大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的 建立稳定的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)体外培养模型,并对其生物学特性进行初步研究.方法 取Sprague-Dawley大鼠脑组织,通过匀浆、酶消化和梯度离心获得纯化的脑微血管段后,接种于涂布明胶的培养瓶进行原代培养;培养的细胞采用相差显微镜形态学观察、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定;采用跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance, TEER)检测单层细胞通透性;Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法测定细胞生长曲线.结果 细胞从贴壁的脑微血管段周围长出,呈短梭形和多角形,区域性单层生长,5～7 d细胞融合,经Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学检测证实培养的细胞是血管内皮细胞,原代培养的脑微血管内皮细胞表现出很强的屏障特性,随着传代次数的增加脑微血管内皮细胞的跨内皮阻抗减弱.结论 提示该方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养,原代培养的脑微血管内皮细胞是研究脑部微血管和血脑屏障的可靠技术手段.     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础.方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定.结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,透射电镜可见Weibel-Palade小体.第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性.结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞.     

大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的 探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障(BTB)模型提供材料.方法 采集出生3～5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达.结果 体外培养2h时脑微血管段贴壁,12～48 h见圆形生发中心形成,2～3d单层内皮细胞自生发中心长出,4～5 d见较大单层内皮细胞团,5～7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈“铺路石”样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示“铺路石”样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性.结论 本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究.     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。方法用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养,用光镜及免疫组织化学检测进行鉴定。结果分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养5～7d左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学测定阳性。结论该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。     

豚鼠内耳微血管内皮细胞的跨细胞电阻

目的　研究豚鼠内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻的动态变化及峰值大小。方法　①胶原酶消化法分离培养豚鼠内耳及脑微血管内皮细胞 ,免疫组化法进行鉴定 ;②建立起内皮细胞通透性的体外模型 ,研究该模型下内耳内皮细胞的跨细胞电阻 ,并与脑及肺内皮细胞进行比较。结果　①培养细胞致密融合时具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观 ,与肺内皮细胞株的形态一致 ,经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子 ,95 %以上的培养细胞的胞浆中呈棕黄色阳性反应 ;②三种内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻值呈动态变化过程 ,以 5× 10 4 cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,内耳、脑及肺三种内皮细胞的跨细胞电阻峰值大小分别为 (118 9± 18 5 )Ω cm2 ,(2 44 7± 46 9)Ω cm2 ,(4 6 6± 5 9)Ω cm( n =6) ,三者相差非常显著 (P <0 0 0 1)。结论　内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻峰值小于脑内皮而大于肺内皮细胞 ,证明了三者通透性的差别。     

紧密连接蛋白occludin和ZO-1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达

目的:研究紧密连接蛋白occludin,ZO-1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达.方法:成年健康杂色豚鼠,耳廓反射灵敏,分别取耳蜗、脑、肺三组组织,免疫组织化学法及Western Blot研究紧密连接蛋白occludin,ZO-1在耳蜗外侧壁血管纹中的表达,以脑组、肺组为阳性对照.结果:光镜下可见豚鼠耳蜗外侧壁血管纹毛细血管内皮细胞等边缘细胞中均强阳性颗粒表达,脑组、肺组毛细血管内皮细胞内壁也均有明显阳性表达;Western Blot下occludin, ZO-1在耳蜗组中高表达,并且明显高于脑组与肺组.结论:occludin,ZO-1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹紧密连接中的高浓度表达,与维持血迷路屏障结构、功能密切相关.     

体外血脑屏障模型的建立与鉴定

目的应用原代分离培养BALB／c小鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMVEC）建立体外血脑屏障模型，探讨跨血脑屏障（blood brain barrier，BBB）电阻与屏障渗透功能的动态关系以及最佳构建条件。方法用酶消化、机械分离结合密度离心的方法得到原代BALB／c小鼠脑血管内皮细胞，通过培养在具有特殊质材和孔径的Transwell小室上建立BBB体外实验模型，采用倒置显微镜、电镜观察细胞形态结构和生长规律，紧密连接ZO-1蛋白免疫组化检测，比较血脑屏障形成前后膜两侧电阻动态变化与1H葡萄糖通透性的关系等方法，探讨血脑屏障模型的建立及生长特性。结果BMVEC培养至汇合后具有典型的“铺路石”样外观；扫描电镜显示细胞形成致密单层，透射电镜、ZO-1蛋白免疫组化证实细胞问形成光滑、连续、高密度的紧密连接；1H葡萄糖的通透量与实时电阻呈负相关，内皮细胞电阻随着通透性的增加而降低，通透率最低时跨细胞电阻为（346&#177;10）Ω／cm2。结论建立的BBB体外模型在形态学、电阻和通透性方面具备了BBB的基本特性。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形,7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性,且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型,也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

牙龈卟啉单胞菌在体外可破坏脐静脉内皮屏障功能：基于下调ZO-1、occludin和VE-cadherin的表达

目的 通过体外实验探讨牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）破坏内皮屏障功能的分子机制。方法 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）体外培养形成屏障后,使用感染复数（MOI）100的P. gingivals感染细胞,对照组为未感染P. gingivals的HUVECs;通过跨膜电阻值（TEER）,异硫氰酸荧光素（FITC）-右旋糖酐通透性实验和细菌易位实验来评估内皮屏障功能;并使用实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）和Western blot实验检测P. gingivals对构成内皮屏障结构的主要蛋白紧密连接蛋白1(ZO-1),occludin和VE-cadherin表达的影响。结果 HUVECs在接种培养后第5天,其跨膜电阻值趋于稳定,体外内皮屏障形成。与对照组相比,感染P. gingivals后0.5 h,内皮屏障功能即会发生改变,并且随着感染时间的延长,屏障功能障碍更加显著,主要表现为：跨膜电阻值下降、40 000/70 000 FITC-Dextran通透性上升以及易位细菌的数量增加;MTT结果显示P. gingivals对HUVECs的增殖能力没有影响（P>0...     

关于Caco-2细胞构建肠粘膜屏障模型的相关研究

目的 通过用Caco-2细胞的体外培养,建立肠粘膜屏障的模型。方法 通过对Caco-2细胞在体外transwell小室中连续培养21 d,并对培养的细胞进行形态学观察、跨膜电阻测定、inulin-FITC通透率测定,评估肠屏障模型是否构建成功。结果 通过体外连续培养Caco-2细胞形成了致密单层,可见细胞层单层排列,相互融合,边界清晰,细胞间紧密连接清晰可以见,21 d TER值为496.32±6.02(Ω·cm2),inulin-FITC的通透率<0.5%。结论通过细胞形态学观察,跨膜电阻测定及inulin-FITC的通透率显示Caco-2细胞体外构建肠屏障模型成功,此模型对于相关疾病的研究具有一定意义。     

经会阴磁共振超声三维定位靶向前列腺穿刺技术对既往穿刺阴性患者的初步应用

目的 验证经会阴磁共振超声三维矩阵定位靶向穿刺技术对提高前列腺穿刺活检阳性率的价值.方法 选取第二军医大学长海医院泌尿外科2015年2月至6月行经会阴磁共振超声三维定位靶向前列腺穿刺活检十系统性前列腺穿刺活检的患者共15例.15例患者既往有至少1次阴性穿刺的病史,有行再次前列腺穿刺活检的指证,且穿刺前多参数磁共振检查提示有可疑发生前列腺癌的位点,前列腺影像报告和数据系统(PI-RADS)评分4～5分,根据磁共振图像对前列腺腺体中的可疑位点进行三维定位(X、y、Z轴3个坐标).全麻后,在经直肠超声引导下行系统性前列腺穿刺活检,后根据三维定位的坐标在经直肠超声图像中进行定位,并根据定位的位置行超声引导下的经会阴前列腺靶向穿刺活检.结果 15例患者中有14例确诊为前列腺癌(93.3％),单纯靶向穿刺活检阳性13例(86.7％),单纯系统性穿刺活检阳性6例(40.0％),系统性穿刺活检阳性而靶向穿刺活检阴性1例(6.7％),靶向穿刺活检阳性而系统性穿刺活检阴性8例(53.3％),系统性穿刺活检和靶向穿刺活检均为阴性1例(6.7％).两种穿刺方法阳性率差异有统计学意义(P=0.002).结论 经会阴磁共振超声三维定位靶向前列腺穿刺技术可以准确定位并靶向穿刺磁共振显示的可疑位点,对经直肠系统性穿刺活检易漏诊的位置具有较好的诊断效能,但其确切的效果仍需大样本的病例验证.     

前列腺增生患者前列腺特异性抗原测定

目的:测定前列腺增生(BPH)患者血清总前列腺特异性抗原(tPSA),为临床诊断前列腺癌提供参考。方法:用酶联免疫法检测280例非前列腺癌查体男性的血清tPSA,57例非急诊入院BPH患者以及23例BPH并发急性尿潴留(AUR)患者的血清tPSA值。结果:非急诊入院BPH患者血清tPSA(3.50±1.45)μg/L,BPH并发AUR患者血清tPSA(16.6±3.56)μg/L与非前列腺癌男性查体人群血清tPSA(1.15±0.95)μg/L之间差异均有统计学意义(P<0.05)。非急诊入院BPH患者与BPH并发AUR患者血清tPSA之间差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论:BPH,尤其BPH并发AUR患者血清tPSA显著升高,故对血清tPSA大于4.0μg/L而准备行前列腺穿刺的患者应审慎。     

SA、F/TPSA及PSAD在前列腺癌诊断中的作用

目的 :探讨血清前列腺特异抗原 (PSA) ,血清总PSA及游离PSA比值 (F/TPSA)及前列腺特异性抗原密度(PSAD)在前列腺癌诊断中的作用。方法 :对 5 1例前列腺癌患者及 14 5例良性前列腺增生症患者PSA、F/TPSA及PSAD值的差异进行分析、比较。结果 :前列腺癌组血清PSA及PSAD高于良性前列腺增生组 ;而F/TPSA值低于良性前列腺增生组 ,差异均有显著性。结论 :PSA >4ng·ml-1作为筛选前列腺癌的临界值存在一定缺陷 ;当PSA <10ng·ml-1,F/T值有助于鉴别前列腺癌和良性前列腺增生 ;而PSAD对于筛选前列腺活检病例亦有一定价值。     

前列腺干细胞抗原和前列腺特异性抗原在前列腺组织中的表达和意义

目的 比较前列腺干细胞抗原（PSCA）和前列腺特异性抗原（PSA）在不同前列腺病变组织中的表达差异;比较在不同的Gleason评分的前列腺癌（PCA）中PSCA的表达差异，及对前列腺癌的诊断意义。方法 采用SP二步免疫组织化学染色方法，对51例PCA、16例前列腺上皮内瘤（PIN）及18例前列腺良性增生（BPH）组织进行染色、观察及统计分析。结果 PSCA及PSA在前列腺癌、前列腺上皮内瘤、前列腺良性增生组织中的表达差异均具有显著性（P〈0．05）；两者在前列腺癌组织中的表达差异无显著性意义（P〉0．05）。结论 PSCA有可能成为前列腺癌分子病理学诊断的新型瘤标，在前列腺癌的免疫治疗方面的应用可能成为新的研究热点。     

前列腺体积和前列腺特异性抗原密度与前列腺癌检出率的关系

【目的】 探讨经直肠超声引导的前列腺穿刺中前列腺体积(PV)、前列腺特异性抗原密度(PSAD)与前列腺癌(Pca)检出率之间的关系。 【方法】 分析2008年7月至2011年5月间在我院行前列腺穿刺262例患者的临床资料,了解PSAD、PV与Pca检出率之间的关系。所有穿刺病例在行穿刺术前均行前列腺特异性抗原(PSA)、直肠指诊(DRE)及经直肠超声(TRUS)扫描测量PV水平并计算得出前列腺特异性抗原密度(PSAD)。 【结果】在总计262例前列腺穿刺的病例中,有101例经病理确诊为Pca,检出率为38.55%。PV分段检出率:PV小于20 mL的Pca检出率为53.33%(8/15);PV在20 mL至30 mL之间检出率为72.73%(24/33);PV在30 mL至50 mL之间的检出率为36.26%(33/91);PV超过50 mL的检出率为29.27%(36/123)。以PSAD = 0.15 ng/mL2为界点,诊断Pca的敏感度47%,特异度90%。【结论】随着PV的增大, Pca的检出率会逐渐下降,所以根据PV大小合理确定穿刺针数,可以提高Pca的检出率,减少漏诊的可能。     

血清c-PSA及 C/T在提高前列腺癌诊断特异性中的探讨

目的 研究复合前列腺特异性抗原(c-PSA)及相关指标在鉴别诊断前列腺癌和良性前列腺增生中的应用价值,提高前列腺癌诊断特异性.方法 分析了70例男性,经B超、病理诊断证实18例为前列腺癌(Pca),27例为良性前列腺增生(BPH),25例为正常对照组.Bayer ACS:180化学发光法测得c-PSA、t-PSA,计算c-PSA/t-PSA值(C/T).结果 t检验比较Pca和BPH组的c-PSA、t-PSA、C/T和Age值,前两者有显著性差异(P《0.01),后两者无显著性差异(P》0.05).分别计算Pca和BPH组的c-PSA、t-PSA的直线相关系数r,Pca组r=0.981 2, Pca组回归方程为c-PSA=0.935 4×t-PSA-2.91, 高度相关.BPH组r=0.410 9.在100%敏感性时,c-PSA 3.75 μg/L、t-PSA 4.0 μg/L、C/T=0.65、c-PSA 7.5 μg/L加(C/T=0.65)的特异性分别为42.3%、38.5%、36.5%、75.0%.结论 前列腺癌比BPH的c-PSA 和t-PSA相关度高.在保持灵敏度100%时,若结合c-PSA 7.5 μg/L加(C/T=0.65)指标,将明显提高特异性到75.0%.     

前列腺特异性抗原比值在前列腺癌诊断灰区的临床意义

目的:探讨游离前列腺特异性抗原(fPSA)与总前列腺特异性抗原(tPSA)比值(f/t)在tPSA为4~10ng/ml时对前列腺癌诊断的意义。方法:对83例血清tPSA为4~10ng/ml的前列腺增生和前列腺癌患者进行回顾行分析。均经由B超引导下行前列腺穿刺组织学验证。酶免微粒子捕捉法测定血清中tPSA与fPSA。结果:本组中32例(38%)为前列腺癌,51例(62%)为前列腺增生。前列腺癌及前列腺增生组tPSA的平均值分别为6.63ng/ml和6.99ng/ml,两者间无显著性差异(P>0.05);前列腺癌患者f/t值显著低于前列腺增生患者(0.16vs0.23,P<0.01)。以f/t比值0.16作为前列腺癌的诊断临界值时,其敏感性及特异性分别为71%、78%。结论:f/t值对前列腺癌及前列腺增生的鉴别有重要意义,以0.16作为诊断临界值准确率较高。     

血清前列腺特异性抗原水平正常的前列腺癌6例及文献复习

目的:探讨在血清前列腺特异抗原(PSA)水平正常时,如何避免前列腺癌的漏诊。方法:对203例血清PSA水平正常的前列腺增生患者在经尿道前列腺电切术后,病理检查中发现的6例前列腺癌患者临床资料进行回顾分析。结果:6例前列腺癌患者普通超声检查和肛门指诊未发现前列腺癌的征象,均为初次就诊入院,6例患者中病理检查有1例差(未)分化和1例中分化前列腺癌,病情发展迅速,短期内死亡。其余4例病理检查为高分化前列腺癌的患者目前仍存活。结论:早期偶发前列腺癌和进展型前列腺癌可能出现血清PSA正常,有发生漏诊的可能。应综合超声、磁共振,特别是经直肠前列腺超声检查和前列腺特异抗原速率来考虑,对疑似患前列腺癌的患者进行前列腺穿刺病检,以提高前列腺癌的早期诊断率。     

血清PSA水平在前列腺穿刺患者中的临床意义

目的 探讨血清前列腺特异性抗原(PSA)在前列腺穿刺患者中的临床价值.方法 收集该院2013年1月至2014年12月361例行前列腺穿刺患者的血清PSA检测、穿刺病理检查及全身骨显像等资料,依据不同血清PSA水平将其分为A组(PSA≤4.0 ng/mL)、B组(4.0 ng/mL＜PSA≤10.0 ng/mL)、C组(10 ng/mL＜PSA≤20 ng/mL)、D组(PSA＞20.0 ng/mL),比较各组前列腺穿刺阳性率,以及不同PSA水平前列腺穿刺阳性患者的骨转移发生率.结果 A、B、C、D4组患者前列腺穿刺阳性率分别为9.09％、9.84％、26.21％、74.73％,其中A、B组前列腺穿刺阳性率与D组比较,B组与C组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).在B组中,游离态PSA/总PSA比值(F/T)≤0.16与F/T＞0.16的患者穿刺阳性率比较,差异无统计学意义(P＞0.05).前列腺穿刺阳性患者中,PSA＞ 20 ng/mL者骨转移发生率高于PSA≤20 ng/mL者,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 血清PSA水平越高,前列腺穿刺阳性率越高;初诊前列腺癌患者血清PSA＞20 ng/mL建议行全身骨显像检查.     

PSA?F/T值与PSAD在前列腺穿刺活检中诊断价值的探讨

目的:探讨前列腺特异抗原(PSA)、游离PSA/总PSA(F/T)比值及前列腺特异抗原密度(PSAD)在前列腺穿刺活检中的诊断价值。方法:选取2006年1月～2008年12月经直肠超声引导下前列腺穿刺活检患者285例,检测血清总PSA、游离PSA,计算F/T及PSAD,探讨穿刺诊断前列腺癌(PCa)最佳的PSA、F/T值与PSAD值。结果:以PSA>15ng/ml为临界值,PSA诊断前列腺癌的灵敏度为70.0%,特异度为68.5%,阳性预测值为58.6%;在PSA<15ng/ml区域,良性前列腺增生(BPH)组与PCa组间PSA差别无显著性(t=0.018,P>0.05),此时两组间F/T值及PSAD比较,差别均有显著统计学意义(t=4.137、3.158,P<0.01)。F/T值取0.16,PSAD取0.35ng/(ml·cm3)时,F/T值及PSAD诊断PCa的灵敏度、特异度、阳性预测值均较高。结论:PSA>15ng/ml时高度怀疑前列腺癌;在PSA<15ng/ml时联合应用F/T值和(或)PSAD可以明显提高前列腺癌的穿刺检出率。