FOXO3a转录因子参与调控新生大鼠卵母细胞凋亡的实验研究

目的:探讨新生大鼠卵巢卵母细胞的凋亡是否与FOXO3a(forkhead box group O)转录因子在细胞核内高表达有关。方法:取新生1d、2d、3d、4d雌性SD大鼠卵巢,用免疫组织化学方法检测FOXO3a与其靶分子促凋亡蛋白BIM的表达变化;TUNEL化学染色观察新生大鼠卵巢中卵母细胞凋亡状况;再用免疫组织荧光联合TUNEL荧光检测技术观察FOXO3a和其靶分子BIM表达水平与卵母细胞凋亡的关系。结果:免疫组织化学结果显示,FOXO3a在一些卵母细胞巢内和原始卵泡的卵母细胞核内高表达,其阳性率在出生后1-2d较高,随后逐渐下降。与FOXO3a相似,BIM也是在一些卵母细胞巢内和原始卵泡的卵母细胞中高表达,阳性率变化规律也与FOXO3a一致。凋亡细胞主要见于卵母细胞巢内和原始卵泡的卵母细胞中,其凋亡率变化与FOXO3a阳性率变化一致。免疫组织荧光联合TUNEL荧光检测结果表明,FOXO3a(核内)与BIM高表达的卵母细胞正是凋亡的卵母细胞。结论:FOXO3a转录因子参与新生大鼠卵巢中卵母细胞巢内卵母细胞和原始卵泡卵母细胞的凋亡调控。     

茶多酚对新生大鼠卵巢发育的影响

目的:探讨茶多酚对新生大鼠卵泡发育和卵母细胞凋亡的影响及相关调控机制。方法:受孕11.5dSD大鼠灌胃茶多酚(100mg/kg,qd)直至分娩,分别用多聚甲醛固定出生后1d、2d、4d、8d龄雌仔鼠卵巢(A组),同时将正常出生后1d的雌幼SD大鼠腹腔注射茶多酚(50mg/kg×1-8d),分别固定出生后2d、4d、8d龄卵巢(B组);所有卵巢经HE染色,观察不同发育阶段的卵泡比例,TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)荧光染色检测卵巢内卵母细胞凋亡变化,免疫组化方法观察叉头转录因子(FOXO3a)、促凋亡因子(Bim)和抗凋亡因子(MnSOD2)在卵巢组织中的表达水平,并以母、幼均未处理的正常同龄大鼠卵巢为对照(C组)。结果:在茶多酚干预组(包括A组和B组)卵巢内,1d、2d龄未装配卵泡比例及4d、8d龄原始卵泡比例均高于C组;A组、B组中卵母细胞TUNEL阳性率显著低于C组;FOXO3a、MnSOD2在A组的1d、2d、4d龄卵巢中的表达高于C组,但二组间的Bim表达水平相一致。结论:茶多酚能延缓新生大鼠卵母细胞巢破裂,抑制原始卵泡的发育启动,减少卵泡的消耗,可能有益于延长卵巢的生殖寿命;茶多酚可能通过上调FOXO3a的活性从而抑制原始卵泡的发育启动,同时通过激活其下游靶分子MnSOD2抑制卵母细胞的凋亡,促进卵母细胞的存活。     

新生鼠卵巢FOXO3a表达水平与卵母细胞凋亡的相关性初步研究

目的:探讨新生大鼠卵巢中FOXO3a(forkhead box groupO)转录因子表达水平与卵母细胞凋亡的相关性。方法:取出生后2d、3d、8d、15d龄大鼠的卵巢,用免疫组化方法观察FOXO3a、caspase-3在卵巢组织中的定位及表达水平,且用TUNEL技术检测卵巢内卵母细胞的凋亡变化。结果:FOXO3a在新生大鼠部分卵母细胞巢内的卵母细胞核内高表达,而在卵泡发育启动后,FOXO3a则从卵母细胞的核内逐渐转移至胞浆。而在次级和成熟卵泡的卵母细胞内,FOXO3a仅出现在胞浆内。≤8d龄大鼠卵巢的部分卵母细胞核内或胞核、胞浆内可检测到caspase-3表达,2d、3d龄大鼠部分卵母细胞核内高表达。TUNEL染色与caspase-3结果相似,2d龄大鼠卵巢的卵母细胞阳性率最高。结论:生后2d大鼠卵巢的卵母细胞存在一个凋亡高峰期;在原始卵泡形成前,FOXO3a在部分卵母细胞核内高表达,并与卵母细胞的凋亡率呈一致性。     

MicroRNAs在新生鼠卵巢中的表达研究

目的:探讨microRNAs(miRNAs)对原始卵泡的形成和发育的影响。方法:取1d龄新生小鼠卵巢,制备卵巢切片,利用原位杂交技术观察mir-143、let-7a、let-7b、let-7c和mir-125b在新生小鼠卵巢中的表达情况。结果:1d龄新生小鼠卵巢内只含有大量原始卵泡,mir-143、let-7a、let-7b、let-7c和mir-125b表达于这些原始卵泡的颗粒细胞内,在卵母细胞中不表达。结论:miRNAs可能通过调控原始卵泡颗粒细胞的增殖和/或分化,或通过调控下游靶基因表达直接或间接地影响卵泡形成和发育中的重要因子(FSH、抗苗勒氏管激素、生长分化因子9等),从而对原始卵泡的形成和生长启动产生影响。     

TFF3激活PI3K/Akt通路参与宫颈腺癌的发病机制

目的:探讨TFF3通过激活PI3K/Akt信号通路调控宫颈腺癌发生发展的机制。方法:TFF3细胞因子和PI3K/Akt信号通路抑制剂(LY294002)或两者共同处理Hela细胞,CCK-8法检测Hela细胞增殖能力,Transwell小室观察细胞迁移能力,流式细胞学方法检测细胞凋亡,Western blot检测PI3K/Akt信号通路关键蛋白Akt及其激活状态蛋白p-Akt的表达。结果:与对照组相比,TFF3处理后Hela细胞的增殖和迁移能力明显提高,细胞凋亡减弱,差异有统计学意义(P0.05);LY294002处理后Hela细胞的增殖及迁移能力明显降低,细胞凋亡增多,差异有统计学意义(P0.05);TFF3+LY294002处理后Hela细胞的增殖、迁移能力及细胞凋亡与TFF3和LY294002处理组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。Western blot结果表明,TFF3能激活p-Akt基因表达。结论:TFF3能通过提高p-Akt蛋白表达激活PI3K/Akt信号通路,从而参与调节宫颈腺癌细胞的恶性行为。     

微小RNA-204对前列腺癌细胞株CL1的生长调节及其机理研究

目的:探讨微小RNA(mi R)-204对前列腺癌细胞株CL1的生长调节及其机理。方法:获得mi R-204高表达的CL1稳转细胞株(CL1-mi R-204)及其阴性对照的CL1稳转细胞株(CL1-对照)后,观察其细胞生长速度,检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)磷酸化水平及AKT总蛋白和p27蛋白的表达,并检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通道抑制剂LY294002对2种细胞生长的影响。结果:mi R-204能促进CL1的生长;升高AKT在苏氨酸(T308)和丝氨酸(S473)2个位点的磷酸化水平;抑制AKT下游的靶基因p27蛋白表达水平。加入LY294002后,CL1-对照和CL1-mi R-204的生长速度都降低。但CL1-mi R-204的生长速度下降得更明显。结论:mi R-204可能是通过AKT信号通路来促进CL1的生长。     

干细胞因子与卵泡发育的关系

干细胞因子(SCF)是酪氨酸激酶受体的配体，能够促进细胞的增殖和分化。卵巢组织可表达SCF。在卵泡发育过程中，SCF可诱导原始卵泡发育、启动生殖中心发生，同时促进卵泡和卵母细胞发育，与卵泡发育过程中类固醇激素的产生有一定的关系。表明SCF可能是重要的卵巢功能局部调节因子之一。     

干细胞因子及其受体在卵泡早期发育中的作用

目前认为卵泡早期发育是非促性腺激素依赖性过程。此期干细胞因子是启动原始卵泡发育、过渡为初级卵泡的必需因子,与受体c-Kit结合后激活c-Kit下游3-磷酸肌醇激酶等信号通路,调控卵母细胞生长、颗粒细胞和卵泡膜细胞分化、增殖及激素合成。干细胞因子与骨形态发生蛋白15、生长分化因子9等细胞因子相互影响,受促性腺激素调控,共同参与卵母细胞-颗粒细胞对话。     

KL与其受体Kit在不同发育阶段大鼠卵巢卵泡中的表达研究

目的:探讨KL(kitligand)与Kit蛋白在各年龄段大鼠卵巢组织的各种细胞中的表达。方法:分别取1d、2d、4d、8d、16d、3个月、12个月龄大鼠卵巢,制备组织切片,用免疫组织化学技术观察KL及Kit蛋白在各年龄段大鼠卵巢组织各种细胞中的表达状况。结果:在实验观察期,大鼠卵巢中KL在部分早期原始卵泡和原始卵泡的卵母细胞中表达,在初级卵泡以后各级卵泡的卵母细胞中均表达,而各级卵泡的颗粒细胞均不表达。在性成熟前,随着卵巢的发育KL逐渐出现在卵巢膜细胞和间质细胞中;性成熟后卵巢的间质细胞、卵泡膜细胞、卵巢膜上皮细胞以及黄体细胞均表达大量的KL蛋白。在实验观察的各年龄段大鼠卵巢中从早期原始卵泡到窦状卵泡的卵母细胞均表达Kit蛋白,但表达量随卵泡的发育逐渐减弱;随着卵巢的发育,Kit蛋白逐渐出现在卵巢的膜上皮细胞、卵泡膜细胞和间质细胞中;Kit也在黄体细胞中表达。在一些初级卵泡至窦状卵泡的少数颗粒细胞中也观察到Kit蛋白表达。结论:KL蛋白在各级卵泡的卵母细胞中表达,在颗粒细胞中不表达,KL与其受体Kit都在卵母细胞中表达,这些结果提示卵母细胞的生长可能受自身KL-Kit信号的调节。     

干细胞因子及其受体在卯泡早期发育中的作用

目前认为卵泡早期发育是非促性腺激素依赖性过程.此期干细胞因子是启动原始卵泡发育、过渡为初级卵泡的必需因子,与受体c-Kit结合后激活c-Kit下游3-磷酸肌醇激酶等信号通路,调控卵母细胞生长、颗粒细胞和卵泡膜细胞分化、增殖及激素合成.干细胞因子与骨形态发生蛋白15、生长分化因子9等细胞因子相互影响,受促性腺激素调控,共同参与卵母细胞-颗粒细胞对话.     

始基卵泡活化的分子机制研究进展

始基卵泡是哺乳动物整个生殖期限中各级卵泡及卵子发育的源头。始基卵泡的激活既需要卵母细胞内如PI3K-PTEN-AKT-FOXO3、mTORC1及p27Kip1-CDK体系等信号通路的正常激活,也需要一些卵母细胞特异性的分子如Nobox和Sohlh1等的参与,除此之外,始基卵泡周围的前颗粒细胞也发挥巨大作用,其首先在m TORC1等信号通路的调节下分化为立方形颗粒细胞,改变自身形态,启动始基卵泡活化,其次可通过分泌KITL与卵细胞表面KIT结合后激活调节卵细胞生长的关键通路——PI3K信号通路,最终导致卵母细胞生长及始基卵泡的正常激活。了解始基卵泡活化过程有助于阐明卵子发生的分子机制,为女性不孕提供新的治疗靶点。     

Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function

Evidence from mouse mutants indicates that the Kit gene encoding KIT, a receptor present on the oocyte and theca cells, and the Mgf gene encoding KIT LIGAND, the ligand of KIT, are important regulators of oogenesis and folliculogenesis. Recently, in vitro cultures of fetal gonads, of follicles and of oocytes have identified specific targets for the KIT-KIT LIGAND interaction. In fetal gonads, an anti-apoptotic effect of KIT-KIT LIGAND interactions on primordial germ cells, oogonia and oocytes has been demonstrated. In postnatal ovaries, the initiation of follicular growth from the primordial pool and progression beyond the primary follicle stage appear to involve KIT-KIT LIGAND interactions. During early folliculogenesis, KIT together with KIT LIGAND controls oocyte growth and theca cell differentiation, and protects preantral follicles from apoptosis. Formation of an antral cavity requires a functional KIT-KIT LIGAND system. In large antral follicles, the KIT-KIT LIGAND interaction modulates the ability of the oocyte to undergo cytoplasmic maturation and helps to maximize thecal androgen output. Hence, many steps of oogenesis and folliculogenesis appear to be, at least in part, controlled by paracrine interactions between these two proteins.     

Histological and biological assessment of vitrified ovarian follicles from large animals

Mammalian ovaries contain mixed populations of follicles at different developmental stages. A combination of vitrification and growth culture of ovarian follicles could provide the desired number of mature eggs from a preserved small amount of ovarian tissues. Secondary and primordial follicles from porcine and bovine ovaries were vitrified in solutions containing ethylene glycol, dimethyl sulfoxide and different concentrations of sucrose, and assessed via histological examination, viability staining, xenografting to immunodeficient mice, and in vitro culturing. Histological examination revealed the damage to oocytes and the damage to follicle components separately. The effects of sucrose in vitrification solutions on the follicles were different depending on the developmental stage of the follicle, oocyte size, cell type in the follicle, and species. Viability staining with fluorescein diacetate was useful to assess the damage to oocytes in secondary follicles. In the xenografts, vitrified bovine primordial and secondary follicles developed to the antral stage, and vitrified porcine primordial follicles developed to the secondary stage. Furthermore, bovine secondary follicles formed antrum-like structures in culture. These results suggest that histological examination and viability staining are valuable for assessing the direct effects of vitrification and warming conditions on follicles and oocytes, while xenografting and in vitro culturing can be useful for evaluating the developmental ability of vitrified follicles and oocytes.     

瘦素(leptin)对卵泡生长的启动作用及机制研究

目的:探讨瘦素(leptin)在原始卵泡启动生长中的作用及其机制。方法:利用2日龄大鼠离体卵巢体外培养模型,在Waymouth培养体系中分别添加瘦素、瘦素抑制剂(leptin antagonist)以及ERK1/2信号通路特异性抑制剂(PD98059),通过形态学观察原始卵泡启动生长的变化,Westernblotting检测卵泡ERK1/2、磷酸化-ERK1/2(P-ERK1/2)蛋白表达量的变化。结果:瘦素能够促进原始卵泡的启动生长(P<0.05),还可激活卵泡ERK1/2信号通路中的ERK1/2蛋白磷酸化(P<0.05);用瘦素抑制剂和PD98059可显著抑制瘦素促原始卵泡生长效应(P<0.05),亦可显著抑制瘦素对卵泡ERK1/2蛋白磷酸化(P<0.05)。结论:瘦素能够促进原始卵泡的启动生长,其作用机制可能与ERK1/2信号通路有关。     

新生小鼠原始卵泡成熟的诱导

目的:建立人工诱导新生小鼠原始卵泡成熟的方法。方法:30只新生小鼠卵巢同种异体移植于去势的10只成年雌小鼠肾被膜下,14d后分离窦前卵泡进行体外成熟培养。结果:卵泡成活率为50.6%,窦腔形成率为22.3%,卵母细胞成熟率为10.3%,MⅡ期卵母细胞平均直径为71.8±5.6μm。结论:本方法可以诱导新生小鼠原始卵泡发育,从而得到第二次减数分裂中期(MⅡ期)的卵母细胞。