类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统BPSS1395蛋白表达及其抗体制备与鉴定

目的 重组表达类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1395,利用其抗体检测该蛋白在细菌中的分布.方法 以pET-22b为表达系统,采用DNA重组技术在大肠杆菌中表达BPSS1395蛋白;用纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,Western blot及ELISA法鉴定其免疫学性质;以制备的抗血清Western blot分析该蛋白的亚细胞定位.结果 从类鼻疽杆菌BPC006株基因组DNA中PCR得到了BPSS1395目的基因,并成功构建pET-22b-BPSS1395重组质粒,转化到E.coli宿主菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达、纯化得到了相对分子质量为32×103的高纯度BPSS1395蛋白,制备的兔抗血清ELISA效价均高达1:1280000,并能与目的蛋白发生特异性抗原抗体反应.亚细胞分离后BPSS1395在类鼻疽杆菌中主要定位于细胞质.结论 重组表达了具有生物活性的BPSS1395蛋白,制备了其特异性多克隆抗体,证明了该蛋白定位于细胞质.     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的鲍曼不动杆菌杆菌外膜蛋白Caro(-binding protein)融合蛋白并制备抗Caro多克隆抗体,为研究临床鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制奠定基础.方法 构建pET23d-CarO重组表达质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His-CarO融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western印迹检测多克隆抗体的特异性.结果 在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-CarO融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫新西兰大白兔,获得了高特异性的抗CarO抗血清.结论 成功构建pET23d-CarO原核表达质粒,表达并纯化出目标蛋白,制备出高特异性的多克隆抗体.     

含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定

目的:在大肠埃希菌中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)vIL-6基因,并进一步纯化和鉴定表达蛋白.方法:以本实验室已构建的重组质粒pGEX-6p-1-vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,将PCR产物克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建vIL-6的重组原核表达质粒pET-32a(+)-vIL-6.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物通过镍亲和层析柱纯化并经蛋白质印迹法鉴定.结果:限制性内切酶检测和基因测序证实,成功构建了含有vIL-6基因的原核表达载体.蛋白质印迹法结果显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中His-Tag融合蛋白得到了表达,亲和层析法纯化后获得了相对分子质量为43 000的vIL-6融合蛋白.结论:重组质粒pET-32a(+) -vIL-6能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

类鼻疽伯克霍尔德菌BPSL1549基因敲除株的构建及鉴定

目的 构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株[BP(△BPSL1549)],建立有效的类鼻疽菌毒力基因敲除平台.方法 设计引物扩增类鼻疽菌BPSL1549基因上下游同源臂,连接至pK18 mobSacB自杀质粒上,通过大肠杆菌S17-1 λpir以接合方式将其转入类鼻疽菌中.利用同源重组原理替换野生株中的BPSL1549基因,经过蔗糖筛选靶标基因敲除株,并采用PCR、Western blot检测方法鉴定敲除株,利用动物模型评价敲除株表型变化.结果 BP(△BPSL1549)菌株与野生株的BPSL1549基因两侧同源臂片段PCR产物相比缺少600 bp,Western blot检测敲除株不表达BPSL1549基因编码蛋白,成功构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株.动物实验证实敲除株相比野生株毒力显著降低(P＜0.05).结论 利用同源重组原理成功构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株,完善了类鼻疽菌敲除平台和评价体系.     

人β-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

目的:克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法:以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-β和表皮生长因子基因,分别构建β-防御素-3(β-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到β-defensin-3 DNA序列的3'端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果,最后以Western blot对其进行特异性鉴定。结果:成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294 bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28 kDa左右的目的蛋白条带。Western blot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、β-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论:成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础。     

截短人胱硫醚β-合成酶的可溶性表达、纯化及活性鉴定

目的 构建截短人胱硫醚β-合成酶(T-hCBS)基因原核表达载体,得到可溶性的T-hCBS蛋白,为同型半胱氨酸检测试剂盒的开发打下基础.方法 通过优化T-hCBS基因,克隆并构建重组表达质粒pET15b/T-hCBS,转化大肠埃希菌BL21.使用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,再通过HiTrap脱盐柱脱盐,采用比色法检测目的 蛋白活性.结果 重组蛋白在大肠埃希菌中可以高效表达,产量为44 mg/L,比活约1 100 U/mg.15%SDS-PAGE 显示其相对分子质量为45 kD,与预计大小一致.表达菌体超声破碎后上清及纯化的蛋白溶液均呈现红色.结论 成功克隆和表达了T-hCBS蛋白,并得到高产高酶活性的可溶性蛋白,对同型半胱氨酸检测试剂盒的开发有一定的潜在应用价值.     

人心肌肌钙蛋白I基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的从人心肌组织中克隆出心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnI）的cDNA。构建成表达重组体导入特定宿主菌，以期大量表达并获得高纯度的心肌肌钙蛋白Ⅰ，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot进行鉴定。结果成功获取了人cTnI的cDNA，并在大肠埃希菌中高效表达。经Ni—NTA树脂纯化后获得的产物可与其特异性单克隆抗体反应。结论成功克隆了cTnI基因，构建的重组体能够在大肠埃希菌中高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。     

表达蝎毒素AaIT或苏云金杆菌毒素Cyt2Ba的大肠埃希菌杀蚊幼活性及增效剂型测试

目的 构建表达蝎毒素AaIT或苏云金杆菌毒素Cyt2Ba的大肠埃希菌,检测重组菌对致倦库蚊和白纹伊蚊II龄幼虫的毒力,并测试不同剂型的增效作用.方法 分别将AaIT和Cyt2Ba编码基因克隆于pET28a(+)质粒上,并将重组质粒分别转化BL21 E.coli获得分别表达AaIT和Cyt2Ba的工程菌株,经IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白的表达;测试不同浓度工程菌菌液对于蚊幼虫的杀灭效果;并将有效的工程菌制成干粉剂,检测其干粉末及其配剂对蚊幼虫的杀灭效果.结果 AaIT和Cyt2Ba重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,但AaIT重组蛋白对蚊幼虫不具有毒性.表达Cyt2Ba重组蛋白的工程菌菌液对白纹伊蚊和致倦库蚊幼虫均具有明显的杀灭作用,48 h的LC50分别为3.00×106和1.25×107 cells/mL,其中对白纹伊蚊幼虫的杀灭效果要显著优于对致倦库蚊幼虫的杀灭效果(P<0.001),并且表达Cyt2Ba重组蛋白的工程菌干粉末及其配剂均具有较好的杀蚊幼虫效果.当该工程菌干粉末与干酵母粉、小麦粉和白胡椒粉分别按4:1、1:1和1:4比例制成配剂处理蚊幼虫48 h后,结果显示当质量比为1:1时,配剂杀蚊幼效果显著提高(P=0.044),并且白胡椒粉末配剂效果要显著好于干酵母粉和小麦粉配剂(P=0.002).结论 表达Cyt2Ba的重组大肠埃希菌对蚊幼虫具有较好的杀灭作用,合适配剂的使用可以增强其在蚊虫防制中的效果.     

人膀胱癌组织Kringle 5基因的克隆、优化表达、纯化及活性鉴定

目的 构建能够表达分泌性人纤溶酶原krinle 5(K5)的大肠杆菌工程菌,优化表达并鉴定其抗人血管内皮细胞(ECV)304的生物活性. 方法 从人膀胱癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增K5基因,构建原核表达载体pGEX-5X-1/K5,运用工程菌表达蛋白.带谷胱甘肽(GST)标签琼脂糖4B亲和柱层析、纯化蛋白,CellTiter 96 AQueous细胞增殖检测法(MTS)检测K5对ECV304增殖影响.结果 PCR扩增得到282 bp片段,并成功插入pGEX-5X-1质粒,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下工程菌表达了特异性融合蛋白,经凝血酶酶切后得到分子量约为12 kD的K5蛋白;K5蛋白能特异性抑制ECV304增殖,抑制率最高蛋白浓度为5 ng/L. 结论 含重组质粒pGEX-5X-1/K5大肠杆菌表达产物量多且易纯化,为包括肿瘤在内的病理性血管增生疾病抗血管生成药物开发做了积极的尝试.     

小鼠CD36基因片段合成、表达及GST融合蛋白的表达和纯化

目的获取小鼠CD36基因片段,并高效表达和纯化GST-CD36融合蛋白。方法设计合成CD36的基因功能片段,测序后,通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2,构建重组表达载体,并导入E.coli BL21宿主菌中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组的GST融合蛋白,亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果获得小鼠CD36基因片段,测序结果与GenBank的基因序列一致,重组GST融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子量28.5kDa处,出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论合成小鼠CD36基因片段,并在E.coli BL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST-CD36融合蛋白。     

融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化

目的 构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1α PAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化.方法 分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLyss内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(NiNTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化.结果 成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白.结论 含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础.     

小鼠MIF在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：获得足够量的高纯度小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)重组蛋白。方法：酶切重组克隆质粒pMD18-MIF，将片段插入原核表达载体pQE31，构建相应的重组表达质粒pQE31-MIF，将此质粒转化大肠杆菌M15，得到转化子。经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Western blotting免疫印迹分析，并用Ni—NTA凝胶进行纯化。结果：MIF基因重组体构建成功，克隆的目的基因片段在M15中产生的融合表达产物在Western blotting检测中具有与抗MIF单克隆抗体发生特异性结合反应的特性。得到了纯化的目的蛋白。结论：MIF基因片段可在大肠杆菌中有效表达，表达产物可以与抗MIF单克隆抗体发生特异性结合反应，并得到纯化的MIF。     

类鼻疽杆菌毒素分子BLF1的重组表达及生物学活性

目的 重组、表达类鼻疽杆菌毒素BLF1并研究其生物学活性.方法 运用DNA重组技术,以pGEX为表达系统在大肠杆菌中表达BLF1蛋白;以纯化重组蛋白rBLF1免疫新西兰大白兔,获得抗rBLF1血清,Western blot及ELISA鉴定抗血清;不同浓度rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,观察小鼠生存率;A549细胞模型中,通过CCK-8实验研究目的蛋白的细胞毒性效应及抗体阻断作用.结果 从类鼻疽杆菌基因组DNA中PCR得到了BLF1目的基因,连接到pGEX-6p-2质粒,经双酶切及测序表明重组质粒构建成功.GST-BLF1蛋白经诱导表达、酶切纯化得到了相对分子质量为23×103的高纯度rBLF1,免疫家兔抗血清ELISA效价达1∶1 280 000,Western blot鉴定在目的蛋白位置处出现特异印记条带.重组rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,小鼠死亡率与蛋白剂量呈正相关.rBLF1蛋白能明显杀伤A549细胞,抗体可有效阻断其杀伤作用.结论 成功重组表达了具有生物活性的rBLF1,该蛋白具有明显杀伤A549肿瘤细胞的作用,同时能够导致小鼠死亡但表现出一定耐受性.     

十二指肠钩虫谷胱甘肽转移酶AduGST-1基因的克隆和重组表达

目的克隆十二指肠钩虫谷胱甘肽转移酶(GST)AduGST-1基因,并在大肠埃希菌中表达获得重组AduGST-1。方法设计特异引物,以十二肠钩虫成虫cDNA为模板,通过PCR扩增AduGST-1基因。将获得的AduGST-1编码序列克隆至原核表达载体pETHF,构建重组表达质粒pETHF/AduGST-1。重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达、Ni亲和层析分离纯化重组AduGST-1,SDS-PAGE分析重组蛋白表达及纯化情况。结果成功扩增到AduGST-1全长编码序列,并登记到GenBank(accession no.JQ812812)。AduGST-1编码序列长度为624bp,编码307个氨基酸残基。成功构建了重组表达质粒pETHF/AduGST-1,在BL21(DE3)中表达并纯化了重组AduGST-1。结论首次报道从十二指肠钩虫中分离到GST基因,该基因可在大肠埃希菌中高效表达,并分离纯化了重组GST蛋白,为进一步研究AduGST-1功能与应用奠定了基础。     

含MYND结构域的锌指蛋白10的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的表达纯化含MYND结构域的锌指蛋白10(ZMYND10)的重组蛋白并制备其大鼠多克隆抗体。方法全基因合成ZMYND10基因的开放阅读框,构建原核表达载体p ET-28m-ZMYND10。在大肠杆菌中诱导表达HisZMYND10,利用His标签镍柱纯化His-ZMYND10重组蛋白,并用泛素样蛋白酶1除去重组蛋白的His标签。用纯化蛋白免疫大鼠,蛋白A/G混合琼脂糖纯化血清得到抗体。通过Western blot和免疫沉淀方法鉴定抗体的特异性。结果成功构建原核表达载体p ET-28m-ZMYND10,并获得可溶性表达。利用His柱得到高纯度的重组ZMYND10抗原,免疫大鼠后纯化得到的ZMYND10多克隆抗体可以检测到B16F10细胞中过表达及内源性表达的ZMYND10蛋白,并可用于免疫沉淀实验。结论本实验成功制备了ZMYND10的多克隆抗体,为后续探索ZMYND10在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌附属基因调节子的表达与纯化

目的 构建金黄色葡萄球菌附属基因调节子(accessory gene regulator C,agrC)的原核表达质粒pET28α(+)-agrC,并诱导该基因在原核细胞中表达与纯化.方法 提取金黄色葡萄球(简称金葡菌)菌基因组DNA,PCR扩增agrC基因的目的 片断全长,插入表达质粒载体pET28α(+)-agrC中,构建pET28α(+)-agrC重组子,经双酶切和测序证实后,转化表达宿主大肠杆菌DH5α,异丙基-β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导重组蛋白表达,His标签磁株纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定蛋白表达.结果 成功构建了金葡菌pET28α(+)-agrC大肠杆菌表达重组子,实现了该蛋白在大肠杆菌中的高表达,分离纯化的产物纯度达到90%.结论 agrC的成功表达和分离纯化,为该蛋白的生物功能研究和筛选出与该蛋白特异性结合的小肽奠定了基础,从而为深入研究agrC的作用机制并设计针对agrC作用的抗菌药物提供了有力依据.     

间日疟原虫MSP1 C重组蛋白的制备及其在血清学诊断中的应用

目的在大肠埃希菌（E，coli）中表达、纯化间日疟原虫裂殖子表面蛋1C端重组蛋白（rGST—PvMSP1C）作为诊断抗原，评价其在间日疟血清学诊断中的应用价值。方法将含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C的工程菌E．coil BL21（DE3）以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS—PAGE与Western—blot免疫印迹进行鉴定；采用GST融合蛋白层析柱进行分离纯化；以纯化重组蛋白包被酶标板，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测间日疟患者血清中的特异性IgG抗体。结果含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C工程菌经IPTG诱导表达的rGST—PvMSP1C重组蛋白大小约63ku，能够被间日疟患者的血清所识别。纯化的重组蛋白SDS—PAGE电泳显示一条预期大小的蛋白条带；以重组蛋白作诊断抗原，67份镜检阳性的间日患者血清标本ELISA均为阳性。55份健康人血清ELISA均为阴性．5份恶性疟患者血清及7份血吸虫患者血清检测结果亦为阴性。结论在大肠埃希菌中表达纯化的间日疟原虫rGST—PvMSP1C蛋白具有免疫反应性，以其作为诊断抗原建立的血清中特异性IgG抗体ELISA检测方法具有良好敏感性和特异性，在间日疟的免疫学诊断中具有一定的推广使用价值。     

脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NspA基因重组的构建和表达

目的 构建脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NspA基因重组子,实现其在大肠杆菌的高效表达.方法 提取脑膜炎奈瑟菌标准株基因组DNA,PCR扩增NspA基因,插入表达质粒载体pET-30c中,构建pET-NspA重组子,转化大肠杆菌BL21 (DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白,镍琼脂糖凝胶纯化NspA 融合蛋白.结果 获得了脑膜炎奈瑟菌NspA基因的表达重组子,得到NspA诱导表达蛋白并进行了初步纯化.结论 成功构建了脑膜炎奈瑟菌NspA基因的表达重组子,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为研究该蛋白的免疫学性能、制备抗体和研制预防脑膜炎的疫苗奠定了基础.     

水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达

目的:构建水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂(leech derived tryptase inhibitor,LDTI)原核表达载体,并在大肠埃希菌[BL21(DE3)]中高效表达重组蛋白。方法:以含有目的核酸序列的质粒为模板,通过PCR技术扩增出LDTI蛋白编码序列,构建含目的片段的T克隆载体以及原核表达载体pET28a-LDTI重组质粒亚克隆,进行限制性内切酶双酶切鉴定和核酸序列分析,然后将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导,以Tricine-SDS-PAGE和蛋白质印迹方法分析和鉴定重组蛋白的表达。结果:成功构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达载体pET28a-LDTI,并获得相应的融合蛋白;本实验证明,LDTI在大肠埃希菌工程菌中高效表达,在温度为33℃,IPTG浓度为0.7 mmol,诱导时间为1 h,所表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的15%左右。结论:成功构建了LDTI原核表达载体并使其在原核系统中高效表达,为进一步研究水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂的生化特性和生物学功能奠定了良好的基础。