罗格列酮对心肌梗死大鼠血流动力学及肾素-血管紧张素系统的影响

[目的]探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动药罗格列酮对心肌梗死大鼠血流动力学及肾素-血管紧张素系统的影响.[方法]45只SD大鼠随机分为假手术组(9只)和心肌梗死组(36只),将制作心肌梗死模型后24 h仍存活的21只SD大鼠随机分为心肌梗死对照组(10只)和罗格列酮组(11只).罗格列酮组术后24 h开始给予罗格列酮3 mg/(kg·d)共8周.8周后测定血流动力学,称量心脏、左室、右室、肺和肝质量,用放射免疫法测定血浆及心肌血管紧张素Ⅱ、醛固酮以及血浆肾素活性.[结果]与心肌梗死对照组相比,罗格列酮组明显改善左室±dp/dtmax[(-1 898±383)mmHg/s vs(-2 981±258)mmHg/s,P＜0.05,(2 110±461)mmHg/s vs(3 625±221)mmHg/s,P＜0.05)];显著降低肺体比和肝体比(P＜0.05);明显抑制心肌局部血管紧张素Ⅱ[(0.23±0.02)ng/mg pro vs(0.14±0.01)ng/mg pro,P＜0.05]及醛固酮水平[(0.31±0.05)ng/mg pro vs(0.19±0.04)ng/mg pro,P＜0.05)],而对血浆肾素活性、血管紧张素Ⅱ及醛固酮无明显影响(P＞0.05).[结论]PPARγ激动药罗格列酮改善心肌梗死大鼠血流动力学,抑制心肌局部肾素-血管紧张素系统.     

狼疮肾炎病人尿蛋白刺激肾小管上皮细胞发生表型改变和Ⅰ型胶原的表达上调

目的 探讨狼疮性肾炎尿蛋白引起肾小管间质纤维化的发生机制.方法 收集初发狼疮性肾炎病人的尿液(6例)提纯总蛋白,体外与HK-2细胞培养不同时间(0、1、2、12、24、48 h),应用逆转录-聚合酶链式反应法检测HK-2细胞转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA的表达;应用Western印迹及间接免疫荧光法检测TGF-β1、COL Ⅰ及α-SMA的蛋白表达.结果 狼疮性肾炎尿蛋白可以刺激HK-2细胞TGF-β1、COL Ⅰ及α-SMA mRNA及蛋白表达上调[(0,48 h分别为TGF-β1 mRNA 0.39±0.03 vs 0.27±0.02(P＜0.01),TGF-β1蛋白0.37±0.03 vs 0.27±0.04,(P＜0.01);COL Ⅰ mRNA 0.38±0.02 vs 0.22±0.03,(P＜0.01),COLⅠ蛋白0.44±0.03 vs 0.19±0.02,(P＜0.01);α-SMA mRNA 0.66±0.04 vs 0.44±0.03,(P＜0.01),α-SMA蛋白0.43±0.02 vs 0.24±0.03,(P＜0.01)].结论 狼疮性肾炎尿蛋白诱导HK-2细胞发生表型转化及产生细胞外基质增多,可能是肾间质性纤维化的发生机制之一.     

Let-7b-5p靶向ETFA减轻高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的机制研究

目的:探讨Let-7b-5p调控电子转移黄素蛋白A(ETFA)表达对高磷诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响.方法:体外培养VSMCs,分为正常对照组和钙化组.钙化组用含β-甘油磷酸钠(β-GP)的培养基培养14 d诱导VSMCs钙化,通过茜素红染色和碱性磷酸酶(ALP)染色观察VSMCs钙化情况.分别将Let-7b-5p mimic、Let-7b-5p inhibitor、ETFA siRNA及相应对照转染VSMCs,并诱导细胞钙化.用RT-qPCR法检测细胞Let-7b-5p、ETFA及Runx2表达,Western blotting法检测ETFA和Runx2蛋白表达.双荧光素酶实验验证Let-7b-5p与ETFA的靶向关系.结果:与正常对照组比较,钙化组出现明显的紫红色钙盐结节,Let-7b-5p表达显著下调,ETFA和成骨细胞因子Runx2表达明显上调(均P＜0.05).Pearson相关分析显示,Let-7b-5p与ETFA表达呈负相关关系(r=-0.785,P＜0.001),ETFA与Runx2表达呈正相关关系(r=0.962,P＜0.001).Let-7b-5p mimic能显著降低钙化细胞Runx2和ETFA的表达及ALP活性,而Let-7b-5p inhibitor则相反.Let-7b-5p可靶向调控ETFA表达.沉默ETFA后,钙化VSMCs中ETFA和Runx2表达显著下降,钙盐结节明显减少.结论:Let-7b-5p可通过靶向抑制ETFA的表达抑制高磷诱导的VSMCs钙化.     

oxLDL通过PPARγ-ABCG1通路促进血管平滑肌细胞泡沫化

目的探讨氧化低密度脂蛋白(ox LDL)促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)泡沫化是否与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)-三磷酸腺苷结合盒转运子G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)通路调节相关。方法组织贴块法培养原代VSMCs;细胞免疫荧光染色鉴定原代VSMCs;BODIPY染色定性检测细胞内脂质沉积,酶促比色法定量检测细胞内总胆固醇沉积的量;Western blot检测VSMCs中PPARγ、ABCG1蛋白表达情况。结果 1Ox LDL作用VSMCs 48 h后脂质沉积增加;2Ox LDL作用VSMCs PPARγ蛋白表达量下降约53%(P<0.01),ABCG1蛋白表达量下降约48%(P<0.05);3罗格列酮激动PPARγ后,ABCG1蛋白表达量较单独的ox LDL组增加约147%(P<0.05),VSMCs中脂质沉积明显减少。结论ox LDL通过PPARγ-ABCG1通路促进血管平滑肌细胞泡沫化。     

替米沙坦对大鼠IgA肾病模型肾小管间质损伤及PPARγ表达的影响

目的 观察替米沙坦对大鼠IgA肾病模型过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达的影响,探讨替米沙坦对肾小管间质保护作用的可能机制.方法 40只雄性SD大鼠运用牛血清白蛋白(BSA)+脂多糖(LPS)+四氯化碳(CCl4)方法建立实验性IgA肾病模型,设立对照组、模型组、罗格列酮治疗组(简称罗格列酮组)、替米沙坦治疗组(简称替米沙坦组)、氯沙坦治疗组(简称氯沙坦组),分别于实验前、第4周末、第8周末、第10周末测各组大鼠24 h尿蛋白;免疫组化测定各组PPARγ、转化生长因子(TGF)β1、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)表达;RT-PCR检测各组PPARγ、TGF-β1、单核细胞趋化因子(MCP)-1变化.结果 第10周末尿蛋白量(mg)在模型组高于对照组(14.14±1.99 vs 1.59±0.18),而罗格列酮组(2.35±0.33)、替米沙坦组(1.88±0.09)、氯沙坦组(2.82±0.34)显著低于模型组(均P＜0.05),以替米沙坦组改变明显.模型组大鼠肾脏组织中存在系膜细胞增生及间质炎细胞浸润,而治疗组肾小管间质损伤减轻,罗格列酮组、替米沙坦组、氯沙坦组的损伤指数均低于模型组(1.97±0.23、1.57±0.14、2.15±0.22 vs 3.10±0.18,均P＜0.01),尤以替米沙坦组改善明显.免疫组化及RT-PCR结果显示PPARγ、TGF-β1、α-SMA及MCP-1在对照组肾小管及间质中微量表达,模型组呈高表达,氯沙坦组与模型组无明显差异,罗格列酮和替米沙坦组表达减少.结论 替米沙坦可能通过激活PPARγ途径及阻断血管紧张素Ⅱ受体两种途径显示更独特的小管间质损伤的保护作用.     

高磷诱导及膦甲酸钠干预血管平滑肌细胞钙化的研究

目的 观察不同浓度磷对体外培养的牛主动脉平滑肌细胞钙沉积及骨钙素表达的影响,同时观察膦甲酸钠对高磷诱导该细胞钙化的干预作用.方法 体外培养牛主动脉平滑肌细胞,观察不同磷浓度(Pi 1.5、2.0 mmol·L-1)、不同培养时间(3、6、9 d)血管平滑肌细胞的钙沉积,以及不同磷浓度(Pi 1.5、2.0、2.5 mmol·L-1)培养血管平滑肌细胞72 h骨钙素的表达.同时观察不同浓度膦甲酸钠对高磷(Pi 2.0 mmol·L-1)诱导的钙沉积和骨钙素增加的抑制作用.用甲O-酚酞络合酮方法测定钙含量;放射免疫法测定培养上清液中骨钙素的浓度;BCA法测定蛋白含量,用蛋白含量标化钙含量与骨钙素浓度;RT-PCR测定骨钙素mRNA的表达.结果 在相当于正常血磷浓度(1.5 mmol·L-1)的培养基中,平滑肌细胞钙沉积量小;而在相当于高磷血症(2.0 mmol·L-1)的培养基中,钙沉积明显增加[培养6 d,(77.187±11.692) vs(25.768±1.750) μg·(mg蛋白)-1,P＜0.01],并呈时间和剂量依赖性.与Pi 1.5 mmol·L-1组相比,Pi 2.0 mmol·L-1组培养上清液中骨钙素的水平明显增高[(1.503×10-2±2.601×10-3) vs(2.981×10-3±8.382×10-4) ng·(μg蛋白)-1,P＜0.001];Pi 2.0 mmol·L-1组平滑肌细胞骨钙素mRNA的表达也明显增加(OC/GAPDH,1.906±0.132 vs 0.748±0.0366,P＜0.001).膦甲酸钠能有效地抑制钙沉积[培养6 d,Pi 2.0 mmol·L-1 PFA 1.0 mmol·L-1组vs Pi 2.0 mmol·L-1组,(37.729±5.899) vs(77.187±11.692)μg·(mg蛋白)-1,P＜0.001]和上清液中骨钙素的表达[(4.529×10-3±1.250×10-3) vs(1.503×10-2±2.601×10-3) ng·(μg蛋白)-1,P＜0.001]及平滑肌细胞骨钙素mRNA的表达(OC/GAPDH,0.642±0.092 vs 1.885±0.165,P＜0.01).结论 高磷能直接促进血管平滑肌细胞钙沉积和骨钙素表达的增加,说明高磷血症可能是促进血管钙化的独立危险因素;膦甲酸钠能有效地抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙沉积和骨钙素表达的增加,可以作为一种新的防治高磷诱导血管钙化的药物.     

血液透析患者体液分布异常及透析对体液分布的影响

目的:血液透析(hemodialysis,HD)患者在透析前存在水潴留,且水分主要潴留于细胞外液(extra-cellular water,ECW).本文研究HD患者透析前后细胞内液(intra-cellular water,ICW),ECW和总体液量(total body water,TBW)与正常个体的差异,以及透析过程中的变化.方法:选择维持性HD治疗的终末肾功能衰竭患者80例,其中女性60例,男性20例.所有患者使用血仿膜或聚砜膜低通量透析器,透析液钠浓度138 mmol/L.所有患者无水肿,透析过程中无超滤量过大,临床判定干体重合适.利用生物电阻抗频谱分析方法分别于透析前、后测定ICW,ECW和TBW,并用体重标准化为nICW、nECW和nTBW,与69例性别、年龄和体重匹配的正常个体进行比较.结果:男性和女性HD患者的年龄、透析后体重和体重指数与正常对照没有明显差异.与对照组比较,HD患者透析前nICW[男(0.28±0.05) vs (0.33±0.04),P＜0.01;女(0.22±0.03) vs (0.27±0.04),P＜0.01]和nTBW[男(0.56±0.04) vs (0.58±0.05),P＜0.05;女(0.47±0.04) vs (0.50±0.03),P＜0.05]明显减少,nECW[男(0.28±0.02) vs (0.25±0.02),P＜0.01;女(0.25±0.03) vs (0.23±0.01),P＜0.05]明显增加.透析后与透析前相比nICW明显增加[男(0.28±0.05) vs (0.30±0.05),P＜0.001;女(0.22±0.03) vs (0.25±0.03),P＜0.001],nECW[男(0.28±0.02) vs (0.26±0.03),P＜0.01;女(0.24±0.03) vs (0.21±0.03),P＜0.001]和ECW/ICW比值[男(1.06±0.30) vs (0.89±0.25),P＜0.001;女(1.10±0.20) vs (0.88±0.17),P＜0.001]显著降低,接近正常个体水平.结论:(1)透析前HD患者存在显著体液分布异常,表现为nICW减少和nECW增加.(2)HD脱水主要来自细胞外液,进行传统的低通量透析时,体液自细胞外向细胞内转移.(3)HD患者透析后nECW和ECW/ICW比值接近正常对照,因此可以将之用来评价HD患者的干体重.     

部分膀胱出口梗阻后P2X1嘌呤受体在膀胱的表达

目的: 观察慢性膀胱出口梗阻后P2X1受体的表达水平.方法: 雌性Wistar大鼠70只,体质量250～300 g,40只为实验组,30只同龄雌性Wistar大鼠为对照组.在部分膀胱出口梗阻的动物模型成功建立后8 wk开始试验,采用免疫组织化学方法结合IMAGE-PRO图像处理软件对大鼠膀胱P2X1的表达(即阳性颗粒在某个视野下所占的百分比)进行定量研究.结果: 部分膀胱出口梗阻后大鼠较对照组大鼠膀胱的体积增大,黏膜层增厚,P2X1受体的表达水平平均为在膀胱平滑肌层[(9.60±4.78) vs (2.31±1.19)] (P<0.01),在膀胱黏膜层[(0.12±0.03) vs (0.06±0.02)] (P<0.01),浆膜层[(0.04±0.02) vs (0.03±0.01)] (P>0.05),尿道[(6.05±2.25) vs (1.48±0.14)] (P<0.01),慢性膀胱出口梗阻后P2X1受体的表达水平均明显高于对照组.结论: 膀胱出口部分梗阻后,P2X1受体在膀胱各个部位表达均升高.推测P2X1可能参与了慢性膀胱出口梗阻后膀胱的生理或病理功能的调节.     

PPAR-γ激动剂抑制血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞的表型转化

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptorgamma,PPAR-γ)激动剂罗格列酮(rosiglitazone,RSG)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转化的抑制作用及其可能的机制.方法 体外培养小鼠血管平滑肌细胞,应用AngⅡ诱导VSMCs的表型转化,给予罗格列酮预处理后用Transwell检测细胞迁移并在激光共聚焦显微镜下观察细胞微丝骨架,用RT-qPCR和Western blot分别检测PPAR-γ、PKG Ⅰ α以及VSMCs收缩型标志因子(smooth muscle 22 alpha,SM22α)mRNA和蛋白水平.应用PPAR-y抑制剂预处理后再给予罗格列酮刺激,Western blot检测PKG Ⅰ α和SM22α蛋白水平.结果 ①罗格列酮(20 μmol/L)预处理可抑制AngⅡ诱导VSMCs的迁移(P＜0.05).②罗格列酮(20 μmol/L)预处理后可抑制AngⅡ诱导VSMCs微丝骨架的形成.③RT-qPCR检测结果显示:罗格列酮(20 μmol/L)预处理后可抑制AngⅡ诱导PKG Ⅰα和SM22α mRNA的下调作用(P＜0.05).④Western blot检测结果显示:罗格列酮(20 μmol/L)预处理后可抑制AngⅡ诱导PKG Ⅰ α和SM22α蛋白水平的下调作用(P＜ 0.05);PPAR-y抑制剂GW9662可减弱罗格列酮对PKG Ⅰα和SM22α的促表达作用(P＜0.05).结论 罗格列酮通过激活PPAR-y来抑制AngⅡ诱导VSMCs的表型转化,激活PPAR-y可能通上调PKG Ⅰ α表达发挥上述作用.     

膜联蛋白5对雄性SD大鼠睾酮合成相关蛋白和酶表达的影响

目的 研究注射膜联蛋白5后雄性SD大鼠睾丸类固醇急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme,P450scc)和3β-羟类固醇脱氢酶(3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)表达的改变,初步探讨膜联蛋白5影响睾酮分泌的机制.方法 将20只SD大鼠随机分为对照组和实验组,实验组又分为7.5μg/kg组、15μg/kg组和30μg/kg组,每组5只.对照组大鼠腹腔注射等量的pH 8.0Tris-HCl,实验组腹腔注射不同剂量的膜联蛋白5,1次/d,连续20d.用RT-PCR方法分别检测对照组和各实验组SD大鼠睾丸组织中睾酮合成相关的StAR、P450scc和3β-HSD mRNA的表达变化,并用Western blot方法检测以上3种物质蛋白质水平的变化.结果 与对照组相比,在mRNA水平上,7.5μg/kg组和15μg/kg组大鼠睾丸组织P450scc mRNA表达分别增加了25.9%[(0.68±0.04) vs (0.54±0.03),P<0.01]和27.8%[(0.69±0.04) vs (0.54±0.03),P<0.01];3β-HSD mRNA表达分别升高了32.9%[(1.05±0.07) vs (0.79±0.10),P<0.01]和53.2%[(1.21±0.07) vs (0.79±0.10),P<0.01];而30μg/kg组表达差异无统计学意义;在蛋白水平上,15μg/kg组大鼠睾丸组织P450scc蛋白表达提高了34.2%[(0.37±0.04) vs (0.28±0.02),P<0.01],7.5μg/kg组和15μg/kg组的3β-HSD表达也分别增加了14.7%[(1.53±0.10) vs (1.34±0.05),P<0.01]和24.4%[(1.67±0.14) vs (1.34±0.05),P<0.01];而StAR的表达无论在转录水平还是在蛋白水平上,较对照组差异均无统计学意义.结论 膜联蛋白5可通过调节P450scc与3β-HSD的表达来调节睾酮合成.     

促红细胞生成素通过上调α-Klotho减轻大鼠血管平滑肌细胞钙化

目的 观察促红细胞生成素（EPO）对钙化血管平滑肌细胞（VSMCs）中α-Klotho蛋白表达的影响，研究α-Klotho在EPO减轻血管钙化中的作用。方法 采用高磷刺激大鼠VSMCs钙化，实时聚合酶链反应检测钙化相关基因的表达变化，von Kossa染色和钙含量检测钙化情况，应用siRNA技术敲低VSMCs中α-Klotho的表达，Western blotting检测VSMCs中α-Klotho的蛋白表达。结果 与高磷刺激的钙化模型组相比，EPO下调了钙化VSMCs中骨钙素和Cbfα-1的mRNA水平（P <0.01），并减少了钙盐沉积和钙含量（P <0.01）。Western blotting结果发现，EPO可使钙化VSMCs中α-Klotho蛋白表达水平上调1.19倍（P <0.05）。敲低VSMCs中α-Klotho后，EPO抑制骨钙素和Cbfα-1 mRNA表达的作用下调。而且，α-Klotho敲低使EPO抑制钙盐沉积和钙含量的作用被阻断。结论 α-Klotho参与了EPO减轻VSMCs钙化的作用，该实验结果为防治血管钙化提示了可能的干预靶点。     

PPARγ基因转染对兔骨髓间充质干细胞向脂肪细胞早期分化的影响

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达在骨髓间充质干细胞(MSC)向脂肪细胞早期分化中的调控作用及对脂肪分化相关蛋白(ADRP)表达的影响.方法:原代培养新西兰大白兔MSC,应用脂质体转染法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSC中,G418筛选.成脂诱导剂诱导向脂肪细胞分化,RT-PCR检测PPARγ,ADRPmR-NA表达,Western Blot检测ADRP蛋白表达,细胞形态学、油红O染色法行脂肪细胞计数和定量.结果:未分化的MSC中PPARγ,ADRPmRNA不表达,经pEGFP-N1-PPARγ转染后,调控成脂肪细胞方向分化的转录因子和早期标志PPARγmRNA(0.87±0.08 vs 0.28±0.01,P<0.01),ADRPmRNA(0.52±0.03 vs 0.21±0.02,P<0.01)表达增强;MSC向成脂肪细胞方向分化,成脂率及脂质量提高,分别为(78.5±4.2)% vs (51.4±3.0)%和(0.46±0.05) vs (0.21±0.02),P<0.05;分化成脂的细胞ADRP蛋白表达呈阳性,转染组较空转染组表达增强.结论:PPARγ在MSC向脂肪细胞分化的早期中起重要的正向调节作用,并促进ADRP基因和蛋白的表达;PPARγ基因过表达可增强MSC向脂肪细胞分化的能力,缩短分化进程,提高分化效率,可能与增强ADRP的表达有关.     

过氧化物酶增殖物激活受体-γ和核因子E2相关因子-2在肾脏衰老中的作用

目的 探讨过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPARγ)和核因子E2相关因子-2(Nrf2)在肾脏衰老中的作用.方法 以3个月龄和24个月龄大鼠作为青年组和衰老组(n=10),PAS染色观察肾脏组织病理改变,肾脏组织匀浆测定H2O2、丙二醛(MDA)含量,Western Blot法检测肾脏组织髓过氧化物酶(MPO)、PPARγ和Nrf2蛋白质表达.结果 衰老组大鼠肾脏组织MDA[(44.42±4.17)μmol/mg比(26.23± 1.43) μmol/mg]、H2O2[(239.9039.38) μmol/μg比(110.00± 19.49) μmol/μg]含量较青年组均明显增加,差异有统计学意义(P＜ 0.01、P＜0.05);衰老组肾脏组织MPO蛋白质表达较对照明显升高,差异有高度统计学意义(P＜0.01),而PPARγ蛋白表达则明显下降,差异有高度统计学意义(P＜0.01).两组间Nrf2蛋白表达差异无统计学意义(P＞ 0.05).结论 氧化损伤在肾脏衰老中发挥重要作用,可能是通过PPARγ表达下降介导.     

罗格列酮对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外抗肿瘤作用

目的:研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮对人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生长影响,以评价其在人乳腺癌治疗上的应用潜力. 方法:噻唑蓝(MTT)法检测罗格列酮对MDA-MB-231细胞体外生长抑制作用;应用PPARγ拮抗剂GW9662,分析罗格列酮对MDA-MB-231细胞增殖影响与PPARγ受体关系;流式细胞仪分析细胞周期,Annexin V-FITC和TUNEL法检测细胞凋亡. 结果:罗格列酮干预下MDA-MB-231细胞G0/G1期比例上升,而S期比例下降,呈量-效关系抑制其生长,IC50=5.2 μmol/L. PPARγ拮抗剂GW9662可部分逆转罗格列酮对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用(P＜0.05);100 μmol/L罗格列酮还可诱导MDA-MB-231细胞凋亡,TUNEL法检测的凋亡率(18.4±3.1)%与Annexin V-FITC法检测的结果一致[(16.6±2.7)%](P＞0.05). 结论:罗格列酮通过PPARγ介导,使MDA-MB-231细胞G1期阻滞而抑制其增殖,高浓度时还可诱导其发生凋亡,罗格列酮有望成为治疗乳腺癌的有效药物.     

肿瘤坏死因子α诱导的胰岛素抵抗对小鼠脂肪甘油三酯水解酶的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的胰岛素抵抗(IR)对糖脂代谢及脂肪甘油三酯水解酶(ATGL)的影响.方法 健康雄性C57BL/6J小鼠随机分为2组,分别给予腹腔注射TNF-α6μg·kg-1·d-1(TNF组,20只)和等体积生理盐水(NC组,20只)共7 d.采用2-脱氧-3H葡萄糖(2-DOG)为示踪剂的扩展胰岛素钳夹技术评价小鼠胰岛素敏感性和糖代谢变化,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法分别测定代谢相关基因ATGL、激素敏感性脂酶(HSL)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)等组织mRNA或血浆蛋白表达水平的变化.结果 TNF-α处理后,小鼠空腹血糖(FBG)、血浆胰岛素和游离脂肪酸(FFA)水平均增高.在胰岛素钳夹术中,TNF组血浆胰岛素水平明显高于NC组[(341.7±17.7)vB(84.7±5.5)mU/L,P＜0.01],胰岛素对FFA的抑制作用明显障碍[FFA,TNF组:(0.82±0.03)mmol/L,NC组:(0.43±0.07)mmol/L,P＜0.01].TNF组葡萄糖输注率(GIR)明显低于NC组[(39.1±2.3)vs(54.2±2.2)mg·kg-1·min-1,P＜0.01],骨骼肌葡萄糖摄取率(MGU)也明显低于NC组[(15.8±1.7)vs(20.9±2.5)μmol·100 g-1·min-1,P＜0.01].TNF组脂肪组织ATGL mRNA表达明显低于对照组(0.85±0.09 vs 1.37±0.12,P＜0.01),ATGL蛋白水平也明显低于对照组(0.53±0.03 vs 0.65±0.05,P＜0.05).TNF组小鼠脂肪组织PPARγ/mRNA表达明显低于对照组(0.83±0.07 vs 1.07±0.07,P＜0.05).结论 在TNF-α诱导的IR中,ATGL在脂代谢相关通路中起着调控作用.     

土茯苓活性分子落新妇苷抗顺铂诱导的人肾小管上皮细胞凋亡作用研究

目的观察土茯苓活性分子落新妇苷抗顺铂诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的作用。方法采用MTT法分别观察不同浓度落新妇苷(30、50、100、200、300μM)联合顺铂(50μM)对HK-2细胞活力的影响;将HK-2细胞分为对照组、顺铂组、落新妇苷(100、200μM)组,药物干预24h后,Annexin V/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3表达情况;RT-PCR法和Western blot法检测药物转运蛋白OCT2 m RNA和蛋白质表达情况。结果 MTT结果显示,落新妇苷能够增强顺铂诱导HK-2细胞活力(P0.05),且呈一定剂量依赖关系。流式细胞凋亡结果显示,与对照组比较,顺铂组细胞凋亡率显著升高[(61.5±5.67)%比(1.2±1.13)%,P0.01];落新妇苷能够显著抑制顺铂诱导HK-2细胞凋亡,尤其200μM剂量组显著[(33.5±6.93)%比(61.5±5.67)%,P0.01]。Western blot结果显示,与对照组比较,顺铂组细胞Bax、cleaved-caspase-3表达显著增加[(0.33±0.07)比(0.02±0.01)、(0.54±0.06)比(0.08±0.03),P0.01],Bcl-2表达显著减少[(0.11±0.02)比(0.63±0.07),P0.01];与顺铂组比较,落新妇苷能够显著下调Bax、cleaved-caspase-3,上调Bcl-2蛋白表达[Bax:(0.19±0.04)、(0.18±0.02)比(0.33±0.07),P0.05;cleaved-caspase-3:(0.28±0.06)、(0.20±0.05)比(0.54±0.06),P0.01;Bcl-2:(0.26±0.04)、(0.28±0.04)比(0.11±0.02),P0.05]。RT-PCR和Western blot结果显示,与顺铂组比较,落新妇苷能够显著抑制HK-2细胞药物转运蛋白OCT2 m RNA表达[(0.53±0.14)、(0.47±0.03)比(0.89±0.09),P0.01]和蛋白质表达[(0.36±0.08)、(0.25±0.03)比(0.52±0.05),P0.05,P0.01]。结论落新妇苷具有抑制顺铂诱导的HK-2细胞凋亡的作用,其机制可能与抑制OCT2蛋白表达有关。     

酸性环境抑制高磷诱导大鼠VSMCs 钙化的机制研究

目的 探讨酸性环境对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的影响及其机制。 方法 体外分离培养大鼠VSMCs,采用免疫细胞化学法鉴定。将VSMCs 按随机数字表法分为正常对照组、 高磷＋ pH 7.4 组、高磷＋ pH 7.1 组。刺激4 d 后,采用逆转录聚合酶链反应和Western blot 检测活化T 细胞 核因子c1（NFATc1）、Runt 相关转录因子2（Runx2）基因和蛋白的表达。刺激14 d 后,对各组细胞进行 钙化染色、钙含量和碱性磷酸酶（ALP）活性测定。结果 与正常对照组比较,高磷＋ pH 7.4 组的钙含量、 ALP 活性、Runx2 和NFATc1 表达升高（P <0.05）;与高磷＋ pH 7.4 组比较,高磷＋ pH 7.1 组的钙含量、 ALP 活性、Runx2 和NFATc1 表达降低（P <0.05）。相关性分析发现,NFATc1 蛋白表达水平与ALP 活性、 Runx2 蛋白表达水平呈正相关（P <0.05）。结论 酸性环境可以抑制高磷诱导的大鼠VSMCs 钙化,其机制可 能是通过降低NFATc1 表达,抑制VSMCs 表型转化来实现的。     

SIRT1激动剂通过降低ACAT1表达抑制平滑肌泡沫细胞形成

目的 探讨沉默信息调节因子1 (silent mating type information regulation 2 homolog-1,SIRT1)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cell,VSMC)泡沫化的作用和相关的分子机制.方法 用组织贴块法体外培养原代VSMC,用80μg/mL ox-LDL刺激VSMC诱导泡沫细胞形成.检测SIRT1在ox-LDL刺激不同时间(24、48、72 h)的表达变化.SIRT1的活性调控分别应用SIRT1激动剂(SRT1720,SRT,1μmol/L)和抑制剂(nicotinamide,Nic,100 μmoL/L)进行干预.干预24 h后采用Western blot检测VSMC过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(A-cholesterol acyhransferase 1,ACAT1)的蛋白表达,干预48 h后采用油红O染色检测细胞内脂质沉积和泡沫细胞形成情况.应用PPARγ激动剂(Rosiglitazone,RSG,50 μmol/L)和抑制剂(GW9662,10 μmol/L)调控PPARγ的表达,Western blot检测VSMC中ACAT1的表达.结果 ①ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中,SIRT1蛋白表达在48 h降低约47％ (P ＜0.01);油红O染色显示,SRT可以抑制VSMC泡沫细胞形成,而Nic可逆转SRT的抑制作用;②ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中ACAT1的表达显著增加[(2.77±0.70),P＜0.01],SIRT1激动剂SRT可显著抑制ACAT1的表达[(0.90±0.27),P＜0.01],而SIRT1抑制剂Nic可阻断这一作用,升高ACAT1的表达[(2.25±0.37),P＜0.05];③ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中PPARγ的表达减少[(0.73±0.12),P＜0.05],SIRT1激动剂SRT可上调VSMC中PPARγ的表达[(0.98±0.16),P＜0.05],SIRT1抑制剂Nic抑制PPARγ的表达[(0.47 ±0.13),P＜0.01];④PPARγγ激动剂RSG可抑制ACAT1的表达[(0.73±0.09),P＜0.01],而PPARγ抑制剂GW9662则上调ACAT1表达[(1.68±0.09),P＜0.01].结论 SIRT1通过上调VSMC中PPARγ表达而抑制ACAT1表达,从而抑制ox-LDL诱导的VSMC泡沫样变.