原代视网膜母细胞瘤耐药基因及耐药蛋白表达的研究

目的 研究视网膜母细胞瘤(Rb)瘤细胞多药耐药基因(MDR1)和多药耐药相关蛋白(MRP)基因以及相应耐药蛋白P-gp和MRP的表达水平.方法 共35例Rb患儿,行眼球摘除术时取新鲜的肿瘤细胞,用RT-PCR的方法 检测Rb瘤细胞是否有耐药基因MDR1和MRP基因的表达,用免疫组织化学的方法 检测相应耐药蛋白P-gp和MRP的表达.结果 34例Rb瘤细胞进行了耐药基因的检测,MDR1基因平均表达水平为0.41±0.38,MRP基因平均表达水平为0.73±0.92;35例Rb进行了耐药蛋白的检测,P-gp有15例阳性(42.9%),MRP有23例阳性(65.7%);34例Rb两种基因和蛋白两种方法 的检验结果 呈一致性;两种耐药基因及两种耐药蛋白的表达相互间有一定的联系.结论 原代Rb瘤细胞中一部分个体有不同程度的耐药基因MDR1和MRP基因及其产物耐药蛋白P-gp和MRP的表达,提示Rb可能存在原发耐药性.     

KAI1对HXO—Rb44细胞同质性黏附、迁移和侵袭能力的影响

目的研究肿瘤转移抑制基因KAI1对人视网膜母细胞瘤HXO．Rb44细胞黏附力、运动力和侵袭力的影响。方法实验研究。应用脂质体转染法将含KAI1的真核表达质粒pCMV—KAI1转染人HXO—Rb44细胞株,命名为HXO—Rb44-KAI1,使其KAI1蛋白过表达。以转染空载体质粒pcDNA3．1（＋）及未转染质粒的HXO—Rb44细胞作为对照,分别命名为HXO—Rb44．KAI1／zero及HXO—Rb44。质粒转染48h后,吹散细胞,显微镜下观察三组细胞的同质性黏附情况;应用Transwell小室及其联合Matrigel分别进行迁移和侵袭实验。100倍光镜下观察进入Transwell下室的细胞并随机选取5个视野进行细胞计数,采单因素方差分析对三组细胞的迁移和侵袭能力进行比较。结果质粒转染48h后,PCR及WesternBlot显示HX0-Rb44-KAI1细胞的KAI1表达明显强于HXO-Rb44-KAI1／zero及HXO—Rb44细胞。HXO—Rb44-KAI1细胞的同质性黏附力明显强于HXO-Rb44-KAI1／zero及HXO—Rb44细胞。Transwell迁移实验显示,100倍镜下下室中平均每视野细胞数,HXO—Rb44-KAI1组为（20．4±4．0）个,HXO-Rb44-KAI1／zero组为（46．0±4．5）个,HXO-Rb44组为（52．1±3．6）个,差异有统计学意义（F=256．71,P〈0．01）。侵袭实验显示100倍镜下下室中平均每视野细胞数,HXO—Rb44-KAI1组为（16．7±3．3）个,HXO—Rb4J4．KAI1／zero组为（42．5±3．7）个,HXO—Rb44组为（47．3±5．2）个,差异有统计学意义（F=235．12．P〈0．01）。结论KAI1可显著增强HXO—Rb44细胞同质性黏附力,抑制其运动力和侵袭力。     

多药耐药蛋白1和多药耐药相关蛋白5、7在糖尿病小鼠视网膜中表达的变化

目的 观察多药耐药蛋白1(muhidrug resistance 1,MDR1)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)5和MRP7在不同时期糖尿病小鼠视网膜中的表达变化.方法 通过腹腔注射链脲佐菌素诱导C57 BL/6小鼠建立糖尿病模型,伊文思蓝灌注检测血-视网膜内屏障变化.分别于糖尿病造模成功后的4周、12周和24周取小鼠视网膜,进行实时定量-PCR、免疫荧光、Western blotting等实验,检测各组小鼠视网膜中MDR1、MRP5和MRP7的表达变化.结果 伊文思蓝灌注结果显示在糖尿病12周就出现视网膜渗漏;实时定量-PCR结果发现与对照组相比,随糖尿病进展,MDR1、MRP5和MRP7在4周、12周和24周的表达均呈下降趋势(MDR1:P4周=0.028,P12周=0.003,P24周＜0.001;MRP5:P4周=0.045,P12周=0.009,P24周＜0.001;MRPy7:P4周=0.019,P12周＜0.001,P24周 =0.001),在糖尿病不同时期其变化也呈下降趋势(均为P＜0.05);免疫荧光观察到MDR1、MRP5和MRP7的荧光强度随糖尿病发展逐渐减弱;Western blotting检测可见在4周、12周、24周糖尿病小鼠视网膜中MDR1、MRP5和MRP7的表达均呈下降趋势.结论 在DR早期血-视网膜内屏障会受到破坏,视网膜中外排转运蛋白的表达也会受糖尿病的影响导致不同程度的下降.     

视网膜母细胞瘤多药耐药相关蛋白的研究

目的 检测P-糖蛋白(P-Gp)、多药耐药基因相关蛋白(MRP)及肺耐药相关蛋白(LRP)在视网膜母细胞瘤(Rb)中的表达及临床意义;初步分析Rb患者临床病理指标与MRP间的关系;探讨Rb多药耐药现象的可能机制.方法 实验研究.应用免疫组织化学染色方法检测P-gp、MRP、LRP在75例Rb肿瘤标本中的表达情况.分析3种蛋白表达的相关性及其与患者年龄、性别、眼别、临床表现、组织病理分化程度等临床病理指标的相关性.各蛋白表达情况与一般临床特点、组织病理学特征的比较采用卡方检验,各蛋白间的相关性采用多元相关分析.结果 P-Gp、LRP、MRP蛋自在Rb中阳性表达率分别为64.0%、25.3%、36.0%.P-gp与LRP、P-gp与MRP、LRP与MRP的共表达阳性率分别为18.7%、32.0%、20.0%.P-gp、LRP、MRP在分化型Rb组织中的阳性表达率均高于杀分化型,且组间差异具有统计学意义(χ2=8.002,χ2=17.327,χ2=28.421;P<0.05).3种蛋白的表达均与年龄、性别、眼别无关(χ2=0.003～3.385,P>0.05).P-gp、LRP的表达分别与MRP的表达其有相关性(r=0.389,r=0.521;P<0.05).结论 Rb原发性多药耐药的形成是一个多因素、多步弱的复杂过程,与包括P-gp、LRP、MRP等在内的多项因素的参与有关.P-gp、LRP、MRP蛋白可以作为反映Rb耐药的分子基础,耐药相关标志的联合检测更有利于准确判断Rb的多药耐药状态,为Rb化学治疗提供科学的理论依据.     

苦参碱对人视网膜母细胞瘤细胞生长与端粒酶活性影响的实验研究

目的探讨苦参碱（Ma）对体外培养的人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞的生长抑制作用及其机制。方法培养的人HXO—Rb44细胞经不同浓度的Ma作用后,采用噻唑蓝比色法（MTT法）测定细胞的生长状况;采用苏木素-伊红染色、流式细胞技术及核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口标记法检测细胞凋亡率和形态学变化;采用端粒重复扩增法检测端粒酶活性的变化。结果一定浓度范围内Ma可抑制HXO—Rb44细胞的生长（P〈0．01）,24h内呈浓度依赖性。0．4mmol／LMa作用12h,可观察到HXO—Rb44细胞凋亡的形态改变,细胞凋亡率开始增加（P〈0．01）,端粒酶活性下降（P〈0．01）,两者在48h内均呈时间依赖性,并具有一定相关性（r=-0．961,P〈0．01）。结论Ma可抑制HXO—Rb44细胞生长,诱导其凋亡,端粒酶活性下降可能是Ma诱发HXO—Rb44细胞凋亡机制之一,提示Ma对视网膜母细胞瘤的综合治疗具有一定的应用前景。     

葡萄膜黑色素瘤多药耐药基因的表达与患者预后因素的分析

目的 探讨葡萄膜黑色素瘤多药耐药基因的表达与患者预后的相关关系。 方法选择石蜡包埋葡萄膜黑色素瘤组织96例，通过脱色素免疫组织化学检测细胞周期素D1(cyclin D1)、上皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)、转移抑制基因23(non-metastasis gene 23, nm 23)、P糖蛋白(P glucose protein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance relation protein,MRP)、肺耐药蛋白(lung-resistance-protein,LRP)基因表达。选择病例资料较完整者，进行随访，随访结果分类统计。 结果 96例葡萄膜黑色素瘤中类上皮细胞型21例、混合细胞型56 例和梭形细胞型19例，其中眼内期76例，眼外期20例。随着转移抑制基因nm 23表达的减低和Cyclin D1、EGFR表达的增高，耐药相关基因表达有增高趋势，其中MRP和LRP的表达与nm 23的表达呈明显负相关关系，与Cyclin D1、EGFR的表达呈明显正相关关系。随访结果显示，回访人数58例，生存超过 5年者26例，5年内死亡者19例。 结论 葡萄膜黑色素瘤多药耐药基因尤其LRP的表达与患者预后具有明显的相关性。 （中华眼底病杂志，2003，19：1-4）     

榄香烯乳对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞survivin表达及端粒酶活性的影响

目的观察榄香烯乳对视网膜母细胞瘤（Rb）HXO-RB44细胞凋亡抑制蛋白survivin表达及端粒酶活性的影响，探讨榄香烯乳对RbHXO-RB44细胞的作用机制。方法用不同浓度榄香烯乳作用于HXO-RB44细胞，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞增生活性；RT-PCR检测survivinmRNA的表达；聚合酶链反应方法检测端粒酶活性。结果榄香烯乳处理后HXO-RB44细胞受到不同程度的抑制，survivinmRNA表达下降；RB细胞系端粒酶活性减弱。结论榄香烯乳诱导HXO—RB44细胞凋亡与survivin有关；可减弱RB细胞系端粒酶活性，影响其周期变化，抑制RB细胞系增生。     

白藜芦醇对视网膜母细胞瘤细胞多药耐药性相关因子表达的影响

目的 观察白藜芦醇对视网膜母细胞瘤(RB)细胞多药耐药性(MDR)因子表达的影响.方法 体外培养RB细胞,取对数生长期细胞进行实验.实验分为实验组及对照组进行.采用浓度为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L的白藜芦醇处理RB细胞,作用24、48 h后,噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度组RB细胞的吸光度[A,旧称光密度(OD)]值,以此表示RB细胞活性.采用浓度为50.00 μmol/L的白藜芦醇处理RB细胞48 h,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)分别检测MDR-1、环氧化酶(COX)-2、多药耐药相关蛋白(MRP)-1、谷胱苷肽转移酶(GST)-π的m RNA和蛋白表达.3种检测均以加入等体积0.5％二甲基亚砜细胞培养液为对照组.结果 MTT比色法检测结果显示,与对照组比较,6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L实验组A值呈剂量依赖性降低,差异有统计学意义(F=4.782,P＜0.05).50.00、100.00 μmol/L实验组A值间差异无统计学意义(F=6.351,P＞0.05).RT-PCR检测结果显示,实验组MDR-1、MRP1、COX-2、GST-π mRNA表达较对照组显著降低,差异均有统计学意义(t=9.170、5.758、4.152、4.638,P＜0.05).Western blot检测结果显示,实验组MDR-1、MRP1、COX-2、GST-π蛋白表达较对照组显著降低,差异均有统计学意义(t=3.848、5.955、4.541、3.514,P＜0.05).结论 白藜芦醇可降低RB细胞MDR因子的表达.     

耐长春新碱视网膜母细胞瘤细胞株的建立

目的：研究视网膜母细胞瘤获得性多药耐药现象，探讨其产生机制。方法：利用长春新碱(vincristree，VCR)对人视网膜母细胞瘤细胞系HXO-RB₄₄细胞在体外进行浓度递增法逐步诱导实验，建立一株耐长春新碱视网膜母细胞瘤细胞亚株HXO—RB/VCR。并对其细胞生长，药物含量，药物敏感性与放射性敏感性进行检测。 结果：该耐药细胞株HXO—RB/VCR细胞对长春酰胺、丝裂霉素C、阿霉素、足叶乙甙、顺铂、卡铂等有交叉耐受，对卡氮芥、氟尿嘧啶无明显抗药性，而对氨甲喋呤的敏感性反而增加。对⁶⁰ Coγ射线有轻度耐受性。细胞内药物含量测定显示：耐药细胞内长春新碱浓度明显低于敏感细胞，钙通道阻断剂异博定可使细胞内VCR浓度增加，部分逆转其耐药性。 结论：VCR可诱导视网膜母细胞瘤产生多药耐药和轻度放射耐受，获得性多药耐药作用可被异博定逆转。 （中华眼底病杂志，1997，13：6-9）     

P-糖蛋白及多药耐药相关蛋白在眼眶横纹肌肉瘤中的表达及意义

目的　研究P 糖蛋白(P gp)、多药耐药相关蛋白 (MRP)在眼眶横纹肌肉瘤中的表达及临床意义。 方法　免疫组织化学法检测 42例眼眶横纹肌肉瘤和 10例正常眼眶组织中P gp、MRP的表达。 结果　P gp、MRP在眼眶横纹肌肉瘤组织中的表达阳性率分别为 38 10%和 54 76%,显著高于正常眼眶组织 (P<0 05 );P gp、MRP表达与年龄、性别、组织学类型、分期无关;复发组P gp和MRP的阳性表达率显著高于初发组(P<0 05);两蛋白间未见相关性。 结论　眼眶横纹肌肉瘤组织的多药耐药与P gp、MRP过表达有关,检测P gp、MRP的表达对判断预后有参考价值。     

高三尖杉酯碱诱导视网膜母细胞瘤程序性死亡

目的；观察高三尖杉酯碱(homoharringtonine，HHT)对视网膜母细胞(retinoblastoma，RB)细胞系HXO—RB₄₄：细胞的杀伤作用及其诱导的细胞死亡形式。 方法：用MTT法测定肿瘤细胞存活率，提取药物作用后的细胞核DNA进行琼脂糖凝胶电泳。 结果：HHT在10^-9mol/L~10^-4mol/L浓度范围对HXO-RB₄₄具有较强的杀伤作用(P<0.05)。10_-6mol/L的HHT与HXO-RB₄₄作用48小时后，核DNA发生有规律的裂解，琼脂糖凝胶电泳呈典型DNA梯度。 结论：HHT诱导RB发生程序性死亡(programmedcelldeath，PCD)，其诱导活性呈较强的浓度和时间依赖性。 （中华眼底病杂志，1997，13：70-72）     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应研究

目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／更昔洛韦(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-tk／GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤(retinoblastcraa,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用阳离子脂质体将pCMV／hytk-IRES-hrGFP质粒导入人视网膜母细胞瘤株HXO-Rb44细胞,荧光显微镜下观察转染效果,并用潮霉素筛选出转染阳性细胞HXO-Rb44／tk.RT-PCR鉴定hytk基因在HXO-Rh44细胞中的整合转录结果。比较转染前后Rb细胞的形态和生长特性。通过MTT法检测GCV对HXO-Rb44/tk细胞的杀伤作用以及对不同比例HXO-Rb44/tk和混合细胞的杀伤作用(“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果转染效率约为20％。HXO-Rb44／tk细胞mRNA经RT-PCR可检测出530bp的hytk基因片段。转染前后Rb细胞的形态和生长特性无明显改变。HXO-Rb44／tk细胞对GCV高度敏感,并表现出时间和和剂量的依赖性。HSV-tk/GCV系统对Rb细胞的杀伤过程中存在明显的旁观者效应,而GCV作用的HXO-Rh44/tk细胞上清对HXO-Rb44细胞生长无影响。结论 HSV-tk基因转移联合GCV治疗可作为视网膜母细胞瘤基因治疗的一种有效方法,GCV代谢产物通过细胞间缝隙连接进行转运可能是此系统旁观者效应的主要机制。     

Immunohistochemical detection of multidrug-resistant protein expression in retinoblastoma treated by primary enucleation

PURPOSE: To compare the expression of multidrug-resistant proteins in retinoblastoma tumors among eyes treated with primary enucleation. METHODS: A group of 18 patients with unilateral retinoblastoma with advanced intraocular disease was selected for the study. All patients had undergone primary enucleation. A histologic specimen from each patient was retrieved from the pathology archives and a tissue gene microarray was constructed (0.6 x 3-4 mm). Standard immunohistochemical techniques were used to study the tissue microarrays for the expression of the ATP-binding cassette (ABC) transporters: breast cancer resistance protein (BCRP; ABCG2), multidrug-resistant protein 1/P-glycoprotein (MDR1/Pgp; ABCB1), multidrug-resistant-associated protein 1 (MRP1; ABCC1), MRP2 (ABCC2), and MRP4 (ABCC4). RESULTS: Of the 18 specimens retrieved, 16 had adequate tissue for study. MRP1 was expressed in 8 (50%) of 16 tumors, and MRP2 was expressed in 5 (31%) of 16 tumors. MDR1/Pgp was found in 2 (12%) of 16 retinoblastomas. MRP4 and BCRP were not detected in any of the tumors studied. CONCLUSIONS: The results show that multiple ABC transporters were present in a cohort of sporadic patients with unilateral retinoblastoma who underwent primary enucleation. Studies are planned of the expression of ABC transporters in eyes treated by chemotherapy and/or radiation as a comparison with this group.     

microRNA-125b对人视网膜母细胞瘤多药耐药性影响的实验研究

目的 探讨microRNA-125b（miR-125b）在人视网膜母细胞瘤细胞中多药耐药的作用及其机制。设计 实验研究。 研究对象 人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞。方法 用RT-PCR方法检测miR-125b视网膜母细胞瘤细胞株SO-RB50和耐药细胞株SO-Rb50/VCR中的表达变化;化学合成的miR-125b过表达（miR-125mimic 组）和抑制载体（miR-125inhibitor组）转染SO-Rb50细胞株,用MTT法和Annexin V-FITC法检测在药物长春新碱、依托泊苷和卡铂,依次作用上述转染细胞后,细胞增生力和细胞凋亡的变化;用蛋白印迹法检测miR-125b过表达和抑制表达后细胞株SO-RB50中 MAGE-A/P53蛋白的表达变化。主要指标 细胞存活率和细胞凋亡率。结果 SO-Rb50/VCR组与SO-RB50组相比,miR-125b的表达显著增高（P=0.002）;长春新碱、依托泊苷和卡铂依次作用于转染后的SO-RB50细胞株后,miR-125mimic组与miR-125inhibitor组相比,细胞存活率显著增高（P=0.000）,细胞凋亡率显著下降（P=0.000）,P53蛋白表达水平显著下降（P=0.001）,MAGE-A蛋白表达水平显著增高（P=0.004）。结论 在SO-RB50细胞中,下调miR-125b后提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性,且miR-125b可能是通过MAGE-A/P53通路调控视网膜母细胞瘤多药耐药性。     

质粒介导RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮生长因子表达

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA（shRNA）表达质粒稳定转染对视网膜母细胞瘤（RB）细胞中VEGF表达的作用。方法构建VEGF shRNA表达质粒p4．1CMV—VEGF shRNA,以脂质体介导其转染两种RB细胞系SO—RB50和HXO—RB44,新霉素筛选结合梯度稀释法获得p4．1CMV—VEGF shRNA阳性RB细胞单克隆,继续培养扩增建立p4．1CMV—VEGF shRNA阳性RB细胞,用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测RB细胞中VEGF基因的表达,并用酶联免疫吸附（ELISA）法检测RB细胞上清中VEGF蛋白的表达;以与哺乳动物基因组无同源性的shRNA表达质粒p4．1CMV—Neg shRNA作为阴性对照,同时以未做任何处理组作为空白对照。结果成功构建p4．1CMV—VEGF shRNA并获得其表达阳性的RB细胞克隆。阴性对照组和空白对照组SO-RB50细胞的VEGF基因表达量分别为实验组的5．02倍和6．32倍;阴性对照组和空白对照组HXO—RB44细胞分别为实验组的5．70倍和4．86倍。实验组SO—RB50细胞上清中,VEGF蛋白浓度为（187．69±83．89）μg/L,显著低于阴性对照组（822．98±187．98）μg/L和空白对照组（865．76±170．33）μg／L,差异有统计学意义（均P〈0．01）;实验组HXO—RB44细胞上清中,VEGF蛋白浓度为（162．20±66．33）μg／L,与阴性对照组（764．33±164．79）μg／L和空白对照组（828．22±145．94）μg／L比较,差异也有统计学意义（均P〈0．01）。结论VEGF shRNA表达质粒稳定转染可高效抑制RB细胞中VEGF的表达,靶向VEGF的RNA干扰可作为拮抗VEGF并治疗RB的有效手段。（中华服科杂志,2007,43：493-498）