microRNA定量检测方法研究现状

MicroRNA(miRNA)是一类由18～24 nt核酸构成的非编码内源性小分子RNA,主要参与真核生物的细胞分化、增殖与凋亡等转录后水平的基因表达调控.研究发现,miRNA与肿瘤、代谢调控、疾病发生及诊断等方面有密切的联系,因此准确且灵敏地进行miRNA的定量检测是深入研究miRNA功能的前提.目前,miRNA定量检测原理主要基于核酸杂交或扩增,包括Northern印迹、微阵列芯片、实时定量PCR、滚环扩增等.本文通过对传统miRNA检测方法、高灵敏度新型miRNA检测方法进行阐述与分析,为筛选合适的miRNA定量检测方法提供参考.     

实时荧光定量PCR方法检测石蜡包埋组织microRNA表达的方法探讨

目的:探讨从石蜡包埋组织中运用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)方法检测microRNA表达的可靠性和敏感性。方法:选取2005年至2010年从石河子大学医学院第一附属医院、新疆伊犁哈萨克族自治州友谊医院收集的97例福尔马林固定、石蜡包埋食管癌组织样本,提取组织总RNA,RT-PCR逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法检测microRNA表达。结果:97例食管癌组织样本中,RNA提取成功90例,7例失败,运用实时荧光定量PCR成功检测了83例microRNA表达,7例检测不准确。RNA提取成功率明显高于失败率,实时荧光定量PCR检出的定量准确例数高于定量不准确例数,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:实时荧光定量PCR(RQ-PCR)方法是检测石蜡包埋组织中microRNA表达的一种有效方法。     

环介导等温扩增技术的研究进展和微生物检测应用

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型的核酸扩增技术。本文概述其反应原理、技术特点、相关技术、微生物检测应用及发展前景。     

荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫方法的研究

目的建立一种简便、快速和高灵敏度的恶性疟原虫的荧光定量环介导等温扩增检测方法。方法针对恶性疟原虫环子孢子蛋白（CSP）种属特异性基因保守区域8个位点设计3对引物,同时使用PCR法扩增恶性疟原虫219bp保守序列,经克隆后转化入工程菌株JM109感受态细胞中并提取重组质粒作为模板。以探索建立恶性疟原虫荧光定量环介导等温扩增检测技术,并对其试验重复性、灵敏度、特异性及适用性子以评估。结果在重组质粒浓度为1．06×10^4∽10^9拷贝／反应的范围内,标准曲线循环阈值与模板浓度有良好线性关系（相关系数0．9995）,CT值变异系数为6．29％,无非特异性扩增,初步临床试验结果表明,试验的灵敏度为90．00％,特异度为93．33％,准确性为91．67％,试验可在30min内完成。结论荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫简便、快速、敏感,具有广阔的应用前景。     

Hcmv-miR-UL112荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种能快速准确检测hcmv-miR-UL112的方法。方法根据miRBase网站中公布的hcmv-miRUL112基因序列,通过设计引物、探针及优化反应条件,建立了一种实时荧光定量PCR方法对hcmv-miR-UL112进行定量检测,并进行敏感度、重复性和特异性实验,同时对PCR产物进行测序验证。结果获得了1条特异性茎环反转录引物,一条特异性PCR正向引物和通用反向引物。PCR最佳反应条件为95℃10min,53℃2min;95℃15s,57℃40s,共40个循环。该方法的批内变异系数CV和批间CV均<5%,相关系数R2均>0.99,扩增效率均>90.0%。结论成功建立了一种敏感度高、特异性强、重复性好并且简便快速的hcmv-miR-UL112荧光定量qRT-PCR检测方法。     

食管癌中microRNA表达的研究进展

microRNA是一类小的非编码蛋白质的RNA,17～25个核苷酸长度,在物种进化中相当保守,其功能通过与靶基因mRNA的3′-UTR配对起负调控基因表达作用,从而调节细胞的代谢、增殖、分化和凋亡等过程.目前认为microRNA在食管癌的发生、发展过程中,起到与癌基因或抗癌基因相似的作用.本文对microRNA功能、microRNA表达与食管癌的关系,以及研究microRNA表达的研究方法等进行综述.     

ERA实时荧光法快速检测鹦鹉热衣原体方法的建立

目的建立一种快速检测鹦鹉热衣原体(Cps)的酶促重组等温扩增(ERA)实时荧光法。 方法根据鹦鹉热衣原体MOMP基因序列设计特异性引物和探针,建立ERA实时荧光法反应体系。优化体系中的引物和反应温度,再评价ERA实时荧光法的敏感性和特异性,以及对39例鸟类肺组织样本进行验证。 结果ERA实时荧光法可在40 ℃恒温条件下15 min内特异性扩增鹦鹉热衣原体,其检出限为10 copies/μL,特异性好。ERA实时荧光法检出39例鸟类肺组织样本中阳性样本30例,阴性样本9例,其灵敏度为96.77%,特异度为100.00%,阴性预测值为88.89%,阳性预测值为100.00%。 结论成功建立用于鹦鹉热衣原体检测的ERA实时荧光法,其操作简单,且灵敏度和特异度好。     

新型等温扩增技术应用于疟原虫等寄生虫快速诊断的研究进展

当前常用基于PCR原理的核酸检测技术来检测疟原虫,疟原虫检测方法主要包括镜检法、抗原免疫检测法和核酸检测法等。但由于存在检测时间长、人员和设备要求高等缺点,限制了其在基层的推广应用。特别是基层普遍缺乏经验丰富的专业技术人员和高端仪器设备,此外在极端环境下快速检测大规模样品的需求等对现存疟原虫检测方法造成了挑战。近年来发展起来的等温扩增技术由于具有简便、快速、灵敏性和特异性高等优点,具有潜在的应用前景。本综述介绍了试对各类等温扩增技术的原理、特点和前景等,并在此基础上重点综述重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA）与重组酶介导的等温扩增技术（recombinase-aided isothermal amplification assay, RAA）,并提出利用这类重组酶扩增技术,实现常见疟原虫种快速、精确诊断的可能。     

肺炎衣原体实时定量PCR检测方法的建立

目的:探讨实时定量PCR检测肺炎衣原体(chlamydia pneumonia,Cpn)的方法.方法:根据GenBank提供的肺炎衣原体基因序列,选取高特异性和保守型的区域进行引物设计,并建立实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)的检测方法.同时用肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒对Cpn引物的特异性进行分析.对呼吸道感染患者200个咽拭子样本和68个肺泡冲洗液样本进行检测,以荧光抗体检测法作对照,评价实时定量PCR检测Cpn的准确性.结果:Cpn PCR引物对肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒均显示阴性,对Cpn显示为阳性,特异性良好;荧光实时定量PCR技术检测的准确性优于荧光抗体检测法.结论:荧光实时定量PCR技术检测Cpn体灵敏度高、周期短,可作为临床诊断Cpn的手段.     

基于链置换反应的DNA等温扩增技术应用进展

DNA等温扩增是在恒定温度下用非热变性的方法解开DNA双链的一种扩增技术。链置换反应指某些具有链置换活性的DNA聚合酶在延伸新链的同时将下游旧链剥离,它已被用于多种体外等温扩增技术,包括链置换扩增、滚环扩增、多重置换扩增、环介导的等温扩增等。其主要应用于DNA测序、全基因组扩增、基因芯片、微生物病原体检测等领域。     

血吸虫微小RNA及其研究进展

血吸虫也称裂体吸虫,可致血吸虫病。血吸虫寄生于脊椎动物体内,而其幼虫在中间宿主螺体内发育。血吸虫体内存在众多微小RNA(micro RNA),参与调控自身生长发育以及与宿主间的相互作用。本文从血吸虫micro RNA的发现与鉴定、血吸虫micro RNA在不同发育阶段、不同性别及不同宿主中的差异表达以及血吸虫micro RNA潜在的应用价值等方面作一概述。     

表面等离子共振技术结合滚环扩增法检测丙型肝炎病毒

目的研究滚环扩增(RCA)技术结合特异性表面等离子共振(SPR)金膜芯片检测丙型肝炎病毒(HCV)的方法。方法根据丙型肝炎x-tail区域的特异检测序列,设计并合成针对RCA法检测HCV的探针和引物,分成3组(实验组、阴性样品组和阳性样品组)进行RCA实验,验证RCA法检测HCV的特异性。将模板浓度按10倍梯度稀释,评价SPR技术结合RCA法检测的检测限。在普通金膜芯片的基础上进行表面化学处理,形成高特异性核酸芯片,用抗蛋白实验验证芯片抗蛋白能力。采用双通道SPR仪对RCA反应及信号放大反应进行实时观测。运用SPR技术结合RCA法检测63例临床血液样品,并与Real-Time PCR法比较,评价其灵敏度和特异度。结果 SPR技术结合RCA法对HCV阳性标准品的最低检测浓度为1 pmol/L,低于Real-TimePCR法的检测限(0.1 nmol/L)。SPR芯片具备良好的抗蛋白质非特异性吸附能力。双通道SPR仪对RCA芯片系统的检测信噪比为100,实现了对HCV的检测。对临床样品的检测灵敏度为90.0%(27/30),特异度为84.8%(28/33)(χ2=8.10,P=0.004)。结论 SPR技术结合RCA法将生物传感技术及原位扩增技术相结合,实现了快速、非标记和实时检测HCV。     

病毒microRNA研究进展

microRNA（miRNA）是一种含有约22个核苷酸的RNA分子,它可以介导基因表达的转录后调节,可调节细胞的生长、分化、凋亡、细胞周期和免疫反应等.已逐步发现多种病毒miRNA,该文就近年来病毒miRNA的研究进展作一综述.     

病毒microRNA研究进展

microRNA(miRNA)是一种含有约22个核苷酸的RNA分子,它可以介导基因表达的转录后调节,可调节细胞的生长、分化、凋亡、细胞周期和免疫反应等.已逐步发现多种病毒miRNA,该文就近年来病毒miRNA的研究进展作一综述.     

微小RNA与肾脏纤维化的研究进展

微小RNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码蛋白质RNA,通过与RNA结合,参与机体的生理和病理过程,并在细胞分化、增殖和凋亡等过程中发挥重要作用。研究发现,miRNA通过调控胶原沉积、纤维连接蛋白表达、间充质细胞转分化及转化生长因子β对肾脏的作用,参与肾脏纤维化的发生和进展。     

滚环扩增原理及其在医药领域的应用

滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。本文结合了滚环扩增技术在医药领域中的最新研究进展,介绍了滚环扩增的原理及其在医药领域中的应用。     

外泌体微RNA治疗骨关节炎研究进展

骨关节炎是骨科常见的顽固性疾病之一,因其高发病率、高致残率,给患者和社会带来沉重的负担。随着组织工程领域的飞速发展,外泌体治疗骨关节炎的潜力已得到证实。其中,外泌体特异性微RNA（miRNA）可抑制软骨降解和滑膜炎症、促进软骨下骨重塑,从而缓解甚至逆转骨关节炎的病理改变。本文对外泌体miRNA治疗对骨关节炎患者软骨、滑膜、软骨细胞外基质及软骨下骨的影响进行综述,以期为临床上应用外泌体miRNA治疗骨关节炎提供参考。     

MicroRNA在腹膜透析中的研究进展

腹膜透析是终末期肾病患者的主要治疗方式之一,因有能更好地保护残余肾功能等优势,具有广泛的应用前景。但长期腹膜透析容易出现多种并发症,其中腹膜透析相关性腹膜炎是最常见的并发症之一,反复发生的炎症刺激会加速腹膜纤维化的发展,最终导致超滤衰竭,腹膜透析失败。MicroRNA(miRNA)属于非编码RNA的一种,在炎症及纤维化过程中的作用备受关注,众多miRNA参与了腹膜炎症及纤维化过程。新近研究显示,腹膜透析过程中,多种miRNA的表达谱发生了改变。该文就miRNA在腹膜透析中的研究进展进行综述。