:PCR鉴定结果显示，成功构建pET-16b-Smarcad1-F1表达质粒。蛋白表达纯化实验中，考马斯亮蓝染色检测，相较于诱导前，加入IPTG后Smarcad1蛋白成功诱导表达，且纯化出分子量为27 kD的目的蛋白。Western印迹证明，制备的抗体能够特异性识别内源性Smarcad1蛋白。蛋白质免疫共沉淀实验显示，相较于对照组，制备的抗体能够与Smarcad1蛋白结合。免疫荧光实验检测所制备抗体的特异性，结果显示制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白。结论:成功构建了Smarcad1原核表达质粒，利用原核蛋白表达纯化出Smarcad1蛋白，利用该蛋白制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白，为后续原核表达蛋白及多克隆抗体制备提供思路。     

携带跨膜信号的凋亡蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建携带跨膜信号序列的凋亡蛋白（apoptin）的原核表达载体PET-28a（＋）-apoptin,诱导表达并纯化重组apoptin蛋白,制备多克隆抗体。方法用多重PCR的方法扩增跨膜信号序列（PTD）及apoptin的编码序列,构建原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,转化大肠杆菌BL21（DE3）,低温条件下IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法鉴定蛋白表达,经镍亲和层析方法纯化目的蛋白后,免疫BALB／c小鼠,制备多克隆抗体。结果DNA测序鉴定表明成功构建了原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经低温和IPTG诱导后,获得重组apoptin蛋白,制备的多克隆抗体经ELISA方法和免疫印迹法证实能特异性地识别apoptin。结论成功获得了携带跨膜信号序列的重组蛋白apoptin及其多克隆抗体,为进一步研究其特异性诱导肿瘤细胞凋亡功能及相关机制奠定了基础。     

人精子蛋白FSCB的表达、纯化和多克隆抗体制备

目的：构建表达重组人精子蛋白FSCB的重组质粒,获得其纯化重组蛋白并制备其多克隆抗体.方法：分别成功构建了表达人精子全长FSCB蛋白和截短FSCB（FSCBt）蛋白的重组菌株BL21,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法和分子筛层析法纯化目的蛋白FSCBt,免疫接种雌性家兔制备多克隆抗体.结果：重组菌成功诱导表达了重组蛋白FSCB和FSCBt,相对表观分子量分别为230000和30000,重组蛋白FSCBt经纯化后纯度达到95%,制备的多克隆抗体效价达到1∶105,Western Blot显示多克隆抗体与重组蛋白FSCB和FSCBt均具有良好的反应性.结论：人精子蛋白FSCB在重组菌株中得到表达,成功制备高效价的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白在人体组织中的表达、分布以及生物学功能奠定了实验基础.     

人L-选择素的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建人L-选择素原核表达载体,表达并纯化人L-选择素重组蛋白,制备兔抗人L-选择素多克隆抗体。方法：利用人L-选择素cDNA的N末端胞外结构区153个氨基酸的开放阅读框架(ORF),通过PCR方法扩增出人L-选择素目的片段。将扩增的基因插入表达载体pQE40的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点之间,再经转化使其在大肠杆菌M15中表达,产生含6-His-tag的融合蛋白。融合蛋白经Ni亲合层析柱纯化和SDS-PAGE分析后,用以免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。最后经Western blotting检测和斑点杂交（DIBA）进行抗体效价测定。结果：酶切鉴定和DNA测序显示,pQE40-L-选择素重组表达载体含有人L-选择素N末端结构区153个氨基酸的cDNA序列;通过在大肠杆菌M15中的表达和纯化分析,获得了蛋白含量为600 mg·L^-1的人L-选择素蛋白;通过免疫新西兰白兔和抗体效价测定,得到抗血清效价达1∶1 000的多克隆抗体。结论：人L-选择素蛋白可在M15大肠杆菌中高效表达,其多克隆抗体效价较高。     

UGRP1蛋白的表达、纯化、抗体制备及亚细胞定位

目的子宫球蛋白相关蛋白1(UGRP1)是一种功能未知的分泌蛋白。通过表达、纯化蛋白、制备抗体及其在组织中表达的研究,为进一步研究其功能奠定基础。方法从人胎肺组织中克隆得到UGRP1基因,构建重组表达质粒pGEX-5X-1/UGRP1。将此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,表达含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的GST-UGRP1融合蛋白。此融合蛋白经纯化分离后,免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体。用Western印迹的方法检测多抗血清。通过构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的EGFP-N2-UGRP1载体,转染非洲绿猴肾细胞(COS细胞)表达重组蛋白,对UGRP1的表达进行亚细胞定位。结果成功构建了pGEX-5X-1/UGRP1载体,获得了高纯度的重组蛋白和多克隆抗体。免疫组化分析表明UGRP1表达于肺支气管上皮细胞,亚细胞定位分析证实UGRP1主要表达于细胞浆。结论研究发现UGRP1表达于肺支气管上皮细胞和在COS细胞的胞浆中表达。经纯化获得蛋白并制备抗体,为进一步研究UGRP1的功能奠定了基础。     

大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(NGB)基因,通过原核表达制备其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序证明该基因序列正确后,亚克隆人pET-28a( )载体中,通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.转化大肠杆菌BL21菌株,获得可溶性表达产物,经鉴定、纯化后免疫新西兰兔,分离血清,ELISA法测定抗体效价.结果 神经球蛋白多克隆抗体效价达1:100 000,此多抗可以与293细胞内表达的重组蛋白发生很好的抗原抗体反应.结论 成功制备了兔抗NGB的多抗,为后续研究提供了重要的实验材料.     

人睾丸特异表达基因PIAS-NY 原核表达 和多克隆抗体的制备

目的 构建PIAS-NY-pET30a 原核表达载体,并诱导其成功表达,经纯化后获得高浓度的可溶性融 合蛋白His-PIAS-NY,免疫小鼠获得鼠源性PIAS-NY 多克隆抗体。方法 以人精原cDNA 文库为模板,通过 聚合酶链反应（PCR）扩增PIAS-NY 开放阅读框,克隆到pET30a 表达载体中,酶切、PCR 鉴定构建重组质粒。 测序完全正确后将质粒PIAS-NY-pET30a 转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行大量扩增,异丙基-β-D- 硫 代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。超声、离心、His-Ni 柱亲和层析纯化包涵体蛋白,依次经过不同浓度尿素进 行蛋白质复性,获得高浓度的可溶性His-PIAS-NY 融合蛋白。分6 次BalB/C 小鼠腹腔注射乳化纯化蛋白。 2 个月后小鼠眼球取血,收集血清。结果 成功构建原核表达质粒PIAS-NY-pET30a ;利用终浓度1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h,大肠杆菌BL21 大量表达融合蛋白His-PIAS-NY,并以包涵体形式存在于菌体中;尿素 变性后His-Ni 柱纯化融合蛋白,复性后获得高浓度的可溶性蛋白His-PIAS-NY ;6 次免疫后收获存活小鼠 抗血清;酶联免疫吸附测定（ELISA）抗血清滴度达到1 ∶ 100 000 ;免疫印迹和免疫共沉淀证实PIAS-NY 抗血清能特异性识别293T 细胞和GC2 细胞中PIAS-NY 蛋白。结论 成功获得PIAS-NY 多克隆抗体,而且 具有高反应性和高特异性,PIAS-NY 在GC2 细胞和293T 细胞中表达,并且能够与RUVBL2 蛋白发生相互作用。     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.