DNA疫苗的研究进展

DNA疫苗是将携带抗原编码基因的质粒DNA直接注入动物体内,并在动物细胞中表达抗原蛋白以诱导动物产生免疫保护作用。DNA疫苗由载体质粒DNA内插入一个或多个抗原基因构成,主要通过肌肉注射或基因枪经皮内或皮下给予。接种后,质粒DNA被机体细胞摄取并表达相应抗原蛋白质,该蛋白质被专职抗原递呈细胞（professional antigen-presenting cell,APC）经MHC-Ⅰ类分子或MHC-Ⅱ类分子途径提呈给CD8^＋T细胞或CD4^＋T细胞,从而诱导细胞免疫和体液免疫。目前DNA疫苗在小动物身上已证明可有效应用于感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、过敏性疾病等,而且HIV、HBV、疟疾及某些肿瘤的DNA疫苗已进入临床试验并有一定疗效。尽管人们不乏有质粒DNA会整合入宿主的染色体,或者质粒DNA进入机体不诱导免疫反应而引起免疫耐受甚至产生自身免疫等担忧,但大量的实验研究及理论分析都基本肯定了DNA疫苗使用的安全性。只是DNA疫苗要想成为广泛应用于儿童和成人的一种安全有效的疫苗,还需要进行更谨慎、更系统的研究。     

DNA疫苗与DC疫苗抗肿瘤作用的研究进展

肿瘤是21世纪医学界面临的难题之一,肿瘤疫苗以其低毒、持久和特异性强等特点成为肿瘤治疗研究的热点,有效的肿瘤抗原被识别、递呈是建立抗肿瘤免疫应答的基础,在这个基础的不断理解和深化研究下,新型肿瘤疫苗不断涌现,并展现出一定的抗肿瘤效果,其中DNA疫苗以其独特的肿瘤抗原提供方式及DC在肿瘤抗原呈递中的重要作用,成为了肿瘤免疫治疗的有力工具,本文就目前这两类疫苗作用的机制、进展及存在问题进行综述.     

新型胰腺癌MUC1 DNA疫苗的免疫原性研究

目的 研究所构建的新型胰腺癌MUC1 DNA疫苗的免疫原性.方法 采用三种优化策略共构建4个重组质粒,接种免疫C57BL/6J (H 2b)雌性小鼠.每2周加强免疫一次,共免疫3次.每次免疫前及处死小鼠前检测抗体和细胞因子.最后一次免疫结束后2周取脾,体外经VNTR合成肽刺激培养后进行杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤功能分析.结果 pIRES2-EGFP3VNTR组、pIRES2-EGFP-3VNTR-CI-144组、pIRES2-EGFP-3VNTR-mIL-18组、pIRES2-EGFP-3VNTR-CI-144-mIL-18组的CTL特异杀伤率显著高于空载体对照组和生理盐水对照组,三重优化构建的质粒pIRES2-EGFP-3VNTR-mIL-18的CTL特异性杀伤率高于双重优化构建和单重优化构建的质粒.各优化构建质粒组的抗MUC1抗体OD值均显著高于对照组(P＜0.05),但组间差异无统计学意义.各优化构建质粒组的外周血IFN-γ均高于对照组(P＜0.05),且以含有IL-18优化策略的两组为高(P＜0.05).结论 所构建的优化重组质粒免疫小鼠后均可诱发抗原特异的CTL应答和抗体应答.C1-144和IL-18可增强疫苗的免疫原性.     

表达肾癌G250基因和hGM-CSF基因HEK293细胞系的建立

目的 建立稳定表达肾癌G250基因与基因佐剂hGM-CSF基因编码蛋白的的HEK293细胞系。方法 通过脂质体转染的方法,将表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的双顺反子pIG250-GM真核表达质粒导入HEK293细胞中;经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系;用免疫组化、ELISA和Western Blot方法,检测目的蛋白在HEK293细胞中的表达。结果 经600 μg/mL的G418压力筛选后,获得了抗性细胞克隆;免疫组织化学方法检测到表达G250的阳性细胞;ELISA方法检测到pIG250-GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达与空载体对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;Western Blotting方法检测到G250蛋白的表达,分子量约54Ku,与预期大小相符。结论 成功建立可稳定表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的HEK293细胞系,为研究防治肾癌疫苗的免疫应答机制提供了实验基础。     

肾癌G250抗原基因真核表达载体的构建和序列测定

目的构建肾癌G250抗原基因编码区序列的直核表达载体并进行序列测定。方法从肾癌组织中提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增肾癌G250抗原的基因编码区序列，将PCR片段定向克隆至真核表达载体pcDNA3．0，并进行序列测定。结果肾癌组织RT-PCR扩增后，均产生特异性条带，位置在1000bp和1600bp之间。与预定相符。pcDNA3．0-G250分别用Hind Ⅲ、Xho Ⅰ双酶切后产生2条带。均与预定位置相符；抗原基因编码区序列与Genbank登录号BC014950文献报道的序列同源性为100％，目的基因与载体正确连接。结论成功克隆了肾癌G250抗原的基因编码区序列，并构建了其真核表达载体pcDNA3．0-G250，为核素标记的G250单克隆抗体在诊断和治疗的心用及G250基因修饰的树突状细胞疫苗的肾癌生物治疗提供了依据。     

癌胚抗原DNA疫苗对大肠癌特异性细胞免疫的激活效果

目的检测以质粒pIRES为载体构建的带有全序列癌胚抗原(CEA)基因的核苷酸疫苗对机体特异性抗肿瘤免疫反应的激活效果。方法将CEA基因片段连接于真核表达质粒pIRES中,用肌肉注射方法接种核酸疫苗;检测CEA在小鼠肌肉组织中的表达情况及其对小鼠脾细胞CEA特异性细胞免疫反应的激活效果。结果小鼠经肌肉注射质粒后,免疫组化证实该核酸疫苗可在体内有效表达CEA;分子免疫检测显示注射后小鼠特异性淋巴细胞增值反应明显并且伴有自然杀伤细胞NK活性显著增高。结论实验所构建的核酸疫苗pIRESCEA可在体外及小鼠体内高效表达并表现出良好的细胞免疫原性。     

CAIX/MN/G250 mRNA在肾癌根治术前后表达的检测

目的探讨肾癌相关蛋白CAIX／MN／G250mRNA在肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）手术前后的表达水平及临床意义。方法应用RT—PCR技术检测57例RCC患者癌组织及术前外周血中CAIX／MN／G250mRNA的表达情况,并选择15例癌旁肾组织、15例正常肾组织及40例健康人外周血作对照,对术前外周血CAIX／MN／G250mRNA阳性RCC患者术后随访4周,并对其外周血CAIX／MN／G250mRNA水平进行半定量检测。结果57例RCC患者,其CAIX／MN／G250mRNA阳性率在外周血中为59．6％（34／57）,癌组织中为78．9％（45／57）,显著高于对照组（P〈0．01）。在肾透明细胞癌患者的外周血及癌组织中,CAIX／MN／G250mRNA的阳性率分别为76．2％（32／42）和95．2％（40／42）,均显著高于相应对照组（P〈0．01）。RCC患者外周血及癌组织中CAIX／MN／G250mRNA阳性率均随临床分期的增加而增加（P〈0．01）。34例外周血阳性患者CAIX／MN／G250mRNA水平术前2h、术后7、14、21和28d分别为0．54&#177;0．13、0．56&#177;0．15、0．34&#177;0．13、0．29&#177;0．18和0．22&#177;0．11。RCC患者外周血CAIX／MN／G250mRNA水平在肾癌根治术后随时间的推移呈下降趋势（P均〈0．05）。结论使用RT—PCR技术检测CAIX／MN／G250mRNA对肾癌尤其是透明细胞癌有较好的特异性和敏感性。外周血CAIX／MN／G250mRNA检测可作为肾癌微转移的检测指标用于RCC的诊断、疗效评价及预后判断。     

经鼻腔黏膜免疫途径投递防龋DNA疫苗的研究进展

20世纪90年代以来,因DNA疫苗具有其它疫苗不可比拟的优点——免疫原性强,制备简单,免疫应答持久,安全等特点,成为防龋疫苗的研究热点.为寻找免疫防龋的最佳途径,国内外许多学者在多种免疫方法和途径上进行了研究.唾液是口腔局部抗卷染的重生理屏障.以分泌型IgA (sIgA)作为主体液防御因子的黏膜免疫系统是机体抗感染的第一道防线,在抵抗感染方面起着极其重的作用.而且实验证明通过黏膜免疫之后,黏膜局部的抗体比血清抗体出现早、效价高,且维持时间长.鼻腔免疫它不仅能避免肝脏的首过效应,有效地诱导黏膜局部免疫和系统免疫应答,具有远隔共同黏膜效应,而且与其它免疫途径相比更加简便、安全、文明,无创伤.近年来鼻黏膜途径受到了基因免疫与基因治疗领域的广泛关注,因而对经鼻腔黏膜途径免疫的方式进行深入的研究,对将来防龋DNA疫苗的临床应用具有重的意义.     

乙型肝炎疫苗成人免疫策略的研究进展

乙型肝炎是影响人类健康的重要公共卫生问题,根据世界卫生组织(WHO)统计,全世界大约有20亿人感染或曾经感染过HBV,主要来自亚洲、非洲及拉丁美洲等发展中国家,其中约3.5亿为HBV慢性感染者,每年死于乙型肝炎的患者约有100万人[1].我国乙型肝炎流行率较高,据调查显示[2],我国每年因治疗HBV感染所花费的金额高达6000亿元,这给国家和人民带来沉重的负担,而注射乙型肝炎疫苗是预防乙型肝炎最实用也是最有效的方法.2002年我国开始实施新生儿免费接种乙型肝炎疫苗,经过数十年的不懈努力,我国适龄儿童乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者减少了约2000万[3],这也说明了儿童乙型肝炎疫苗接种的必要性和重要性,但考虑到我国具体国情,普遍让成人接种乙型肝炎疫苗还不能实现.因此,研究乙型肝炎疫苗成人的免疫策略,提高免疫接种成功率,是今后乙型肝炎预防工作的热点.本文就近年来乙型肝炎疫苗成人免疫策略的研究进展作一综述,希望能为成人乙型肝炎预防研究提供参考.     

GM-CSF增强胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗免疫效果的研究

目的研究 GM-CSF 作为免疫佐剂对胰腺癌 MUC1-VNTR 核酸疫苗免疫效果的增强作用。方法 45只 C57BL/6小鼠随机分3组,在胫前肌注射100μg/100μl质粒 DNA 生理盐水溶液(VG 组接种 pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A 质粒联用 rmGM-CSF,V 组单纯接种 pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A 质粒,G 组单纯接种 rmGM-CSF)进行免疫接种。4周后加强免疫1次,6周后取血清 ELISA 法测抗体,取脾细胞悬液体外以 VNTR 合成肽特异刺激,6d 后进行杀伤试验。结果VG 组小鼠脾细胞 CTL 的特异性杀伤率显著高于 V 组(P<0.01)和 G 组(P<0.01),表明 GM-CSF增强了疫苗所诱发的 CTL 应答。而 CTL 对未经 VNTR 合成肽孵育的靶细胞 EL4-VNTR~-杀伤较低(P<0.01),VU 3C6可抑制 CTL 对经 VNTR 合成肽孵育的靶细胞 EL4-VNTR~+的杀伤活性(P<0.01),表明具有 VG 组诱生的 CTL 应答依然保持 VNTR 特异性。VG 组小鼠血清抗 VNTR 抗体等效浓度(3119.0±110.6)μg/ml 高于Ⅴ组(2323.5±238.3)μg/ml 和 G 组(2023.9±169.0)μg/ml,差别极为显著(P<0.01)。结论 GM-CSF 可增强自行构建的胰腺癌 MUCl-VNTR 核酸疫苗所诱生的 VNTR 特异的 CTL 应答和抗体应答。     

The histological assessment and evaluation of a 4 day subrenal capsule assay by the percentage inhibition of DNA/protein

A four day subrenal capsule assay was investigated in order to determine its ability to clinically predict tumor chemosensitivity. To establish more objective and accurate evaluation criteria, a histological assessment and measurement of the DNA and protein content of excised tumor implants was conducted in ddY mice. The histological studies provided qualitative results concerning the percentage of cancer cells in the xenograft, the number of mitoses, the amount of necrosis, and the extent of lymphocytic infiltration. The DNA content was measured by a modified version of the Schmidt-Thannhauser-Schneider method and the protein content was estimated using the Bio-Rad protein assay. The percentage of cancer cells in the xenograft correlated poorly with the relative increase in tumor size, weight and the percentage inhibition of DNA/protein (per cent DNA/protein), however, the per cent DNA/protein correlated well with the clinical effects in 85.7 per cent of the tumors studied. Moreover, the histological assessment information was only consistent with those results obtained for per cent DNA/protein in the control group.