利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株

目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T细胞, 为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点靶向设计4对向导RNA （sgRNA）,构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的 细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1（T7E1）酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测 G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果成功构建基于G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的Cas9-sgRNA外 源PX458 质粒,T7E1 酶切检测四对sgRNA 的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除G6PD 基因 c.392G>T（p.131G>V）突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生 素K3诱导细胞死亡增加。结论本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T稳定细胞模型, 为后期研究基因的修复奠定了基础。     

CRISPR/Cas9系统构建ROCK2基因敲除肺癌细胞系

目的 利用CRISPR/Cas9编辑系统对人肺癌细胞系A549、H460细胞中Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(ROCK2)基因进行稳定敲除,并对其敲除效果进行验证。初步探讨ROCK2基因敲除肺癌细胞株的细胞水平上的功能改变。方法 利用Rock-2 CRISPR 质粒和Rock-2 HDR 质粒转染构建A549、H460 ROCK2基因敲除稳定细胞株。蛋白质印迹法验证敲除效果、用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ROCK2基因的mRNA表达水平。平板克隆形成实验、MTT法检测各细胞株的增殖能力。结果 A549、H460肺癌细胞中ROCK2基因稳定敲除株构建成功。与原始细胞株相比,ROCK2敲除株细胞中的蛋白表达水平完全缺失,细胞内的mRNA表达水平显著下降,而且能降低A549、H460肺癌细胞的增殖能力。结论 利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得ROCK2基因敲除的肺癌细胞系,为进一步研究ROCK2对肺癌生长的影响奠定基础。     

CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用研究进展

常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白9（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR）/（CRISPR-associatedproteins9,Cas9）改造的第3代人工核酸内切酶,因其简单、高效等优点,已成为一种热门的基因编辑工具。近年来一些研究成功应用CRISPR/Cas9系统在体内外进行相关疾病基因的靶向修饰,为基因编辑技术在临床的应用奠定了基础,但其脱靶效应、导入方式、编辑效率等仍需改进。本文将对CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用进展作一综述。     

利用CRISPR/Cas9技术高效构建巴马小型猪F9基因敲除细胞系

目的：利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维（porcine fetal fibroblast,PFF）细胞系,为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法：首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析,模拟并分析人和猪FⅨ二级、三级结构的相似性;其次选取猪F9基因的第2外显子为敲除靶点,利用CRISPR在线靶点设计工具（http：//www.e?crisp.org/E?CRISP/designcrispr.html）设计并合成单链向导 RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为骨架构建打靶载体,同G418抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的PFF中,经药物G418筛选获得抗性单细胞克隆,测序并鉴定其基因型。结果：生物信息学分析表明人和猪的F9基因具有较近的遗传距离,FⅨ的氨基酸序列相似值为83.33%,三维结构的均方根偏差（root mean square deviation,RMSD）值为0.149。成功构建打靶载体并转染PFF细胞,药筛后共获得55个单细胞克隆,经过测序显示有25个单细胞克隆的F9基因发生突变,计算敲除率为45.5%。结论：人和猪F9基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA 表达载体可以高效编辑PFF中的F9 基因。最终获取F9基因敲除的单细胞克隆,为构建乙型血友病巴马小型猪模型奠定了重要的前期工作基础。     

利用CRISPR/Cas9 系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。方法:设计针对敲除CBX2的short guide RNA（sgRNA）,并克隆到载体PX459中。将测序正确的重组质粒转染到A549细胞中,利用嘌呤霉素筛选转染阳性细胞并分离得到5个单克隆细胞系,通过Western blot方法检测构建的细胞系中CBX2蛋白表达情况。结果:成功构建了靶向CBX2的CRISPR/Cas9重组质粒,筛选出的5个单克隆细胞系中CBX2蛋白表达水平均显著下降。结论:成功利用CRISPR/Cas9 系统构建了稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。     

运用CRISPR/Cas9技术构建PCSK9点突变家兔模型

目的：运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）点突变家兔模型。方法：根据PubMed基因蛋白数据对人和兔的PCSK9蛋白功能区进行Blast分析,发现人PCSK9基因的386S（丝氨酸）氨基酸功能区与兔PCSK9基因的485S同源。根据家兔PCSK9基因的485S对应的碱基替换位置及序列分析结果设计3条单链向导RNA和1条单链寡核苷酸供体模板。将合成的单链向导RNA、Cas9 mRNA和单链寡核苷酸供体共同注射入家兔受精卵细胞质内并将胚胎移植入待孕母兔体内。对获得的F0代兔进行PCR、TA克隆、脱靶检测以鉴定PCSK9^S386A是否突变成功。利用获得的PCSK9^S386A基因点突变家兔进行繁殖,扩大群体。结果：共获得15只F0代兔,其中1只为PCSK9^S386A点突变纯合子,2只为PCSK9^S386A点突变杂合子,且该突变可以稳定遗传。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功构建了PCSK9^S386A点突变家兔模型,为探究PCSK9功能减弱的分子机制,开发可靠、有效的诊断和治疗措施提供了良好的动物模型。     

利用CRISPR/Cas9系统建立斑马鱼Morn3基因敲除模型

目的：采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9对斑马鱼的Morn3基因进行编辑,以期建立Morn3基因敲除斑马鱼模型。方法：针对斑马鱼Morn3基因用生物信息学选取靶位点,构建gRNA表达载体并体外转录,将gRNA和Cas9mRNA混合物显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中,24~48 h提取基因组DNA,PCR扩增出目的片段,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定编辑效果。结果：取3个靶位点（M1、M2、M3）进行试验,选择gRNA浓度较高的M2和M3进行注射。限制性酶切及测序的结果显示M3已产生基因编辑效应。结论：本研究通过CRISPR/Cas9系统成功获得Morn3基因编辑的突变体,为进一步探讨Morn3基因的作用提供研究基础。     

CRISPR/Cas9系统在现代生物学研究和临床试验中的应用

 规律成簇间隔短回文重复结构(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protien 9,Cas9)系统在生物医学研究中被广泛应用于基因编辑及探索基因的功能。这种基因编辑技术越来越多地运用在人类疾病的治疗中,包括巴斯综合征、杜氏肌萎缩症、血友病、地中海贫血和囊性纤维化。CRISPR/Cas 9基因编辑系统可以在体外细胞实验和体内动物实验上修复突变的DNA序列,也能改变 CCR5、PD-1/L1、CAR-T等基因序列,用于控制 HIV病毒的入侵及提高肿瘤免疫治疗的疗效。该技术还被运用于诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)分化,形成某些具有功能的器官用于器官移植。本文综述了CRISPR/Cas 9系统的来源、结构和作用原理,以及其在现代生物学研究和基因治疗领域的应用。     

CRISPR/Cas9递送系统的研究现状及应用进展

针对CRISPR/Cas9系统在DNA、RNA和蛋白3种水平的递送形式,本文着重介绍了CRISPR/Cas9系统的病毒载体和非病毒载体的研究现状和CRISPR/Cas9系统递送的新策略,及其在生物医学领域和基因相关疾病治疗的应用进展。通过对CRISPR/Cas9系统递送和基因治疗策略进行总结与阐述,为创新药物的发现和基因治疗的开发提供新思路。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠的实验研究

目的：应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法：根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果：成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10bp和11bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论：利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株

目的:利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除HeLa细胞中SND1基因,构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。方法:设计一对特异性识别SND1基因第二个启动子的上下游sgRNA,以PX462质粒为载体,构建出一对重组真核表达质粒。酶切和测序鉴定后,将一对重组质粒共同转染进入HeLa细胞中,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,挑取单克隆细胞进行培养。最后用Western Blot鉴定敲除效果。结果:sgRNA正确插入到PX462质粒载体中,转染并筛选单克隆后的细胞中没有SND1蛋白的表达。结论:成功构建出HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。     

β位淀粉样前体蛋白裂解酶2基因敲除斑马鱼动物模型的构建及其初步应用

目的 构建β位淀粉样前体蛋白裂解酶2(β-site APP-cleaving enzyme 2,BACE2)基因敲除斑马鱼动物模型并及其初步探索其应用。方法 运用CRISPR/Cas9技术,在斑马鱼中设计针对靶点的gRNA,使之诱导靶点突变,经测序鉴定得到突变体。结果 BACE2纯合突变体在早期部分无法存活,RT-PCR结果显示BACE2基因在斑马鱼的早期发育中持续表达。结论 BACE2基因敲除的斑马鱼动物模型将为进一步研究BACE2基因在斑马鱼胰腺发育中的作用和针对糖尿病的药物靶点筛选提供有效工具。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

目的 应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法 根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果 成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论 利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除HeLa细胞中YAF2基因

目的 利用CRISPR/Cas9技术建立YAF2（YY1 associated factor 2）基因敲除的宫颈癌HeLa细胞株,用于YAF2基因在宫颈癌细胞中分子功能的研究。方法 首先利用CRISPR/Cas9序列设计网站,设计两对靶向YAF2基因第2外显子不同位点的向导RNA（single-guide RNA,sgRNA）。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,分别克隆至质粒pX335中,测序确认插入片段正确的克隆。先用一对重组载体转染HeLa细胞,7天后,再用另一对转染HeLa细胞,第2对转染3天后,取培养细胞的2/3提取基因组DNA,对敲除位点附近的片段进行PCR扩增后通过DNA测序对敲除效率进行分析,剩余细胞在96孔平板上通过有限稀释法筛选YAF2敲除的细胞株。用蛋白质免疫印迹实验初步鉴定YAF2蛋白质表达缺失的细胞克隆,提取其基因组DNA,对敲除位点附近的序列进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pGEM-T easy载体,通过DNA测序确认YAF2基因纯合敲除的细胞株。结果 成功构建两对针对人YAF2基因第二外显子的pX335-sgRNA质粒;PCR产物测序证明两对重组载体均有YAF2基因敲除活性;得到2株YAF2敲除的HeLa细胞株。结论 利用CRISPR/Cas9技术在HeLa细胞中成功敲除YAF2基因,为在HeLa细胞中研究YAF2的分子功能奠定基础。