H5N1-NP蛋白的原核表达及与宿主蛋白相互作用的初步研究

目的 原核表达并纯化禽流感病毒A/Anhui/1/2005（H5N1）的NP蛋白,并筛选人支气管上皮BEAS-2B细胞总蛋白中能够与纯化的NP蛋白相互作用的蛋白.方法 一方面,构建了含有NP基因的原核表达质粒pET30a-NP,并在大肠埃希菌中获得了可溶性表达.亲和层析和离子交换层析两步对NP蛋白进行纯化.另一方面,制备了BEAS-2B细胞总蛋白.在此基础上,联合应用Pull-down与LC-MS/MS技术来筛选并确认细胞中与纯化的NP蛋白相互作用的成分.结果 构建的pET30a-NP质粒在IPTG诱导下在原核细胞中实现了可溶表达,经过两步纯化后,得到可溶的NP蛋白纯品.Pull-down与LC-MS/MS技术初步筛选到BEAS-2B细胞中20个可能与NP蛋白相互作用的细胞蛋白.还需要进一步的实验来验证他们和NP蛋白之间的相互作用.结论 获得了高纯度的可溶NP蛋白及筛选到20个可能与其相互作用的BEAS-2B细胞候选蛋白.     

胆囊癌组织蛋白质组研究及膜联蛋白A3表达的临床病理意义

目的 通过分离并鉴定胆囊癌和胆囊良性组织的差异表达蛋白质,以发现可能用于早期诊断或治疗的胆囊癌肿瘤标志物.方法 提取人胆囊癌和胆囊良性组织(各6例)的总蛋白质,用双向电泳分离蛋白并进行比较.选择在胆囊癌组织中明显差异表达的蛋白点,行质谱分析.采用免疫组织化学EliVision法,对50例原发性胆囊癌38例慢性胆囊炎组织中膜联蛋白A3表达进行检测,分析胆囊癌中膜联蛋白A3的表达状况及其与胆囊癌临床病理指标和预后的关系.结果 获得了分辨率和重复性均很好的凝胶蛋白图谱.对筛选出的在胆囊癌组织中明显差异表达的46个蛋白点,共有17种蛋白质被成功鉴定,其中在胆囊癌组织中高表达9个,低表达8个.膜联蛋白A3在胆囊癌组织中表达的阳性率明显高于慢性胆囊炎组织,差异有统计学意义(74.0%:21.1%,P<0.01),其表达水平与胆囊癌患者年龄、性别及组织学类型等因素均无明显关系(P>0.05),但高表达与胆囊癌的低分级(40.0%:82.5%,P<0.05)、淋巴结或远处转移(40.9%:100.0%,P<0.05)以及术后生存时间减少(50.0%:93.8%,P<0.05)有明显关系.结论 胆囊癌组织蛋白与胆囊良性组织存在明显的差异.膜联蛋白A3可能对胆囊癌的发生、发展有作用.     

胆囊癌组织蛋白质组研究及膜联蛋白A3表达的临床病理意义

目的 通过分离并鉴定胆囊癌和胆囊良性组织的差异表达蛋白质,以发现可能用于早期诊断或治疗的胆囊癌肿瘤标志物.方法 提取人胆囊癌和胆囊良性组织(各6例)的总蛋白质,用双向电泳分离蛋白并进行比较.选择在胆囊癌组织中明显差异表达的蛋白点,行质谱分析.采用免疫组织化学EliVision法,对50例原发性胆囊癌38例慢性胆囊炎组织中膜联蛋白A3表达进行检测,分析胆囊癌中膜联蛋白A3的表达状况及其与胆囊癌临床病理指标和预后的关系.结果 获得了分辨率和重复性均很好的凝胶蛋白图谱.对筛选出的在胆囊癌组织中明显差异表达的46个蛋白点,共有17种蛋白质被成功鉴定,其中在胆囊癌组织中高表达9个,低表达8个.膜联蛋白A3在胆囊癌组织中表达的阳性率明显高于慢性胆囊炎组织,差异有统计学意义(74.0%:21.1%,P<0.01),其表达水平与胆囊癌患者年龄、性别及组织学类型等因素均无明显关系(P>0.05),但高表达与胆囊癌的低分级(40.0%:82.5%,P<0.05)、淋巴结或远处转移(40.9%:100.0%,P<0.05)以及术后生存时间减少(50.0%:93.8%,P<0.05)有明显关系.结论 胆囊癌组织蛋白与胆囊良性组织存在明显的差异.膜联蛋白A3可能对胆囊癌的发生、发展有作用.     

胆囊癌组织蛋白质组研究及膜联蛋白A3表达的临床病理意义

目的 通过分离并鉴定胆囊癌和胆囊良性组织的差异表达蛋白质,以发现可能用于早期诊断或治疗的胆囊癌肿瘤标志物.方法 提取人胆囊癌和胆囊良性组织(各6例)的总蛋白质,用双向电泳分离蛋白并进行比较.选择在胆囊癌组织中明显差异表达的蛋白点,行质谱分析.采用免疫组织化学EliVision法,对50例原发性胆囊癌38例慢性胆囊炎组织中膜联蛋白A3表达进行检测,分析胆囊癌中膜联蛋白A3的表达状况及其与胆囊癌临床病理指标和预后的关系.结果 获得了分辨率和重复性均很好的凝胶蛋白图谱.对筛选出的在胆囊癌组织中明显差异表达的46个蛋白点,共有17种蛋白质被成功鉴定,其中在胆囊癌组织中高表达9个,低表达8个.膜联蛋白A3在胆囊癌组织中表达的阳性率明显高于慢性胆囊炎组织,差异有统计学意义(74.0%:21.1%,P<0.01),其表达水平与胆囊癌患者年龄、性别及组织学类型等因素均无明显关系(P>0.05),但高表达与胆囊癌的低分级(40.0%:82.5%,P<0.05)、淋巴结或远处转移(40.9%:100.0%,P<0.05)以及术后生存时间减少(50.0%:93.8%,P<0.05)有明显关系.结论 胆囊癌组织蛋白与胆囊良性组织存在明显的差异.膜联蛋白A3可能对胆囊癌的发生、发展有作用.     

甲状腺乳头状癌的蛋白质组学研究

目的 对甲状腺乳头状癌(PTC)的蛋白质组进行研究,并与正常组织对比,寻找其中差异显著的蛋白.方法 应用蛋白质组学技术,提取10例PTC与周围正常甲状腺组织(NT)的蛋白质样品进行双向电泳分离及对比,应用Image Master软件对电泳图谱进行分析;将选出的差异性蛋白质点进行质谱鉴定和数据库查询.结果 得到了PTC及NT的双向电泳图谱;通过软件分析、对比,从中初步选取4个差异蛋白质点进行质谱鉴定,确认为4种相应的蛋白质:其中脂皮质蛋白(annexinⅠ)、peroxiredoxin Ⅰ、线粒体顺乌头酸酶(mitochondrial aconitase)在PTC中表达上升,碳酸酐酶Ⅰ(carbonic anhydrase Ⅰ)在PTC中表达下降.结论 蛋白质组学为PTC的研究提供了新的发展方向,在寻找肿瘤的特异性蛋白标记物、进一步探究肿瘤的发病机制以及寻找治疗肿瘤的分子靶点等方面发挥作用.     

原核表达的PD-1与PD-L1融合蛋白相互作用分析

目的 分析经原核表达纯化的PD-1和PD-L1融合蛋白分子间相互作用力及其生物学活性.方法 PD-1蛋白经过预浓缩后,用氨耦联的原理固定于CM5芯片表面,用HBS-EP缓冲液梯度稀释PD-L1蛋白,以20μl/min流速注射到耦联PD-1的传感芯片通道上,结合3 min,解离15 min;观察两者结合情况并用BIA Evaluation软件4进行分析.结果 PD-1在缓冲液的pH值为4.5、浓度为40μg/ml的状态下能稳定耦联于CM5芯片表面,RU值约为3300;稀释度为200 mmol/ml的PD-L1与PD-1能较好地结合,RU值为150,亲和常数为K_D=3.5×10~(-6).结论 经原核表达纯化的PD-1与PD-L1融合蛋白具有较强的特异性亲和力及良好的生物学活性,为下一步研究的开展打下基础.     

恶性胶质瘤细胞株的蛋白质组差异表达分析

目的 寻找和鉴定恶性胶质瘤细胞株的蛋白质组差异蛋白表达谱,为以其为基础的相关研究提供必要参考.方法 提取3个恶性胶质瘤细胞株CHG-5、TJ899和TJ905的总蛋白,等比例混匀后行双向电泳,正常胶质细胞为平行对照,筛选和鉴定差异蛋白质点,并就其中部分蛋白质进行免疫细胞化学和实体瘤免疫组织化学验证.结果 共筛选出13个差异蛋白质点,其中10个得到成功鉴定,它们主要分属于细胞骨架蛋白、代谢相关蛋白、肿瘤细胞迁移,以及应激与炎性反应相关蛋白;免疫细胞化学和实体瘤免疫组织化学检测结果与蛋白质组技术结果相一致.结论 恶性胶质瘤细胞株与正常胶质细胞比较具有明显的多个差异蛋白表达,它们可能共同参与脑胶质细胞的瘤变过程.     

应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白

目的: 应用酵母双杂交技术筛选小鼠巨噬细胞中与核因子κB受体激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白,以探寻RANKL/RANK系统中介导破骨细胞形成的RANK下游新信号转导蛋白。方法: 应用GAL4酵母双杂交系统3,构建仅包含编码新基序⁵³⁵IVVY⁵³⁸ 的一小段RANK的cDNA片段为诱饵质粒pGBKT7-IVVY,并与巨噬细胞cDNA文库质粒pGADT7-library共转化AH109酵母,筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白,通过回复性杂交实验验证其可靠性,并对阳性克隆进行测序和基因同源性分析。结果: 筛选出4个可能与IVVY基序有相互作用的蛋白,包括Ring1和YY1结合蛋白(RYBP)、ATP结合盒、E2F转录因子和热休克蛋白8,其中表达RYBP的阳性克隆出现频率高、速度快。结论: 应用酵母双杂交技术成功地筛选出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白,其中RYBP可能性最大。     

重组人抑癌相关蛋白核苷二磷酸激酶A的原核表达

目的:为提高表达量,简化纯化工艺,获得可用于临床研究的重组人NDPK-A蛋白,构建带有6×His纯化标签的原核表达载体,优化表达条件获得产物高表达并鉴定产物活性。方法:将抑癌基因nm23-H1 从质粒pBVNMH1中亚克隆于带有纯化标签的表达载体pQE40中;梯度变化表达条件获得产物高表达;镍离子螯合层析柱纯化目的蛋白;Western blot鉴定产物的免疫原性;HPLC测定产物的激酶活性;鸡胚尿囊膜试验鉴定产物抑制血管新生的生物活性。结果:pQE-40中亚克隆的nm23-H1 序列无误;目的蛋白最高表达量可达49.6%;纯化的表达产物能与天然NDPK－A的多克隆抗体特异结合;酶比活为472U/mg;具有抑制鸡胚尿囊膜血管新生的活性。结论:表达质粒pQE-nm23H 1 能高效表达重组人NDPK-A,纯化工艺简便,产物活性与天然NDPK-A无异。     

胰腺癌中MAT1蛋白的表达与其临床病理特征的关系

目的：研究MAT1蛋白在胰腺癌中的表达及其与胰腺癌多项临床病理特征的关系。 方法： 使用免疫组化首先分析了70例外科手术切除的胰腺癌标本、10例胰腺良性肿瘤、14例慢性胰腺炎和10例尸解来源正常胰腺组织标本中的MAT1蛋白表达。然后比较MAT1蛋白的表达与胰腺癌患者多项临床病理特征的关系，包括患者年龄、性别、癌灶部位、癌灶大小、组织学类型、分化程度和TNM分期。 结果： MAT1蛋白主要表达于胰腺癌癌细胞，也可见于成纤维细胞，棕黄色染色局限于细胞浆和核膜。75.7％（53/70）的胰腺癌组织中可见MAT1蛋白的表达，而正常对照标本中则未表达或仅微弱表达MAT1。MAT1在4种组织中的表达程度有显著差异（P<0.01）。其中MAT1在胰腺癌中的表达显著高于其它3种组织。进一步分析发现，MAT1蛋白表达与胰腺癌患者的TNM分期呈显著相关（P<0.05），但与其它临床病理特征无关。 结论： 在胰腺癌中表达明显上调的MAT1蛋白可能与胰腺癌的发生相关，并且MAT1蛋白是评估胰腺癌患者预后的一个有用的肿瘤标志物。     

β-连环蛋白、细胞周期蛋白D1和c-myc表达与胰腺癌发生及生物学行为的关系

目的 研究β-连环蛋白(β-cat)的异常表达、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和 c-myc的高表达与胰腺癌发生、增殖、浸润、转移和预后的关系。方法 应用免疫组织化学PicTure~(TM)二步法,检测47例胰腺癌组织、12例胰腺导管上皮内肿瘤(上皮中度不典型增生)和10例正常胰腺组织中β-cat、cyclin D1和c-myc的表达。同时检测胰腺癌增殖细胞核抗原(PCNA),作为胰腺癌增殖状态的指标。结果 β-cat在10例正常胰腺组织均呈正常表达,而cyclin D1和c-myc均呈阴性。三者在胰腺导管上皮内肿瘤和胰腺癌中的表达率差异无显著性[分别为6/12和68.1％(3/47)、6/12和74.5％(35/47)、5/12和70.2％(33/47),均P>0.05]。β-cat异常表达率与胰腺癌的转移和1年生存率显著相关(均P<0.05),而与胰腺癌大小、分化程度、增殖活性及浸润无关(均P>0.05)。cyclin D1的表达率与胰腺癌的增殖和分化程度有关(均P0.05)。c-myc的表达率与胰腺癌的大小、分化程度、浸润、转移和1年生存率无关(均P>0.05),而与胰腺癌组织的增殖活性密切有关(P<0.05)。β-cat异常表达与cyclin D1和c-myc的高表达在胰腺导管上皮内肿瘤和胰腺癌中均有显著的正相关性(均P<0.05,r=1.000、0.845、0.437、0.452)。结论 β-cat     

胰腺癌转移相关基因C14orf166的真核表达及其蛋白相互作用的蛋白质组学筛选

目的旨在对胰腺癌转移相关基因C14orf166进行真核重组表达,并在此基础上结合蛋白质组学方法初步筛选其相互作用蛋白,为进一步研究C14orf166在肿瘤转移中的作用提供研究基础。方法构建人C14orf166的带双标签的真核表达载体pcDNA3.1-Flag-C14orf166-His,通过脂质体将其转染至人胚肾293T细胞。采用Ni-agrose进行His标签蛋白的pull-down纯化,分离C14orf166的蛋白结合复合体,对蛋白混合物进行SDS-PAGE分析,选择差异条带,进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定。结果在293T细胞中重组表达了C14orf166蛋白,对C14orf166蛋白复合体进行分离鉴定后,筛选出RS8、EFCB9和NRAP3个可能与C14orf166相互作用的蛋白。结论基因重组表达结合pull-down和蛋白质组学方法可以发现新的相互作用蛋白,为进一步了解C14orf166在肿瘤发病机制中的作用提供了新的线索。     

草酸铂处理人结肠癌细胞蛋白质组分析

目的 分析草酸铂处理后人结肠癌Lovo细胞系的差异表达蛋白,从蛋白质组学角度探讨草酸铂的作用机制.方法 Lovo细胞系按完全随机法分2组,即实验组(含草酸铂培养液培养)和对照组(无草酸铂培养液培养).培养后收集细胞依次进行二维电泳分离并选择差异点,采用质谱分析鉴定差异蛋白.结果 两组双向电泳图谱分辨率高、重复性好,匹配率分别为80.16%(812/1013)和81.19%(829/1021).获取重复差异点22个,质谱分析其中10个,成功鉴定出与结肠癌相关6种蛋白:β2微球蛋白、剪接因子SFRS3、尿嘧啶DNA糖基化酶表达上调;60S核糖体蛋白P2、甘油醛3磷酸脱氢酶、鸟苷酸结合蛋白β2多肽样1表达下调.结论 草酸铂作用人结肠癌Lovo细胞系后有多种差异蛋白表达,其与免疫增强、pre-mRNA转录修饰、DNA损伤修复、调控蛋白翻译及翻译后加工、能量代谢及信号传导通路等有关.     

增生性瘢痕与正常皮肤的蛋白质组学研究

目的 比较增生性瘢痕与正常皮肤组织的蛋白质组表达差异,筛选出增生性瘢痕的特异蛋白质.方法 以中山大学附属第一医院烧伤外科2010年1月至5月8例增生性瘢痕患者的增生性瘢痕组织和3例整形外科患者正常躯干皮肤为研究对象,运用蛋白质组学技术、双向凝胶电泳对比分析增生性瘢痕组织和正常皮肤组织中蛋白表达差异,选择差异蛋白点进行MALDI - TOF/TOF质谱分析和生物学信息分析.结果 获得重复性较好的双向电泳荧光染色图谱,增生性瘢痕和正常皮肤组织凝胶电泳图谱中平均蛋白点分别为2975和3053,对其中表达差异超过4倍的蛋白点进行质谱分析和数据库检索,共鉴定出24种蛋白质,其中上调蛋白有11种,下调蛋白有13种.结论 成功地建立增生性瘢痕的双向电泳荧光染色图谱,鉴定出增生性瘢痕组织与正常皮肤组织间的差异蛋白质表达.     

埃兹蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义

 目的 探讨埃兹蛋白（ezrin）在胃癌组织中的表达及其临床意义。 方法 随机选择手术切除并经组织病理学检查确诊的胃癌组织标本 40 份和癌旁正常组织标本 30 份，应用免疫组织化学 SP 法检测 ezrin 的表达，并分析 ezrin 表达与胃癌患者年龄、性别、肿瘤直径、浸润和分化程度、有无淋巴结转移等临床病理因素的相关关系。 结果 ezrin 阳性表达率在胃癌组织为 55%（22/40），癌旁正常组织为 0，两者间差异有统计学意义（χ² = 18.07，P < 0.05）；在高、中、低分化胃癌组织分别为 30%（3/10）、53%（10/19）、82%（9/11）（χ² = 5.760，P < 0.05）；在有、无淋巴结转移胃癌组织分别为 72.7%（16/22）、33.3%（6/18） （χ² = 6.208，P < 0.05）。ezrin 表达与胃癌患者年龄、性别、肿块大小及浸润程度无明显相关（P > 0.05）。 结论 ezrin 在胃癌组织中呈高表达，并与胃癌的淋巴结转移及恶性程度呈负相关，是反映胃癌生物学行为的有价值 指标。     

上皮钙依赖粘附素相关分子在乳腺浸润性小叶癌和导管癌中的表达及意义

目的 探讨上皮钙依赖粘附素相关分子α-、β-、γ-catenin在乳腺浸润性小叶癌（ILC）和浸润性导管癌（IDC）中的表达及其意义。方法 采用免疫组织化学LSAB法检测了19例ILC和32例IDC组织中α-、β-、γ-catenin的表达,并根据阳性癌细胞占肿瘤细胞的比例进行半定量化分析和统计学x^2检验。结果 α-、β-、γ-catenin在19例ILC中表达缺失和明显减少的分别为15例（78.9%),10例（52.6%)和16例（84.2%),而在32例IDC癌组织中的表达缺失和明显减少为24例（75.0%),14例（43.8%)和26例(81.3%)例。另外,这3种蛋白在浸润性癌组织中表达强度弱于原位癌灶的表达强度。α-catenin和β-catenin在乳腺浸润性癌中的表达具有明显的正相关性,未发现α-、β-、γ-catenin在乳腺浸润性癌中的表达与有无伴有淋巴结转移病例之间的关系有统计学意义。结论 α-、β-、γ-catenin在乳腺ILC和IDC中表达均为明显缺失和减少,说明这些粘附分子在乳腺浸润性癌发生中确实丧失了其正常的细胞粘附功能。     

胃癌及其癌前病变中细胞凋亡及其调控基因的表达

目的:通过观察胃癌及其癌前病变中细胞凋亡及其调控基因p53、bcl-2、c-myc的表达,探讨其在胃癌恶性转化进程中的作用。方法:利用DNA末端标记技术(TdT-mediateddUTP-biotinnickendlabeling,TUNEL法)和免疫组织化学(streptavidin/peroxidase,S-P法),原位观察了46例胃癌、20例癌前病变、24例正常粘膜中的凋亡细胞和p53、bcl-2、c-myc的表达。结果:癌前病变和胃癌中凋亡指数显著高于正常粘膜(P＜0.01),癌前病变组高于胃癌组(P＜0.01)。p53、bcl-2、c-myc蛋白在胃癌中阳性率分别为60.9%、67.4%、73.2%,均高于正常粘膜组(P＜0.01);在癌前病变中3种蛋白阳性表达率分别为40%、95%、58.8%(P＜0.01)。胃癌中p53、bcl-2蛋白阳性细胞凋亡指数分别低于阴性组(P＜0.05),c-myc蛋白阳性组细胞凋亡指数高于阴性组(P＜0.01)。结论:细胞凋亡调控异常在胃癌发生中可能起重要作用。p53、bcl-2蛋白分别抑制细胞凋亡,c-myc蛋白在胃癌中促进细胞凋亡。     

替米沙坦干预心房颤动模型猪的右心房心肌靶蛋白鉴定

目的 研究替米沙坦(TMST)对实验性心房颤动(AF)模型猪的影响,分离并鉴定右心房组织差异表达蛋白.方法 健康家猪18只完全随机法分为3组,每组6只:正常对照(NC)组右心房植入电极不起搏,房颤(AF)组右心房植入电极并快速起搏,替米沙坦(TMST)组右心房植入电极快速起搏并给予TMST干预.实验前及2周后测量各组实验猪心室收缩末期左、右心房面积(LAESA、RAESA).实验结束时进行右房组织Masson染色观察,双向蛋白质电泳分离各组右心房心肌差异表达蛋白质,采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱技术鉴定靶蛋白.结果 AF组采用快速右心房起搏成功建立AF猪模型.与AF组比较,TMST干预可以减少AF诱发率和胶原纤维表达,并使LAESA和RAESA缩小[LAESA:(630.6±10.9)mm2比(744.3±29.9)mm2;RAESA:(553.4±13.7)mm2比(677.9±26.3)mm2,均P＜0.05].双向蛋白质电泳及质谱分析鉴定出翻译起始因子5A、热休克蛋白27、NADH脱氢酶铁硫蛋白8在TMST组表达减少.结论 翻译起始因子5A、热休克蛋白27、NADH脱氢酶铁硫蛋白8可能是与TMST减低实验猪AF诱发率、抑制心房重构相关的靶蛋白.